Citometria a flusso di phospho con codici a barre fluorescenti cella per cella singola segnalazione analisi e scoperta del biomarcatore
October 4th, 2018
Qui, un protocollo per analisi di medio-alto rendimento degli eventi di fosforilazione della proteina a livello cellulare è presentato. Phospho flusso cytometry è un approccio potente per caratterizzare la segnalazione aberrazioni, identificare e validare biomarcatori e valutare farmacodinamica.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi della biologia cellulare e dell'immunologia come come vengono influenzate le vie di segnalazione da diversi stimoli o farmaci? Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di eseguire analisi di segnalazione a cella singola in modo medio-alto. Dopo aver nuovamente sospeso le celle in un mezzo RPMI 16/40 integrato, trasferire la quantità richiesta di sospensione cellulare nei pozzi di una piastra inferiore a V da 96 pomp po '.
Trasferire la piastra in un bagno d'acqua preriscaldato di 37 gradi Celsius e lasciare riposare lì per 10 minuti. Quindi aggiungere 60 microlitri di tampone fisso uno ad ogni pozzo di una nuova piastra di pozzo 96 per impostare la piastra fissa. Posizionare questo piatto nel bagno d'acqua di 37 gradi Celsius.
Trasferire un campione di controllo da 50 microliter sulla piastra e mescolare tubazione su e giù. Facoltativamente, aggiungere 10 microlitri per millilitro anti-IgM alle celle per iniziare il corso del tempo di simulazione e mescolare pipettando su e giù. Trasferire un campione di 50 microliter sulla piastra fissa in ogni punto del tempo, mescolando ogni campione man mano che viene aggiunto.
Dopo aver aggiunto l'ultimo campione, lasciare la piastra fissa nel bagno d'acqua per 10 minuti. In primo luogo, lavare le cellule tre volte con PBS. Centrifugare la piastra a 500 volte G per cinque minuti e scartare il supernatante.
Successivamente, preparare una piastra inferiore a V fresca da 96 po 'con reagenti per la posa a barre, pipettando cinque microlitri di ogni reagente di barcodifica in ogni pozzo riempiendo il numero di pozzi necessari per macchiare ciascuno dei campioni. Nella piastra cellulare fissa, rimostrare le cellule in ogni pozzo con 190 microlitri di PBS. Quindi, trasferire ogni pozzo di cellule al pozzo corrispondente nella piastra di barcodifica, mescolandoli bene accuratamente.
Lasciare riposare la piastra a temperatura ambiente per 20 minuti al buio. Centrifugare la piastra a 500 volte G per cinque minuti e scartare il supernatante. Dopo questo, lavare le cellule in ogni bene due volte con il lavaggio del flusso.
Quindi aggiungere 190 microlitri di lavaggio del flusso ad ogni pozzo di cellule. Unire tutti i campioni codificati a barre in un tubo da 15 millilitri e trasferire ogni controllo di compensazione in un tubo separato da 1,7 millilitri. Centrifugare a 500 volte G per cinque minuti e scartare il supernatante.
Per iniziare, trasferire due millilitri di tampone perm tre in un tubo da 15 millilitri. Conservare a meno 20 gradi Celsius in modo che sia ghiacciato quando usato. Quando è pronto, aggiungere 1,5 millilitri di tampone perm ghiacciato al tubo da 15 millilitri contenente la popolazione di celle codificate a barre per poco tempo mentre si vortice per evitare il raggruppamento cellulare.
Aggiungere 100 microlitri di tampone perm ghiacciato a ciascuno dei controlli di compensazione nello stesso modo. Trasferire immediatamente le celle in un congelatore a meno 80 gradi Celsius per un minimo di 30 minuti. Quando è pronto per iniziare la colorazione dell'antigene, rimuovere le cellule dal congelatore e trasferirle in una scatola di ghiaccio.
Lavare le cellule tre volte con un eccesso di lavaggio del flusso. Centrifugare le cellule a 500 volte G e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo la popolazione cellulare codificata a barre in un volume di lavaggio del flusso, tale che ci sono 25 microlitri di sospensione cellulare per macchia fosfo-anticorpale.
Sospendere di nuovo i controlli di compensazione in 200 microlitri di lavaggio del flusso. Per iniziare a preparare gli anticorpi per la colorazione, aggiungere 10 microlitri di anticorpo fosfo-specifico, diluiti nel lavaggio del flusso, ad ogni pozzo di una piastra fresca con fondo a V da 96 po '. Aggiungere 15 microlitri di marcatore di superficie, diluiti nel lavaggio del flusso e 25 microlitri di sospensione cellulare ad ogni pozzo per un volume finale di 50 microlitri per pozzo.
Lasciare riposare le cellule per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. Dopo questo, lavare le celle macchiate due volte con il lavaggio del flusso. Centrifuga a 500 volte G per cinque minuti.
Scartare il supernatante e sospendere di nuovo le cellule in 150 microlitri di lavaggio del flusso. Quindi eseguire l'analisi della citometria del flusso come delineato nel protocollo di testo. Nel protocollo presentato, la stampa a barre tridimensionale viene eseguita combinando tre coloranti per la stampa a barre.
I singoli campioni vengono quindi de-contorti mediante successiva gating su ogni reagente di decodifica a barre rispetto all'area di dispersione laterale. I livelli di fosforilazione indotti dalla basale e stimolazione di 20 molecole di segnalazione a valle del recettore delle cellule B sono quindi caratterizzati in cellule B da pazienti affetti da CLL e controlli normali in varie condizioni. La fosfo tirosina 705 stat3 è considerata significativamente regolata.
Le cellule vengono stimolate con anti-IgM per un massimo di 30 minuti al fine di identificare aberrazioni di segnalazione indotte attraverso la via del recettore cellulare B. Mentre le cellule CLL di pazienti con IGVH non muto mostrano una maggiore sensibilità verso la stimolazione anti-IgM, è statisticamente significativa solo per la serina fosforica AKT 473. Le cellule vengono quindi esposte all'inibitore del delta PI 3-chinasi idelalisib per verificare se il segnale AKT pS473 aberrante può essere invertito.
Come mostrato qui, i livelli di aberrante sono significativamente ridotti al trattamento in modo dipendente dalla concentrazione dimostrando che gli inibitori della chinasi possono essere applicati per normalizzare la segnalazione aberrante nelle cellule CLL. Prima di tentare questa procedura è importante ricordare di titolare reagenti e anticorpi della cotofazione a barre e verificare che i marcatori di superficie selezionati siano compatibili con i reagenti di fissazione e permeabilizzazione. Le cellule devono essere in sospensione per l'analisi del fosforo, tuttavia il protocollo può essere adattato alle cellule aberranti o ai tessuti seguendo procedure per ottenere la sospensione a singola cellula, come l'intera tripzinazione.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per l'analisi a medio-alto rendimento degli eventi di fosforilazione proteica a livello cellulare utilizzando la citometria a flusso fosfo. Questo metodo è efficace per caratterizzare le aberrazioni di segnalazione, identificare e validare biomarcatori e valutare la farmacodinamica.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Biologia cellulare
- Immunologia
- Trasduzione del segnale
Sfondo
- La citometria a flusso fosfo permette l'analisi della segnalazione a singola cellula.
- Questa tecnica può affrontare come le vie di segnalazione sono influenzate da vari stimoli o farmaci.
- È adatta per l'analisi a medio-alto rendimento.
- Il metodo migliora la capacità di studiare le risposte cellulari a un livello dettagliato.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo affidabile per l'analisi della fosforilazione proteica.
- Facilitare l'identificazione di biomarcatori nella segnalazione cellulare.
- Valutare la farmacodinamica di diversi trattamenti.
Metodi utilizzati
- Le cellule sono risospese in mezzo RPMI 16/40 supplementato.
- Una quantità specifica di sospensione cellulare viene trasferita in una piastra a 96 pozzetti con fondo a V.
- La piastra viene incubata in un bagno d'acqua preriscaldato a 37 gradi Celsius.
- Il buffer fisso viene aggiunto per impostare la piastra di fissazione per l'analisi.
Risultati principali
- Il metodo permette un'analisi efficiente delle vie di segnalazione.
- Fornisce informazioni sugli effetti dei farmaci sulla segnalazione cellulare.
- La risoluzione a singola cellula migliora la comprensione delle risposte cellulari.
- I risultati possono portare all'identificazione di potenziali bersagli terapeutici.
Concludenze
- La citometria a flusso fosfo è uno strumento prezioso per studiare la fosforilazione proteica.
- Il protocollo consente un'analisi ad alto rendimento, rendendolo accessibile per varie applicazioni di ricerca.
- Studi futuri possono basarsi su questo metodo per esplorare reti di segnalazione complesse.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Phospho flow cytometry with fluorescent cell barcoding enables medium- to high-throughput single-cell analysis of protein phosphorylation, supporting target validation and biomarker discovery in oncology and immunology. By quantifying drug-induced signaling changes at single-cell resolution, the method enhances predictive confidence in preclinical models and informs go/no-go decisions in therapeutic development. Its compatibility with standard cytometer hardware allows scalable integration into discovery workflows for pathway interrogation and pharmacodynamic assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring phosphorylation dynamics of signaling proteins downstream of receptors such as B cell receptor in disease-relevant cells.
- Operational Value: Enables functional target validation through multiplexed detection of 20 signaling molecules in primary patient-derived cells under stimulated and inhibited conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying aberrant nodes like AKT pS473 and STAT3 pY705 that correlate with drug sensitivity and resistance mechanisms.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Fluorescent cell barcoding allows pooling of multiple samples and conditions into a single tube, increasing throughput and reducing run-to-run variability on standard flow cytometers.
- Quantitative Output: Generates single-cell resolution data on phosphorylation levels, enabling dose-response analysis of kinase inhibitors such as idelalisib in CLL models.
- Platform Reuse: Standardized fixation, permeabilization, and antibody staining steps support adaptation across immune cell types and stimulation paradigms for longitudinal screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses primary CLL patient cells to model signaling aberrations, providing a clinically relevant system for evaluating targeted therapies.
- Translational Continuity: Links ex vivo drug response to biomarker discovery by correlating pS473 reduction with IGVH mutation status, supporting patient stratification strategies.
- Mechanistic De-risking: Demonstrates reversal of aberrant signaling by PI3Kδ inhibition, validating target engagement and mechanism of action for kinase inhibitors in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through lead optimization to preclinical efficacy testing, particularly in immunology and oncology programs focused on signal transduction modulators.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying stimulus-induced phosphorylation changes in primary human B cells, clarifying pathway activation states under basal and drug-treated conditions.
- Screening: Enables reproducible, multiplexed assessment of compound effects on signaling networks, with barcoding facilitating side-by-side comparison of doses, time points, and genetic backgrounds.
- Analytics: Delivers quantitative, single-cell phosphorylation readouts that allow statistical comparison of signaling states across conditions, supporting biomarker threshold setting and response classification.
- Translational Research: Connects in vitro drug response to ex vivo biomarker validation using primary CLL specimens, aligning with preclinical-to-clinical transition criteria.
- Enterprise Reuse: Standardized reagent panel and barcoding strategy allow reuse across projects studying cytokine signaling, antigen receptor activation, or drug mechanism in immune and malignant cell populations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking receptor stimulation to downstream effector phosphorylation at single-cell resolution in heterogeneous primary cell samples.
- Operational Value: Standardized workflow with barcoding increases sample throughput, minimizes technical variance, and maximizes instrument utilization on existing flow cytometry platforms.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early evidence of target modulation and pathway inhibition, reducing investment in compounds with insufficient biological activity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of leads based on target engagement and signaling normalization in disease-relevant human cells.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, antibody titration, and phospho-specific reagent validation to ensure signal specificity and minimize background.
- Dependent on access to flow cytometers with sufficient laser and detector configuration for multiplexed phospho- and surface marker panels.
- Necessitates standardization of fixation, permeabilization, and washing steps across users and sites to maintain reproducibility of phosphorylation signals.
- Requires optimization of barcoding reagent concentrations to avoid spectral overlap and ensure accurate sample deconvolution during analysis.
- Limited to cells in suspension; adherence-dependent or tissue samples require prior dissociation to single-cell suspension using validated enzymatic or mechanical methods.
