Name: Registrazione elettrofisiologica dellattività del sistema nervoso centrale di terza-Instar Drosophila Melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Scopri la registrazione elettrofisiologica del sistema nervoso centrale di Drosophila melanogaster di terzo stadio. Questo metodo semplice e riproducibile permette di studiare l'attività neuronale e testare agenti farmacologici per la ricerca in tossicologia degli insetti.

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Vorremmo ringraziare ms. Rui Chen per la dissezione e immagini di Drosophila CNS mostrato nelle figure.

1. attrezzature e materiali
<ol><li>Preparare i componenti necessari (elencati in Tabella materiali) dell'impianto di perforazione elettrofisiologia per eseguire registrazioni di aspirazione elettrodo di Drosophila CNS. Nota: Prima della sperimentazione, è necessario costruire alloggiamenti per dissezione della drosofila CNS e da utilizzarsi per la balneazione dei gangli in soluzione salina durante le registrazioni. Seguito viene fornito un profilo graduale di costruzione a camera.</li>
	<li>Preparare la camera larvale.<ol>
<li>Fate sciogliere la cera nera con un piatto caldo.</li>
		<li>Versare 2 mL di cera fusa in una camera che ha un volume massimo di 2-2,5 mL.</li>
		<li>Lasciare raffreddare la cera e indurire per circa 2 h.</li>
		<li>Utilizzare una lama di rasoio per ritagliarsi un buco nella cera indurita che conterrà un volume di 500 µ l, che ha una superficie di circa 0,5 cm2 e una profondità di circa 0,25 cm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. attrezzature e Software di configurazione
Nota: L'impostazione della registrazione extracellulare è brevemente descritto di seguito.
<ol><li>Preparare attrezzature per la dissezione e la registrazione.<ol>
<li>Posizionare la preparazione dei tessuti, microscopio, aspirazione elettrodo micromanipolatori, sorgente luminosa all'interno della gabbia di Faraday per ridurre rumore ed eliminare campi elettrici estranei (Figura 2).</li>
		<li>Collegare (preferibilmente saldare) terra e fili positivi sul schermato morsetti a coccodrillo che verranno connesso al titolare della vasca e microelettrodo, rispettivamente. Nota: Fili saldati ed esposti possono essere coperto con foglio di alluminio per ridurre il rumore.</li>
		<li>Collegare la terra e fili positivi all'ingresso 1 dell'amplificatore differenziale AC/DC.
</li>
		<li>Collegare il sistema di acquisizione dati all'amplificatore differenziale AC/DC collegando un cavo Bayonet Neill-Concelman (BNC) da ingresso 1 del sistema di acquisizione dati per l'uscita del canale 1 dell'amplificatore. Nota: Si consiglia di incorporare un eliminatore di rumore 50/60 Hz tra il software di acquisizione dati e l'amplificatore. L'utilizzo di un connettore di BNC T è richiesto.</li>
		<li>Se lo si desidera, è possibile includere un monitor audio nell'installazione collegando ingresso 1 del monitor audio all'ingresso 1 del software di acquisizione dati.</li>
		<li>Riempire la siringa da 10 mL con soluzione fisiologica e collegarlo alla presa di pressione della pinza porta elettrodo. Nota: Garantire l'esistenza senza bolle d'aria tra la siringa, il pellet di Ag/AgCl e l'apertura dell'elettrodo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare il software per la registrazione e la dissezione. Nota: Il contorno dei metodi per l'installazione del software è basato sul software di acquisizione/analisi elencati nella Tabella materiali che digitalizzare l'uscita elettrica raw e convertire i dati per frequenza di spike. Tuttavia, altri software può essere utilizzato e più conversioni di registrazione possono essere utilizzate.<ol>
<li>Aprire il software di acquisizione/analisi.</li>
		<li>Fare clic su "setup" dalla barra degli strumenti principale e selezionare "Impostazioni canale", che apriranno una finestra di dialogo.</li>
		<li>Ridurre il numero di canali totali a tre.</li>
		<li>Per il canale 1, selezionare un intervallo di 100 mV.</li>
		<li>Canale 2, fare clic sulla scheda "calcolo" che si aprirà un menu a discesa. Selezionare "misure cicliche", che apriranno una seconda finestra di dialogo.</li>
		<li>Selezionare il canale 1 come origine. Su misura dal menu a discesa, selezionare quindi picco di unità in occasione di eventi. Infine, nell'area impostazioni di rilevamento, dal menu a discesa selezionare soglia semplice.</li>
		<li>Per convertire l'attività elettrica in una trama di frequenza espressa in hertz, il canale 3rd deve essere impostato in modalità aritmetiche: nella finestra di input, digitare in "1000*smoothsec(ch2,2)". Selezionare, come le unità hertz dal menu a discesa. Nota: Le registrazioni di successo possono essere eseguite con configurazioni multiple di registrazione diversi, ma "Unità spike a eventi e semplice soglia" è probabilmente il modo più semplice, poiché esso consente la regolazione della soglia sopra attività in background per ogni individuo registrazione. Registrazioni con l'impostazione del "Custom-sorgente di ingresso" aumentano la riproducibilità dei dati supponendo che l'attività in background non è diverso tra le registrazioni.</li>
		<li>Chiudere le finestre di dialogo per tornare alla schermata principale. L'asse y deve essere espressa in Hz e l'asse x in tempo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. sezionare e preparare il larvale della drosofila CNS
Nota: Metodi per la dissezione larvale CNS sono chiaramente illustrati nella Hafer e Schedl27, ma questi metodi precedentemente pubblicati riducano la lunghezza dei neuroni discendente che sono importanti per misurare la frequenza di picco. Qui, un altro metodo è descritto per asportare il CNS larvale che mantiene a lungo, neuroni intatti discendenti.
<ol><li>Preparazione soluzione fisiologica.<ol>
<li>Preparare la dissezione e la registrazione salino al seguente nel mM28: 157 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl2, 4 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acido (HEPES); titolare pH a 7,25.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sezionare il larvale della drosofila CNS.<ol>
<li>Identificare ed estrarre una terza-instar errante Drosophila melanogaster dal flacone di coltura e posto in 200 µ l di soluzione fisiologica (Figura 3A).</li>
		<li>Afferrare i ganci di bocca con una coppia di una pinzetta e afferrare l'addome della larva con un secondo paio di pinze (Figura 3B). Nota: Non applicare troppa pressione all'addome, poiché ciò può comportare lacerazione dello strato cuticolare sottile della larva.</li>
		<li>Tirare delicatamente la bocca ganci e addome in direzioni diverse per separare l'estremità caudale della larva dalla regione della testa ed esporre i visceri di larva (Figura 3). Nota: Il CNS sarà essere intrecciato con la trachea e l'apparato digerente. Non tagliare il CNS lontano da qualsiasi tessuto per evitare di tagliare i nervi periferici discendenti.</li>
		<li>Prendere in giro il CNS fuori il tratto digestivo e della trachea con forcipe (Figura 3D).</li>
		<li>Se necessario, è possibile interrompere la barriera ematoencefalica transecting manualmente il CNS posteriore ai lobi cerebrali con forbici di primavera di Allerød. Nota: Questo dovrebbe essere fatto basato sulle proprietà fisico-chimiche del prodotto chimico utilizzato. La linea rossa in Figura 4A è il punto di transection suggerito e il CNS transected con tronchi periferici del nervo intatti discendente, mostrato in Figura 4B. Il CNS transected è pronto per la sperimentazione dopo il completamento del punto 3.2.5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. registrazione extracellulare di Drosophila CNS.
<ol><li>Preparare il sistema nervoso centrale per la registrazione.<ol>
<li>Tirare un elettrodo di pipetta di vetro da tubi capillari in vetro borosilicato ad una resistenza di 5-15 mΩ.</li>
		<li>Inserire il CNS transected nella camera di cera che contiene 200 µ l di soluzione fisiologica. Bloccare un pin dell'insetto non rivestito con il morsetto a coccodrillo saldato il filo di terra e inserire il perno nel saline per completare il circuito.</li>
		<li>Utilizzando i micromanipolatori, orientare l'elettrodo all'estremità caudale del SNC transected. Eliminare la registrazione di rumore di fondo regolando il livello di soglia del software di acquisizione/analisi prima di contattare i tronchi periferici del nervo.</li>
		<li>Disegnare qualsiasi conveniente nervi periferici in aspirazione elettrodo da esercitando una leggera pressione negativa sulla siringa. Nota: La linea di base frequenza di infornamento è correlato al numero di neuroni attirata l'elettrodo dove più neuroni spesso causare aumento della resistenza dell'elettrodo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Iniziare la registrazione extracellulare del sistema nervoso centrale discendente attività del nervo.<ol>
<li>Avviare la registrazione del software di acquisizione dati e monitorare la frequenza di infornamento della linea di base. Consentire il tasso di infornamento equilibrare per 5 minuti prima di raccogliere dati sulla frequenza di infornamento della linea di base.</li>
		<li>Scartare la preparazione e la registrazione se il modello di infornamento di trattamento di controllo non è un modello scoppio simile a quella mostrata in Figura 5A. Nota: Modello alterato di infornamento suggerisce attività anormale o instabile del generatore modello centrale, che possa alterare la funzione neurale.</li>
		<li>Dopo 5 min, aggiungere 200 µ l di soluzione fisiologica + veicolo per portare il volume totale della camera a 400 µ l per iniziare la registrazione controllo tassi di infornamento.</li>
		<li>Dopo la linea di base è stato stabilito (3-5 min), prelevare 200 µ l di soluzione fisiologica e aggiungere 200 µ l dell'agente sperimentale solubilizzato in soluzione salina. Nota: Solfossido dimetilico (DMSO) è il solvente raccomandato per composti lipofilici e non deve superare 0,1% v/v.</li>
		<li>Applicare le concentrazioni nella droga in modo seriale (basso ad alte concentrazioni) e registrare ogni concentrazione per un periodo selezionato di tempo (determinato dallo sperimentatore basato sulle proprietà chimiche del farmaco29). Etichetta questo punto di tempo di applicazione della droga del software di acquisizione/analisi includendo un commento che include il farmaco e la concentrazione finale. Nota: Attività del SNC di infornamento diminuirà di circa il 10-20% dopo 30-50 min dopo la dissezione e pertanto, appropriati controlli non trattati devono essere eseguiti, e trattamenti farmacologici non dovrebbero superare questo periodo di tempo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analizzare i dati. Nota: Analisi Multiple possono essere eseguite sui dati raccolti, quali i cambiamenti nel potenziale di azione raffiche29, ampiezza della forma d'onda di picco e corso di tempo e determinazione a spillo media frequenze dopo droga trattamento26,30 , 31 , 32. il più comune consiste nel determinare l'influenza di un farmaco ha per le frequenze di picco medio in un determinato periodo di tempo, che è descritto di seguito.<ol>
<li>Tabuli spike medie frequenze selezionando l'intera regione di interesse (cioè, il trattamento farmacologico, periodo di tempo) e determinare le frequenze di picco media automaticamente attraverso il "Datapad" situato sulla barra degli strumenti principale di acquisizione/analisi software.</li>
		<li>Determinare la frequenza di picco media dello SNC dopo trattamento farmacologico per la frequenza di picco medio di controllo del veicolo (linea di base). Calcolare la variazione percentuale del tasso di infornamento dopo trattamento farmacologico con la formula: (trattati frequenza frequenza/Baseline) × 100.</li>
		<li>Utilizzare l'infornamento di frequenze o per cento di picco media di controllo per ciascuna concentrazione per costruire una curva di risposta di concentrazione con standard grafici software.</li>
		<li>Effettuare analisi statistiche (ad es., spaiati t-test) per determinare la rilevanza tra punti di tempo, le concentrazioni o trattamenti farmacologici. Nota: Esistono due metodi principali per la generazione e l'analisi di curve concentrazione-risposta. Il primo metodo è una concentrazione per preparazione individuale. Qui, il tasso di picco della concentrazione singola è normalizzato a tasso di punta della linea di base per ogni preparazione. I benefici sono ridotti malandato della preparazione dovuto ridotto tempo di registrazione, mentre sono aumentati i trabocchetti dissezione tempo perché questo metodo sarà composto da 5-7 singole preparazioni di CNS per concentrazione e barre di errore più grande sui dati medi impostare. Il secondo metodo è più concentrazioni per preparazione individuale. Qui, il tasso di spike per ciascuna delle 3-5 concentrazioni vengono normalizzati per lo stesso tasso di punta della linea di base. I vantaggi sono meno tempo di dissezione e minore variabilità tra replica per le concentrazioni di farmaco, mentre le insidie sono l'esigenza di un impatto di droga e sconosciuto ad azione rapida di precedenti trattamenti di concentrazione di droga sui successivi trattamenti chimici.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Bloomquist, J. R., Roush, R. T., ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+neuronal+sensitivity+to+dieldrin+and+picrotoxinin+in+a+cyclodiene-resistant+strain+of+Drosophila+melanogaster+%28Meigen%29%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Insect+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Reduced neuronal sensitivity to dieldrin and picrotoxinin in a cyclodiene-resistant strain of Drosophila melanogaster (Meigen).</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 19 (1), 17-25 (1992).</li>
<li>Mutunga, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotoxicology+of+bis%28n%29-tacrines+on+Blattella+germanica+and+Drosophila+melanogaster+acetylcholinesterase%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Insect+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Neurotoxicology of bis(n)-tacrines on Blattella germanica and Drosophila melanogaster acetylcholinesterase.</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 83 (4), 180-194 (2013).</li>
<li>Chen, R., Swale, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inwardly+rectifying+potassium+%28Kir%29+channels+represent+a+critical+ion+conductance+pathway+in+the+nervous+systems+of+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Inwardly rectifying potassium (Kir) channels represent a critical ion conductance pathway in the nervous systems of insects.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1617(2018).</li>
<li>Francis, S. A., Taylor-Wells, J., Gross, A. D., Bloomquist, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+and+physiological+actions+of+carbonic+anhydrase+inhibitors+to+Aedes+aegypti+and+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">Toxicity and physiological actions of carbonic anhydrase inhibitors to Aedes aegypti and Drosophila melanogaster.</a> Insects. 8 (1), 2(2016).</li>
<li>Swale, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitor+profile+of+bis%28n%29-tacrines+and+N-methylcarbamates+on+acetylcholinesterase+from+Rhipicephalus+%28Boophilus%29+microplus+and+Phlebotomus+papatasi%5BTitle%5D)+AND+%22Pesticide+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Inhibitor profile of bis(n)-tacrines and N-methylcarbamates on acetylcholinesterase from Rhipicephalus (Boophilus) microplus and Phlebotomus papatasi.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 106 (3), 85-92 (2013).</li>
<li>Corbel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+inhibition+of+cholinesterases+in+insect+and+mammalian+nervous+systems+by+the+insect+repellent+deet%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Evidence for inhibition of cholinesterases in insect and mammalian nervous systems by the insect repellent deet.</a> BMC Biology. 7, 47(2009).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

I dettagli forniti nel video associato e testo hanno fornito passaggi chiave al fine di registrare l'attività e spike scaricano frequenza di Drosophila CNS ex vivo. L'efficacia di dissezione è l'aspetto più critico del metodo perché breve o pochi neuroni discendenti ridurrà la linea di base tasso che si tradurrà in grandi scostamenti tra repliche di infornamento. Tuttavia, una volta che la tecnica di dissezione è stata masterizzata, i dati raccolti con questa analisi sono altamente riproducibili e modif...

L'obiettivo generale di questo approccio è quello di consentire ai ricercatori di misurare rapidamente l'electrogenesis del sistema nervoso centrale (CNS) nell'insetto modello, Drosophila melanogaster. Questo metodo è affidabile, veloce e conveniente per eseguire esperimenti fisiologici e tossicologici. Lo SNC è essenziale per la vita e di conseguenza, le vie fisiologiche critiche per la corretta funzione neurale sono stati esplorati estesamente nel tentativo di comprendere o modificare la funzione neurale. Caratterizzazione delle vie di segnalazione all'interno del SNC dell'artropodo ha permesso la scoperta di diverse classi di chimiche di insetticidi che interrompono la funzione neurale invertebrati marini per indurre la mortalità limitando le conseguenze fuori bersaglio. Così, la capacità di misurare l'attività neurale degli insetti è di notevole interesse nel campo della fisiologia e tossicologia degli insetti poiché il sistema nervoso è il tessuto dell'obiettivo della maggioranza degli insetticidi distribuito1. Ancora, ha continuato la crescita della conoscenza fondamentale ed applicata per quanto riguarda il sistema nervoso degli insetti richiede avanzate tecniche neurofisiologiche che sono limitate nella fattibilità, poiché le tecniche attuali sono lavoro intensivo e richiedono una spesa elevata, insetto linee cellulari neurali sono limitate, e/o di accesso limitato per le sinapsi centrali della maggior parte degli artropodi. Attualmente, la caratterizzazione della maggior parte delle proteine neurali dell'insetto richiede l'obiettivo di essere clonato e heterologously espresse per successive drug discovery e registrazioni elettrofisiologiche, come è stato descritto per i canali di potassio insetto raddrizzatore2 , insetto rianodina recettore3, zanzara tensione-sensibili K+ canali4e altri. Per attenuare il requisito per l'espressione eterologa e il potenziale di espressione funzionale basso, Bloomquist e colleghi mirati a indurre un fenotipo neuronale in Spodoptera frugiperda (Sf21) cellule coltivate come un nuovo metodo per insetticida scoperta5,6. Questi metodi forniscono un valido approccio per lo sviluppo della nuova chimica, ma creano spesso un collo di bottiglia insormontabile per la caratterizzazione degli agenti farmacologici, identificazione dei meccanismi di resistenza agli insetticidi e caratterizzazione dei principi fisiologici fondamentali. Qui, descriviamo un metodo di ex vivo che consente la registrazione dell'attività elettrica da un insetto di modello che ha malleabile genetica7,8,9 e modelli di nota espressione di neurale complessi10,11,12 per consentire la caratterizzazione dei meccanismi di resistenza a livello del nervo, la modalità d'azione dei farmaci di nuova concezione e altri studi tossicologici.
Moscerino della frutta, d. melanogaster, è un organismo modello comune per la definizione di sistemi neurali insetti o insetticida meccanismo d'azione ed è stato stabilito come organismo modello particolarmente adatto per lo studio di tossicologici13, farmacologici14 ,15, neurofisiologici16e patofisiologici17,18,19,20 processi di vertebrati. Melanogaster è un insetto olometaboli che esegue la metamorfosi completa, tra cui una fase larvale e pupal prima di raggiungere la fase adulta riproduttiva. Durante tutto il processo di sviluppo, il sistema nervoso subisce rimodellamento significativo alle diverse fasi della vita, ma il CNS larvale sarà al centro di questa metodologia. Lo SNC larvale pienamente sviluppato è anatomicamente semplice con segmenti toracici ed addominali che si fondono e formano il ganglio ventrale, che rappresenta una matrice di neuromeric ripetute e quasi identica unità21,22. Decrescente di nervi motori provengono dall'estremità caudale dei gangli subesophageal e scendere a innervare i muscoli della parete del corpo e degli organi viscerali delle larve. Figura 1 descrive l'anatomia lorda del larvale della drosofila CNS.
La Drosophila emato - encefalica (BBB) si sviluppa alla fine dell'embriogenesi ed è formata da subperineurial cellule gliali (SPG)21. Le cellule SPG formano numerosi processi di filopodi-come stendere per stabilire un foglio contiguo, molto piatto, endoteliale-like che copre l'intero Drosophila CNS23. La Drosophila BBB ha somiglianze con i vertebrati BBB, che comprende preservare l'omeostasi del microambiente neurale controllando l'entrata di sostanze nutritive e xenobiotici nel CNS21. Questo è un prerequisito per affidabile trasmissione neurale e la funzione, ma la protezione del SNC di BBB limita la permeazione di droghe sintetiche, maggior parte dei peptidi e altri xenobiotici24,25, che introduce il potenziale problemi che caratterizzano le potenze di modulatori della piccolo-molecola. Il metodo utilizza un transection semplice per interrompere questa barriera e fornire accesso pronto farmacologico per la sinapsi centrali. La forza più grande della metodologia descritta è la semplicità, riproducibilità e relativamente alto-rendimento capacità inerente a questo sistema. Il protocollo è relativamente facile da padroneggiare, il programma di installazione richiede poco spazio, e solo un input finanziario iniziale è necessario che si riduce a reagenti e materiali di consumo. Inoltre, il metodo descritto è completamente modificabile per registrare l'attività di nervo centrale discendente della mosca domestica, Musca domestica26.

<table><tbody><tr><td>Drosophila melanogaster (ceppo OR)</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>2376</td><td></td></tr><tr><td>Tabella di isolamento dalle vibrazioni</td><td>Sistemi cinetici Sistemi cinetici</td> a gabbia di Faraday serie <td></td><td>9200</td></tr><tr><td></td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione su un braccio</td><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td>È possibile utilizzare più cannocchiali da scavo; il supporto del braccio è critico</td></tr><tr><td>AC/ Amplificatore differenziale CC</td><td>ADInstruments</td><td>AM3000H</td><td>Il modello 1700 può essere utilizzato al posto del monitor audio modello 3000</td></tr><tr><td></td><td>ADInstruments</td><td>AM3300</td><td></td></tr><tr><td>Hum Bug Noise Eliminator</td><td>A-M Systems</td><td>726300</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di acquisizione dati (PowerLab)</td><td>ADInstruments</td><td>PL3504</td><td>È possibile utilizzare più modelli PowerLab.</td></tr><tr><td>Lab Chart Pro Software</td><td>ADInstruments</td><td>N/A - Download</td><td></td>online</tr><tr><td>Luci a fibre ottiche</td><td>Edmund Optics</td><td>89-740</td><td>È possibile utilizzare diverse sorgenti luminose, ma le fibre ottiche sono le più adattabili</td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>World Precision Instruments</td><td>M325</td><td></td></tr><tr><td>Microelectrode Holder</td><td>World Precision Instruments</td><td>MEH715</td><td>Sono accettabili diversi modelli</td></tr><tr><td>Cavi BNC</td><td>World Precision Instruments</td><td>multipli in base alle dimensioni</td><td></td></tr><tr><td>Capillari in vetro</td><td>World Precision Instruments</td><td>PG52151-4</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per microelettrodi</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td>Può anche utilizzare Narashige PC-100</td></tr><tr><td>Black Wax</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>974228</td><td></td></tr><tr><td>Perni per insetti non rivestiti, misura #2</td><td>Bioquip</td><td>1208S2</td><td></td></tr><tr><td>Forcipe Fince</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla Vannas</td><td>Strumenti per la scienza</td><td>15000-03</td><td></td></tr></tbody></table>

registrazione elettrofisiologica dell'attività del sistema nervoso centrale di terza-instar drosophila melanogaster

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

La maggior parte degli insetticidi attualmente disponibili di destinazione il sistema nervoso e mutazioni genetiche delle proteine neurali invertebrati marini producono spesso conseguenze deleterie, eppure gli attuali metodi per la registrazione delle attività del sistema nervoso di un individuo animale è costoso e laborioso. Questa aspirazione elettrodo preparazione del terza-instar larvale sistema nervoso centrale di Drosophila melanogaster, è un sistema trattabile per testare gli effetti fisiologici di agenti neuroattivi, determinazione del ruolo fisiologico di vari neurale percorsi di attività del SNC, come pure l'influenza delle mutazioni genetiche alla funzione neurale. Questa preparazione ex vivo richiede solo moderato abilità e competenza elettrofisiologico di dissezione generare riproducibile registrazioni dell'attività neuronale degli insetti. Un'ampia varietà di modulatori chimici, compresi peptidi, quindi può essere applicata direttamente al sistema nervoso in soluzione con la soluzione fisiologica per misurare l'influenza sull'attività CNS. Tecnologie più ulteriormente, genetiche, come il sistema GAL4/UAS, possono essere applicati in modo indipendente o in tandem con gli agenti farmacologici per determinare il ruolo dei canali ionici specifici, trasportatori o recettori alla funzione CNS dell'artropodo. In questo contesto, i saggi descritti nel presente documento sono di notevole interesse per tossicologi di insetticida, insetto fisiologi e biologi inerente allo sviluppo, per cui d. melanogaster è un organismo modello stabilito. L'obiettivo del presente protocollo è di descrivere un metodo elettrofisiologico per consentire la misurazione della electrogenesis del sistema nervoso centrale nell'insetto modello, Drosophila melanogaster, che è utile per testare una diversità di scientifico ipotesi.

Attività spontanea dei nervi periferici discendenti derivanti dal sistema nervoso centrale Drosophila possono essere registrate utilizzando elettrodi aspirazione extracellulari con riproducibilità coerente. Attività spontanea di asportata e transected Drosophila CNS produce un modello ciclico di scoppio con s 1-2 di infornamento con circa 1 s di vicino attività quiescente. Per esempio, il CNS è vicino quiescente (1-2 Hz) per 0,5-1 s, seguita da una raffica (100-400 Hz) p...

Questo protocollo descrive un metodo per registrare l'attività elettrica discendente del sistema nervoso centrale Drosophila melanogaster per abilitare il costo-efficiente e conveniente test degli agenti farmacologici, mutazioni genetiche delle proteine neuronali, e/o il ruolo di inesplorate vie fisiologiche.

Registrazione elettrofisiologica dell'attività del sistema nervoso centrale di terza-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi della tossicologia degli insetti e della fisiologia degli insetti misurando l'elettrogenesi del sistema nervoso centrale Drosophila melanogaster. Ciò consente di testare una vasta gamma di ipotesi scientifiche e aiutare nella scoperta di nuove modalità d'azione insetticide. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un sistema semplice, riproducibile e relativamente ad alta produttività con un input finanziario minimo per studiare il sistema nervoso della Drosophila.Per iniziare, aprire il software di acquisizione/analisi. Fare clic su Imposta sulla barra degli strumenti principale e selezionare Impostazioni canale, che aprirà una finestra di dialogo. Ridurre il numero di canali totali a tre.Il canale uno registrerà il segnale grezzo dall'amplificatore con un intervallo di 100 millivolt. Il canale due verrà utilizzato per contare il numero di eventi dal canale uno che sono al di sopra di una determinata soglia. A tale proposito, fare clic sulla scheda Calcolo per aprire un menu a discesa per il canale due.Selezionate Misure cicliche (Cyclic Measurements), che aprirà una seconda finestra di dialogo. Selezionare il canale uno come origine. Quindi, nella misurazione del menu a discesa, selezionare Unit Spike at Events.Infine, nell'area delle impostazioni di rilevamento, scegliere Soglia semplice dal menu a discesa. Il livello di soglia viene immesso nella finestra di regolazione del rilevamento da impostare sopra il rumore di fondo. Per convertire l'attività elettrica in un plottaggio di velocità espresso in hertz, selezionate Aritmetica (Arithmetic) sul terzo canale.Nella nuova finestra, input 1000 volte smoothsec, parentesi canale due virgola due. Quindi, selezionare nel menu a discesa delle unità l'unità di frequenza hertz. Chiudere le finestre di dialogo per tornare alla schermata principale.L'asse y del canale tre dovrebbe essere espresso in hertz e l'asse x nel tempo. Sezionare il SNC larvale Drosophila identificando ed estraendo prima una Drosophila melanogaster vagante della terza instar dalla fiala di coltura e collocandolo in 200 microlitri di soluzione salina. Quindi, afferrare i ganci della bocca con un paio di forcep fini e afferrare l'addome del verme con un secondo paio di forcep, con pressione leggera, per evitare di strappare il sottile strato cuticolare.Tirare delicatamente i ganci della bocca e l'addome in diverse direzioni per separare l'estremità caudale del verme dalla regione della testa ed esporre i visceri del verme. Il SNC si intreccierà con la trachea e il tratto digestivo. Prendere in giro il SNC dal tratto digestivo e dalla trachea con le forcep.La dissezione del sistema nervoso centrale Drosophila dal verme è un passo fondamentale per il successo. I gangli sezionati devono essere intatti, senza danni significativi ai nervi motori discendenti. Un maggior numero di nervi motori attaccati ai gangli aumenterà le frequenze di fuoco di base.Se necessario, interrompere la barriera eto-encefalica trasmetta manualmente il SNC posteriore ai lobi cerebrali con le forbici a molla Vannas. La trasezione deve essere effettuata in base alle proprietà fisiochimiche della sostanza chimica utilizzata. La linea rossa è il punto di trasezione suggerito e il SNC trasetto con tronchi nervosi periferici discendenti intatti mostrati qui.Per iniziare, prima tirare l'elettrodo di pipetta di vetro dai capillari di vetro borosilicato a una resistenza da cinque a 15 megaohms. Inserire il SNC trasetto in una camera di cera contenente 200 microlitri di soluzione salina. Bloccare un perno insetto non rivestito con una clip di alligatore saldata al filo di terra e inserire il perno nella salina per completare il circuito.Utilizzando i micromanipolatori, orientare l'elettrodo verso l'estremità caudale del SNC trasetto. Eliminare il rumore di fondo regolando il livello di soglia nel software di acquisizione/analisi prima di collegare i tronchi nervosi periferici. Applicare una leggera pressione negativa sulla siringa per attirare i nervi periferici nell'elettrodo di aspirazione.Avviare la registrazione sul software di acquisizione dati e il tasso di attivazione di base per equilibrare per cinque minuti prima di raccogliere i dati del tasso di attivazione di base. Dopo cinque minuti, aggiungere 200 microlitri di soluzione salina e veicolo per portare il volume totale della camera a 400 microlitri per iniziare a registrare i tassi di cottura di controllo. Scartare la preparazione e la registrazione se il modello di cottura del trattamento di controllo non è simile all'esempio mostrato qui.Quando il basale è stato stabilito dopo tre o cinque minuti di registrazione, prelevare 200 microlitri di salina e aggiungere 200 microlitri dell'agente sperimentale solubilizzato in salina. Etichettare questo punto di tempo di applicazione del farmaco nel software di acquisizione / analisi includendo un commento che include il farmaco e la concentrazione finale. Qui è mostrata una traccia rappresentativa della scarica nervosa prima e dopo l'esposizione al DMSO.La freccia indica l'ora di applicazione. Si vede una risposta limitata al DMSO. L'aumento delle dosi di propoxur ha amplificato la frequenza di scarica del picco del SNC Drosophila trasetto in modo dipendente dalla concentrazione, mentre il GABA neurodepressivo ha ridotto la frequenza di scarica del picco in modo dipendente dalla concentrazione.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che si tratta di un esperimento ex vivo, e quindi le condizioni della soluzione salina, come pH e temperatura, sono fondamentali per l'attività prolungata della preparazione del sistema nervoso centrale. Allo stesso modo, la mancanza di attività elettrica estranea, un'efficace gabbia di Faraday e una riduzione del rumore di 60 hertz sono fondamentali per il successo di questo saggio. I dati raccolti attraverso questo saggio possono aiutare a identificare la modalità specifica di azione degli insetticidi.È possibile eseguire la successiva convalida di questi dati attraverso altri metodi come l'elettrofisiologia tensione-morsetto, le analisi biochimiche e ulteriori test farmacologici.

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Qui si descrivono i metodi elettrofisiologici per la misurazione della trasmissione sinaptica a livello della giunzione neuromuscolare larva di Drosophila. Rilascio evocato è iniziata artificialmente stimolando gli assoni dei motoneuroni, e la trasmissione attraverso il NMJ può essere misurata la risposta postsinaptica evocata nel muscolo.

Metodi elettrofisiologici per la registrazione Potenziali Synaptic dal NMJ Larve di Drosophila

Registrazione elettrofisiologiche in Drosophila Embryo

Il sistema di fibra Gigante è un semplice circuito neuronale di...

Le registrazioni elettrofisiologiche dal Percorso di Fiber Gigante D. melanogaster</em

La registrazione simultanea dei segnali di calcio da parte dei neuroni identificati e comportamento alimentare di Drosophila melanogaster</em

Questo video delinea il protocollo per la registrazione elettrofisiologica dell'attività dei fotorecettori nell'occhio di una Drosophila immobilizzata, consentendo una misurazione precisa delle variazioni di tensione in risposta agli stimoli luminosi.

Registrazione elettrofisiologica delle risposte di tensione dei fotorecettori retinici di Drosophila agli stimoli luminosi

Il video dimostra la registrazione extracellulare dell'attività neuronale dal sistema nervoso centrale (SNC) delle larve di Drosophila. Il SNC sezionato viene posizionato in una camera di registrazione e l'attività elettrica di un nervo discendente viene registrata per stabilire la frequenza di attivazione di base. Viene quindi introdotto un agente di prova e viene registrata la variazione della frequenza di attivazione per determinare l'effetto eccitatorio o inibitorio dell'agente.

Registrazione extracellulare dell'attività elettrica nel sistema nervoso centrale della Drosophila

Questo protocollo descrive registrazione extracellulare delle possibili azioni di risposta sparati dai neuroni del gusto labellar in Drosophila.

Elettrofisiologici Registrazione da<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Taste Sensilla

I microelettrodi affilati consentono un'accurata caratterizzazione elettrofisiologica dell'output dei fotorecettori e degli interneuroni visivi in Drosophila vivente. Qui mostriamo come utilizzare questo metodo per registrare risposte di tensione di alta qualità delle singole cellule alla stimolazione luminosa controllata. Questo metodo è ideale per studiare l'elaborazione delle informazioni neurali negli occhi composti da insetti.

Metodo elettrofisiologiche per la registrazione intracellulare di tensione Risposte di<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorecettori e Interneuroni a luce stimoli<em&gt; In Vivo</em

Le registrazioni a cellule intere dai fotoricettori Drosophila melanogaster consentono di misurare scatti oscuri spontanei, urti quantici, risposte macroscopiche alla luce e relazioni di tensione-corrente in varie condizioni. In combinazione con gli strumenti di manipolazione genetica D. melanogaster , questo metodo consente di studiare il percorso iniettol-lipidico onnipresente e il suo target, il canale TRP.

Metodo elettrofisiologico per le registrazioni a morsetto di tensione a cellule intere da<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorecettori

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di dimostrare come presentare gli odoranti a bassa volatilità per la registrazione singolo-sensillare da parte dei neuroni del recettore olfattivo Drosophila che rispondono ai feromoni cuticolari a catena lunga.

Registrazione elettrofisiologica da<em&gt; Drosophila</em&gt; Senso Trichoide in risposta a Odoranti di bassa volatilità

Delle correnti sinaptiche possono essere registrate focale da visualizzati boutons sinaptici alla giunzione neuromuscolare larve instar terza della drosofila . Questa tecnica consente il monitoraggio dell'attività di una singola bouton sinaptica.

Macropatch focale registrazioni delle correnti sinaptiche da giunzione neuromuscolare larvale della drosofila

Scopri la registrazione elettrofisiologica del sistema nervoso centrale di Drosophila melanogaster di terzo stadio. Questo metodo semplice e riproducibile permette di studiare l'attività neuronale e testare agenti farmacologici per la ricerca in tossicologia degli insetti.

Registrazione elettrofisiologica dell'attività del sistema nervoso centrale di terza-Instar Drosophila Melanogaster

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