Name: Un modello di Mouse Hyperandrogenic per studiare la sindrome dellovaio policistico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Scopri come creare un modello murino iperandrogenico per studiare la sindrome dell'ovaio policistico utilizzando pellet di diidrotestosterone. Questo metodo consente di analizzare gli effetti sulla salute riproduttiva della prole.

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Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health (sovvenzioni R00-HD068130 a S.W.) e il centro di ricerca del diabete di Baltimora: piloti e fattibilità Grant (a S.W.).

Qui, presentiamo protocolli dettagliati per inserimento e DHT pellet preparazione e per test riproduttivi e metabolici. I topi utilizzati in questo studio erano un fondo misto (C57/B6, CD1, 129Sv) e sono stati mantenuti con cibo e acqua ad libitum in un ciclo luce/buio 14/10 h a 24 ° C nella struttura animale Broadway Research Building presso la Johns Hopkins University School of Medicina. Tutte le procedure sono state approvate dal comitato di uso e cura degli animali di Johns Hopkins University.
1. creare il modello del topo PCOS-come
<ol><li>
Preparazione di pellet DHT
	<ol>
<li>Tubi di silastic autoclave per sterilizzare. Tagliare tubi di silastic per una lunghezza di 15 mm con una lama di rasoio;</li>
		<li>Sigillare un lato con l'iniezione di silicone adesivo medico nel tubo con un ago smussato 20 G collegato ad una siringa da 3 mL. Stantuffo dovrebbe essere ritirato dalla siringa e poi adesivo inserito nel serbatoio. Lo stantuffo viene reinserito e adesivo spinto verso il basso fino a quando non comincia ad emergere dall'ago. L'ago blunted fatta dal lato punta tagliente dell'ago 20 G di taglio con le forbici forte. La lunghezza del silicio nel tubo dovrebbe essere più di 2 mm consentono un taglio di post-produzione;</li>
		<li>Asciugare durante la notte; Verifica per le bolle d'aria sul lato sigillato. Quelli senza bolle d'aria sono usati per pellet di DHT. Gli altri può essere utilizzati per il no-DHT controllo pellet.</li>
		<li>Indossare guanti, maschera, occhiali e camice da laboratorio prima di effettuare il DHT-pellet in un cappuccio per evitare l'esposizione DHT per la pelle.</li>
		<li>Polvere DHT di versare in una plastica pesare barca e premere il lato aperto dell'adesivo ricoperto di tubi (prodotte in a 1.1) alla polvere di DHT.</li>
		<li>Polvere DHT possa essere pestata con una graffetta che viene raddrizzata.  Proseguire fino a DHT raggiunge un'altezza di 4 mm (o la lunghezza desiderata). Controllare la lunghezza di DHT con un righello e sigillare il lato aperto con silicio, asciutto durante la notte.</li>
		<li>Tagliare ogni lato sigillato per rendere la lunghezza di silicio 2 mm di lunghezza. La lunghezza totale del pellet sarà 8 mm.</li>
		<li>Guarnizione di entrambi i lati del tubo di silastic vuota come pellet di controllo (n-DHT).</li>
		<li>Mantenere il pellet in una provetta conica 50 mL avvolta con foglio (per evitare l'esposizione alla luce) a temperatura ambiente fino all'utilizzo. I pellet DHT mantengono piena efficacia per almeno 3 mesi di deposito.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sostituzione e inserimento di DHT
	<ol>
<li>Fino a 20 DHT pellet o pellet di controllo sono sommerse separatamente in una provetta conica da 50 mL con 30 mL di soluzione sterile salina 0,9% per 24 h a 37 °C di equilibramento appena prima dell'inserimento.</li>
		<li>Prima dell'intervento, le superfici e i guanti vengono disinfettati con clidox e le superfici di lavoro sono coperti con carta assorbente sostenuto plastica pulito (tampone chirurgico).  Tutti gli strumenti che vengono a contatto con animali sono decontaminati prima di entrare la struttura animale in autoclave.  Gli strumenti potranno asciutto e fresco prima dell'uso.</li>
		<li>2-mese-vecchi topi femminili sono utilizzati (4 – 5 topi/gabbia). I topi sono iniettati intraperitonealmente con xilazina (3,5 mg/kg bw) e ketamina (78,8 mg/kg bw) utilizzando una siringa da insulina. Calcoli per miscelazione e dosaggio di anestesia è nella tabella 1.</li>
		<li>Dopo un'anestesia adeguata è raggiunto, come misurato dalla perdita del riflesso di punta e rallentato la respirazione, il mouse sarà essere preparato per la chirurgia.</li>
		<li>Disinfettare la pelle della zona con betadine con garza sterile e pulire con etanolo al 70%.  L'area sarà ancora dipinto con betadine.</li>
		<li>Tagliare un foro di circa 5 mm lunghezza con forbici sotto la pelle vicino al collo. Utilizzando un trochar 10 G, fare un piccolo tunnel (15 mm) in direzione rostrale. Il pellet viene inserito dorsalmente con il trochar.</li>
		<li>L'apertura viene quindi sigillato con adesivo chirurgico. Manualmente approssimativo la ferita bordi con forcipe e tratti delicate spazzolatura per applicare un sottile strato di adesivo liquido per i bordi della ferita approssimata. Strati sottili di accumulo 3 di adesivo per garantire che l'adesivo è distribuito uniformemente sopra la ferita. L'adesivo deve estendersi di 1 cm su ogni lato dei bordi della ferita apposed. Sutura o clip chirurgiche utilizzabile anche per chiudere il foro. Rimettere topi in gabbia, alloggiato individualmente, con una piastra di calore per il recupero. Sostituire il pellet ogni 4 settimane per mantenere costante il livello di esposizione dell'androgeno. Il pellet originale verrà rimosso e verrà inserito nuovo pellet come descritto in A1.15 in posizione simile.</li>
		<li>Prova ciclicità estro dopo 3 giorni di inserimento di DHT. Fase del ciclo estrale è valutata tramite citologia vaginale.  Le cellule vaginali sono raccolti per 16 giorni consecutivi utilizzando una pipetta p10 a schizzare (circa 10 µ l) di soluzione salina sterile nella cavità vaginale e poi ritirare la soluzione fisiologica con la stessa pipetta sterile.  Le cellule vaginali sloughed da parete vaginale mescolano con soluzione fisiologica e sono raccolte.</li>
		<li>Diffondere la soluzione fisiologica con cellule su un vetrino con etichetta. Ogni diapositiva può contenere sei campioni. Diapositive sono etichettati per notare quale campione viene messo in ognuna delle sei location.</li>
		<li>Dopo la soluzione salina è completamente asciugato sulla diapositiva, mettere le diapositive in un contenitore con etanolo al 100% per fissare le cellule. Diapositive è opportuno fissare per almeno 5 min, ma possono rimanere in fissativo indefinitamente fino al successivo utilizzo.</li>
		<li>Inserire diapositive in colorazione soluzioni per 1 minuto ogni buffer B e diapositive C. Wash con acqua di rubinetto e asciugare a temperatura ambiente.</li>
		<li>Esaminare la morfologia delle cellule sotto un microscopio chiaro obiettivo di 10 X.  Morfologia delle cellule per distinguere proestro (P), estro (E), Metaestro (M) e diestro (D) è descritto in riferimenti27,28,29.</li>
		<li>Conteggio i giorni in ogni fase e dividono per il numero totale di giorni per calcolare la percentuale di tempo in ogni fase.</li>
		<li>Test tolleranza al glucosio in 21 giorni dopo l'inserimento di DHT di digiuno durante la notte i topi (16h) e iniettare 2 g/kg di peso corporeo di destrosio 20% intraperitonealmente. Ad esempio, se un peso corporeo di mouse è di 25 g, questo mouse sarà iniettato con 250 µ l di destrosio 20% con una siringa da insulina 50 cc (0,5 mL). I livelli del glucosio sono valutati da strisce glucometer e test mediante un campione di sangue dalla vena di coda a 0, 15, 30, 60, 90, 120 min. Questo è descritto dettagliatamente altrove30.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Raccolta del sangue
	<ol>
<li>Raccogliere il sangue ai vari giorni dopo l'inserimento di DHT (limitiamo il volume di raccolta da 100 µ l per steroidi e 30ul per dosaggio di LH/FSH) tra il 9 e 10 dalla vena sottomandibolare sanguinamento con la lancetta. Questo è descritto in11.</li>
		<li>Centrifugare il sangue a 6.000 x g a 4 ˚C per 10 min e raccogliere il livello del siero in un'altra provetta da 1,5 mL che possa essere conservata a-80 °C fino al dosaggio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. valutare riproduttiva profili della prole femminile da cronicamente DHT inserito dighe
<ol><li>
Accoppiamento
	<ol>
<li>Nella gabbia con un maschio fertile provata (che in precedenza ha avuto cuccioli con un topo femmina) viene spostato il mouse femminile da sottoporre alle 15 giorni dopo l'inserzione della pallina.</li>
		<li>Documento di peso corporeo di diga ogni settimana per determinare se il mouse è incinto. Diga aumenti di peso di oltre 3 g in una settimana indica gravidanza.</li>
		<li>Raccogliere il sangue delle dighe, la seconda settimana dopo osserviamo il peso corporeo aumentato delle dighe superiori a 3 g dalla settimana prima.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pubertà valutata dall'apertura vaginale e primo estro
	<ol>
<li>Verifica apertura vaginale mediante ispezione visiva ogni giorno dopo i cuccioli sono svezzati a 21 giorno postnatale (PND), misurare la distanza anogenital e registrare l'età dell'apertura vaginale.</li>
		<li>Una volta che si apre la vagina, raccogliere le cellule vaginali al giorno, come descritto in 1.2.8–1.2.11 per verificare ciclicità estro.</li>
		<li>Osservare la morfologia delle cellule come descritto 1.2.12, e il primo estro è definita come la data che tutte le cellule sono cellule epiteliali cornificate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pugno dell'orecchio e del peso del corpo
	<ol>
<li>Immergere la lancetta punta nella pasta tatuaggio e contrassegnare ogni cucciolo con il tatuaggio sulla punta, come descritto nel riferimento12 alle 7 PND e pesare topi ogni 7 giorni fino a 70 giorni di età.</li>
		<li>Topi di pugno di orecchio di numerarli utilizzando il sistema in Figura 1 tra 12 e 16 PND. Per distinguere il sesso, esaminare il lato ventrale del corpo, le femmine avranno capezzoli visibili.</li>
		<li>Raccogliere il sangue alle 21, 26, 70 PND dopo la nascita come descritto sopra in 1.3.1</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analisi ormonale
	<ol>
<li>I livelli di DHT in siero di anima sono misurati da entrambi analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) e di cromatografia liquida tandem mass spettrometria (LC-MS)23,24,31,32. T è misurata da LC-MS, o un ratto/topo ELISA che è stato convalidato dal Università di Virginia Ligand Assay nucleo nel centro di ricerca in riproduzione23,24.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>McNamara, K. M., Harwood, D. T., Simanainen, U., Walters, K. A., Jimenez, M., Handelsman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+sex+steroids+in+murine+blood+and+reproductive+tissues+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Steroid+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurement of sex steroids in murine blood and reproductive tissues by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.</a> J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 121 (3-5), 611-618 (2010).</li>
<li>Klein, S. L., Bird, B. H., Glass, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+Seoul+virus+infection+are+not+related+to+adult+sex+steroid+concentrations+in+Norway+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Sex differences in Seoul virus infection are not related to adult sex steroid concentrations in Norway rats.</a> J. Virol. 74 (17), 8213-8217 (2000).</li>
<li>Siracusa, M. C., Overstreet, M. G., Housseau, F., Scott, A. L., Klein, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((17beta-estradiol+alters+the+activity+of+conventional+and+IFN-producing+killer+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">17beta-estradiol alters the activity of conventional and IFN-producing killer dendritic cells.</a> J. Immunol. 180 (3), 1423-1431 (2008).</li>
</ol>

Nulla da rivelare.

Iperandrogenismo è una caratteristica fondamentale di PCOS. I livelli del siero DHT (due volte più alto nei topi DHT che nei topi no-DHT) utilizzati in questo protocollo sono inferiori a quelli riportati da altri ricercatori in studi precedenti e sono calibrati per imitare proporzionalmente le donne con PCOS5,19, 20,21. A differenza di altri modelli, questo modello DHT 2 volte non altera il pe...

Iperandrogenismo è il segno distintivo della sindrome dell'ovaio policistico (PCOS) secondo criteri NIH e dell'eccesso dell'androgeno e della società PCOS (AE-PCOS). Le donne con PCOS hanno difficoltà a rimanere incinta e hanno un aumentato rischio di complicazioni di gravidanza1. Anche se sono incinta, loro prole femminile hanno un2,di esiti negativi per la salute3. Modelli animali sono stati sviluppati utilizzando varie strategie4,5,6,7,8,9,10,11 , 12 e che esibiscono molte caratteristiche di PCOS (anovulazione, e o alterata tolleranza al glucosio e insulina) con aumento del peso corporeo e l'obesità associata con ingrossamento degli adipociti dimensioni e il peso maggiore del adipocyte. Esistono due strategie principali per produrre modelli animali che vengono utilizzati per studiare la PCOS. Uno è il trattamento con alti livelli di androgeni direttamente (androgeni esogeni iniezione/inserimento) o indirettamente (ad esempio bloccando la conversione di androgeni in estrogeni con inibitore dell'aromatasi) dopo nascita13. Un altro è di hyperexposure fetale di androgeni durante gestazione14,15 per studiare la prole. Ad esempio, prole femminile da scimmia rhesus16,17, pecore18e roditori esposti a maschi livelli di androgeni durante il periodo intrauterino sviluppare tratti di PCOS-come più tardi nella vita. Questi modelli significativamente migliorato la nostra comprensione degli effetti androgeni e programmazione fetale e uterini effetti ambientali. Tuttavia, questi modelli hanno i loro limiti: 1) gli animali sviluppano obesità e pertanto risulta difficile separare gli effetti di iperandrogenismo da obesità indotta riproduttivo e disfunzione metabolica; 2) prima della gravidanza, le donne con PCOS presentano già alti livelli di androgeni, così gli ovociti sono stati esposti agli androgeni in eccesso prima della fecondazione; 3) le dosi farmacologiche di testosterone (T) o diidrotestosterone (DHT) utilizzato dopo la nascita o durante la gestazione potrebbero non riflettere l'ambiente dell'androgeno di PCOS. Livelli di testosterone e DHT sono stati misurati nel fluido follicolare ovarico e/o del siero, e testosterone ed i livelli di DHT sono 1.5 a 3,9 volte superiore nelle donne con PCOS5,19,20,21 ,22,23 rispetto alle donne inalterate. Abbiamo creato un topo adulto modello23,24,25 che si sviluppa la disfunzione metabolica e riproduttiva entro due settimane dall'inizio dell'esposizione cronica di DHT dall'inserimento di una pallina con lunghezza di 4 mm polvere di cristallo DHT (lunghezza totale di pellet è di 8mm). Questo modello produce livelli DHT del siero che sono circa 2 volte superiore (denominato 2xDHT) di quella dei topi di controllo senza trattamento DHT. I topi di 2xDHT non presentano alterazioni di basale del siero, testosterone, LH e non sviluppare l'obesità e mostrare peso ovarico simile, i livelli sierici di colesterolo, acidi grassi liberi, leptina, TNFα e IL-623,24, 25 relativi a controlli anche fino a 3,5 mesi dopo DHT inserimento23,24,25. Inoltre, con l'accoppiamento le femmine che hanno già sviluppato caratteristiche di PCOS, possiamo studiare l'impatto di un ambiente materno iperandrogenica sulla salute metabolica e riproduttiva della prole15.
Questo nuovo paradigma (pertinente ai criteri NIH e società AE-PCOS) modella la malattia producendo relativamente simili livelli di androgeni a quelli delle donne con PCOS 2 - 3 volte più alto testosterone o i livelli di DHT rispetto alle donne inalterate. Tuttavia, questo modello è garantito dal continuo DHT esogeno e non da iperandrogenismo endogeno programmato una volta DHT è ritirato. L'obiettivo generale di questo articolo è di concentrarsi su 1) come fare il pellet DHT; 2) come generare un lean-PCOS come modello murino; 3) strategie per valutare la prole femminile da queste dighe. Altre misure e la valutazione di fenotipi non vengono affrontati in questo manoscritto, ma possono essere trovati in5,15,23,24,25,26.

<table><tbody><tr><td>Polvere cristallina 5&alfa;-DHT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8380-1G</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning Tubi Silastic</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-189-15D</td><td>0,04 pollici / 1 mm diametro interno x0,085 pollici / 2,15 mm diametro esterno</td></tr><tr><td>Silicone adesivo medico</td><td>Fattore II, InC.</td><td>A-100</td><td></td></tr><tr><td>Occhiali, camici da laboratorio, guanti e maschere.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; L puntali per pipette senza filtro</td><td>USA Scientific</td><td>11113700</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino per striscio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-003</td><td></td></tr><tr><td>Diff Quik per colorazione di cellule</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9979740</td><td></td></tr><tr><td>Lancet</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9416572</td><td></td></tr><tr><td>3 mL Syring</td><td>Becton, Dickinson and Company (BD),</td><td>30985</td><td></td></tr><tr><td>ago attaccato: 20 G</td><td>BD</td><td>305176</td><td></td></tr><tr><td>Righello: qualsiasi lunghezza superiore a 10 cm con scala millimetrica.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Vet one AnnSeA LA, MWI, Boise</td><td>NDC13985-704-10</td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td>Ketamina cloridrato</td><td>Hospira, Inc</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td>Graffe chirurgiche</td><td>AutoClip&reg; Sistema, Fine Science Tool</td><td>12020-00</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da insulina</td><td>BD</td><td>329461</td><td>1/2 CC, siringa da insulina U-100 a basso dosaggio</td></tr><tr><td>Trocar</td><td>Innovative Research of America</td><td>MP-182</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Carl Zeiss Primo Star</td><td>415500-0010-001</td><td>Germania</td></tr><tr><td>Punzone per l'orecchio</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-201</td><td></td></tr><tr><td>Testosterone ELISA per ratto/topo kit</td><td>IBL</td><td>B79174</td><td></td></tr><tr><td>Kit ELISA DHT</td><td>Alpha Diagnostic International</td><td>1940</td><td></td></tr><tr><td>Ultra glucometro One touch</td><td>Life Scan, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strisce di prova ultra con un solo tocco</td><td>Life Scan, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubo</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-18</td><td></td></tr><tr><td>Lama di rasoio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Clidox</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0089321</td><td></td></tr><tr><td>sottopiede chirurgico</td><td>Fisher Scientific 50587953</td><td></td><td>Produttore: Andwin Scientific 56616018</td></tr><tr><td>Betadine Soluzione antisettica</td><td>Walgreens</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3M Vetbond (n-butil cianoacrilato)</td><td>3M Scienza. Applicato alla vita</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un modello di mouse hyperandrogenic per studiare la sindrome dell'ovaio policistico

A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome

Iperandrogenismo svolge un ruolo critico nella funzione riproduttiva e metabolica nelle femmine ed è il segno distintivo della sindrome dell'ovaio policistico. Lo sviluppo di un modello di topo PCOS-come magro che imita le donne con PCOS è clinicamente significativo. In questo protocollo, descriviamo un tale modello. Con l'inserimento di una lunghezza di 4 mm di pellet di polvere DHT (diidrotestosterone) cristallo (lunghezza totale di pellet è di 8 mm), e sostituirlo ogni mese, siamo in grado di produrre un modello del mouse di PCOS-come con piega di 2 livelli DHT siero superiore rispetto ai topi non impiantati con DHT (no-DHT). Abbiamo osservato la disfunzione metabolica e riproduttiva senza modificare il peso corporeo e la composizione corporea. Mentre che esibiscono un alto grado di sterilità, un piccolo sottoinsieme di questi topi femminili PCOS-come può rimanere incinto e la loro prole pubertà ritardata e testosterone aumentato di adulti. Questo modello di mouse magra PCOS-come è uno strumento utile per studiare la fisiopatologia della PCOS e la discendenza da queste dighe di PCOS-come.

Livelli sierici di DHT e test di tolleranza al glucosio
I livelli di DHT sono stati misurati dal siero raccolto da entrambi ELISA e mediante LC-MS secondo protocollo 1,24-1,25 e 2.9, 3.0. I valori assoluti DHT sono diversi tra spettrometria di massa ed ELISA, tuttavia, la relativa piega (circa 2 volte) di DHT vs no-DHT inserimento è simile in entrambe le analisi e attraverso esperimenti15,<sup cla...

Descriviamo lo sviluppo di un modello murino di PCOS-come magro con pellet di diidrotestosterone per studiare la fisiopatologia della PCOS e la discendenza da queste dighe di PCOS-come.

Un modello di Mouse Hyperandrogenic per studiare la sindrome dell'ovaio policistico

Hyperandrogenemia plays a critical role in reproductive and metabolic function in females and is the hallmark of polycystic ovary syndrome. Developing a ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della riproduzione. E l'endocrinologia. E sono applicabili allo studio della sindrome dell'ovaio policistico o PCOS e iperandrogenismo.Il vantaggio di questa tecnica è che facilita un rilascio coerente, uniforme e a lungo termine di ormoni in modo costoso ed efficace. JHUs che tratta la procedura sarà Ping Xue, un tecnico del mio laboratorio. Per la preparazione del pellet diidrotestosterone o DHT, utilizzare una lama di rasoio per tagliare un pezzo di tubi in silicone da 15 millimetri.E utilizzare una siringa da tre millilitri dotata di un ago smussato calibro 20 per iniettare silicone adesivo medicale da due a cinque millimetri in un'estremità del tubo. Lasciare asciugare i tubi durante la notte. E controlla la presenza di bolle d'aria sull'estremità sigillata.Indossare l'attrezzatura di protezione individuale appropriata versare polvere DHT in una barca di plastica nella scorrenza. Imprimere l'estremità aperta del tubo chiuso adesivo nella polvere. Utilizzando una grande graffetta raddrizzata, domare la polvere nel tubo, fino a quando il DHT raggiunge l'appropriata profondità sperimentale.Quindi sigillare il lato aperto del tubo con silicone durante la notte. La mattina seguente, tagliare ogni lato sigillato per ottenere una lunghezza di due millimetri di silicone su entrambi i lati del DHT e nessun pellet di controllo DHT. Quindi conservare i pellet nel tubo conico da 50 millilitri avvolto con un foglio a temperatura ambiente per un massimo di tre mesi.Per la generazione di modelli di mouse PCOS equilibrare fino a 20 DHT o controllare pellet in tubi conici separati da 50 millilitri contenenti 30 millilitri dello 0,9% di soluzione salina per 24 ore a 37 gradi Celsius. Il giorno dopo, conferma la mancanza di risposta al dito del dito in un topo femmina anestetizzato di due mesi e usa una garza sterile per somministrare povidone-iodio sequenziale e scrub di etynol al 70% nell'area chirurgica. Quindi, fai un'incisione di cinque millimetri attraverso la pelle vicino al collo.E usa un trocar calibro dieci per fare un tunnel di 15 millimetri in direzione rostrale. Utilizzare il trocar per inserire un pellet dorsalmente nel tunnel e sigillare l'incisione con l'adesivo chirurgico. Approssimare manualmente i bordi della ferita con le forcep e utilizzare tratti di spazzolatura delicati per applicare tre sottili strati di pellicola di adesivo liquido a un centimetro di distanza da ciascun lato dei bordi della ferita opposti.Quindi posizionare il mouse da solo in una gabbia su un dissipatore di calore con monitoraggio fino alla piena rimossipanza. Sostituzione del pellet ogni quattro settimane per mantenere un livello costante di esposizione agli androgeni. Tre giorni dopo l'inserimento del pellet, utilizzare una pipetta p10 per spruzzare dieci microlitri di soluzione salina sterile nella cavità vaginale e utilizzare la punta della pipetta per recuperare immediatamente la soluzione salina.Stendere il campione salino della cellula vaginale su uno scivolo etichettato. E lasciare asciugare la salina a temperatura ambiente. Fissare le diapositive essiccate in un contenitore di etynolo al 100% per almeno cinque minuti.Quindi macchiare le diapositive per un minuto ciascuna nel buffer B e nel buffer C da un kit di colorazione dif-quick. Alla fine del tampone C l'incubazione lavare gli scivoli con acqua del rubinetto per tre secondi e asciugarli a temperatura ambiente. Per determinare la ciclicità estrosa vedere le diapositive sotto l'obiettivo dieci volte di un microscopio a luce.Contare i giorni in ogni fase e dividere per il numero totale di giorni per calcolare il tempo percentuale in ogni fase. Per testare la tolleranza al glucosio, 20 giorni di inserimento DHT, digiunare i topi durante la notte. Pesare i topi la mattina successiva e utilizzare un glucometro e strisce di prova per misurare il livello di glucosio basilico nel sangue della vena della coda.Iniettare ai topi due grammi per chilogrammo di peso corporeo del 20% di destrosio. Quindi misurare il livello di glucosio dei campioni di sangue delle vene della coda a 15, 30, 60, 90, 120 minuti dopo la somministrazione di destrosio. Per acquisire la prole femminile dalle dame inserite da DHT, spostare il topo femmina per testarlo nella gabbia con un maschio fertile comprovato al giorno 15, dopo l'inserimento del pellet.Documentare il peso corporeo delle dame ogni settimana per determinare se il topo è incinta. Il settimo giorno postnatale, immergere una punta di lancetta nella pasta per tatuaggi e contrassegnare ogni cucciolo con un tatuaggio sulla punta. Pesare i topi marcati ogni sette giorni fino a 70 giorni di età.Tra la data postnatale 12 e il 16, l'orecchio colpisce i topi per numerarli secondo il sistema come illustrato nella figura. Per distinguere il sesso, esaminare il lato ventrale di ogni mouse taggato. Le femmine avranno capezzoli visibili.Per raccogliere campioni di sangue per varie analisi a valle utilizzare una lancetta per raccogliere il volume sperimentale approssimativo di sangue tra le nove e le dieci del mattino per sanguinamento gestulare submandibolare. E centrifugare i campioni per consentire la raccolta del siero. Quindi conservare i campioni di sieri in tubi di micro-centrifuga da 1,5 millilitri a meno 80 gradi Celsius fino alla loro analisi.Per valutare la pubertà nella prole femminile del DHT, ogni giorno dopo lo svezzamento al giorno post-natale 21, controllare l'apertura vaginale mediante ispezione visiva. E usa i calibri per misurare la distanza ano-genitale. Sebbene i valori assoluti del siero DHT siano diversi tra la spettrometria di massa e l'analisi di Elisa, il cambiamento popolare relativo dell'inserimento DHT rispetto a quello no-DHT è simile sia dai saggi che dagli esperimenti.I livelli di DHT sono significativamente aumentati dal pre-concepimento attraverso la gravidanza sia in DHT che in nessun topo DHT. Tuttavia, i livelli di DHT sono due volte più alti nei topi DHT rispetto a nessun topo DHT sia nei punti di tempo pre-concepizionali che gestazionali. Le figlie DHT adulte mostrano differenze nella funzione riproduttiva.Ad esempio, la ciclicità estrosa interrotta rispetto alle figlie adulte non DHT che sperimentano tempi significativamente più lunghi nel metestrus diestrus e meno tempo in pro-esterous e esterous. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di incubare i pellet per 24 ore prima che siano utilizzati per il rilascio uniforme dell'ormone. Seguendo questa procedura, possono essere esaminate anche le conseguenze riproduttive e metaboliche dell'esposizione al DHT.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'endrocrocrologia e delle interazioni fetali materne per studiare il PCOS e l'impatto dell'iperandrogenismo di basso livello nei topi femmine. Non dimenticare che lavorare con DHT può essere estremamente pericoloso e le precauzioni come indossare guanti, una maschera e occhiali e lavorare in un cappuccio di bio-sicurezza, dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.

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Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Questo articolo descrive un modo per preparare e inserire pellet di diidrotestosterone (DHT) per modellare la sindrome dell'ovaio policistico (PCOS) nei topi. Il protocollo di esempio dimostra la procedura nei topi utilizzati per gli studi riproduttivi e metabolici.

Trattamento sottocutaneo del diidrotestosterone (DHT): modello murino di sindrome dell'ovaio policistico (PCOS)

Molti modelli di endometriosi di roditori sono limitati dalla complessità tecnica, dalla riproducibilità e / o dalla necessità di animali immunocompromessi o topi reporter speciali. Presentiamo un sistema semplificato di induzione della lesione utilizzando qualsiasi topo sperimentale con un sistema di punteggio oggettivo verificabile in modo indipendente e senza necessità di ovariectomia o chirurgia di sopravvivenza.

Un modello murino singenico di endometriosi utilizzando topi naturalmente ciclabili

Questo studio descrive la misurazione diretta della produzione epatica di glucosio in un modello murino di sindrome dell'ovaio policistico utilizzando un tracciante di glucosio isotopico stabile attraverso la vena della coda sia a digiuno che in stati ricchi di glucosio in tandem.

Valutazione della produzione epatica di glucosio in un modello murino di sindrome dell'ovaio policistico

L'ormone follicolo-stimolante (FSH) in vari tessuti e organi extragonadici è associato alla patogenesi di molteplici malattie. Il modello murino ovariectomizzato e trattato con FSH (OVF) può essere utilizzato per esplorare le azioni extragonadiche di FSH.

Esplorazione degli effetti indipendenti dell'ormone follicolo-stimolante in vivo in un modello murino

Questo studio introduce un nuovo modello murino specificamente progettato per simulare l'endometrioma, un sottotipo clinicamente significativo di endometriosi. Utilizzando topi C57BL/6J, il modello mira a chiarire i meccanismi fisiopatologici alla base dell'infertilità correlata all'endometrioma, offrendo uno strumento raffinato per colmare l'attuale divario di conoscenze in medicina riproduttiva.

Istituzione di un modello murino sperimentale di endometrioma per studiarne l'infertilità correlata

Questo protocollo introduce una tecnica per indurre modelli di sindrome dell'ovaio policistico (PCOS) nei topi attraverso il rilascio controllato di letrozolo utilizzando mini-pompe. In anestesia adeguata, la mini-pompa è stata impiantata per via sottocutanea e la PCOS è stata indotta con successo nei topi dopo un certo periodo di rilascio della mini-pompa.

Una tecnica modificata per indurre la sindrome dell'ovaio policistico nei topi

La convalida sperimentale dell'attività dell'enhancer è meglio affrontata dall'analisi della perdita di funzione. Viene presentato un protocollo efficiente che utilizza la delezione mediata da CRISPR/Cas9 per studiare la regolazione allele-specifica della trascrizione genica nelle cellule ES F1 che contengono un genoma ibrido (Mus musculus129 x Mus castaneus).

Generazione CRISPR / Cas9 Mediated monoallelic eliminazioni per studiare la funzione Enhancer nel topo cellule staminali embrionali

Questo protocollo presenta un metodo per eseguire quantitativa, cella singola analisi in situ di espressione della proteina per studiare specifiche lignaggio in embrioni di topo preimpianto. Le procedure necessarie per la raccolta di blastocisti, tutto il montaggio di rilevamento di immunofluorescenza di proteine, l'imaging di campioni su un microscopio confocale, e la segmentazione nucleare e l'analisi delle immagini sono descritte.

Analisi quantitativa di espressione della proteina per studiare Lineage specifica nel topo preimpianto embrioni

Questo protocollo descrive l'isolamento, la cultura e la calcificazione delle cellule interstiziali di ratto-derivato valvola, un modello altamente fisiologico in vitro della malattia della valvola aortica calcificante (CAVD). Lo sfruttamento di questo modello di ratto facilita la ricerca di MCVA ad esplorare le cellule e i meccanismi molecolari che sono alla base di questo complesso processo patologico.

Valvola di isolamento e caratterizzazione del ratto primario cellule interstiziali: un nuovo modello per studiare la calcificazione della valvola aortica

Qui, descriviamo un metodo di imaging intero-monta ad alta risoluzione nella pelle dell'orecchio intero topo adulto, che consente di visualizzare la morfogenesi di ramificazione e patterning di nervi periferici e vasi sanguigni, come pure la distribuzione delle cellule immuni.

Intero-monta la microscopia confocale per la pelle dell'orecchio dell'adulto: un sistema modello per lo studio di morfogenesi di ramificazione Neuro-vascolare e la distribuzione delle cellule immuni

Scopri come creare un modello murino iperandrogenico per studiare la sindrome dell'ovaio policistico utilizzando pellet di diidrotestosterone. Questo metodo consente di analizzare gli effetti sulla salute riproduttiva della prole.

Un modello di Mouse Hyperandrogenic per studiare la sindrome dell'ovaio policistico

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