Citometria a flusso di phospho con codici a barre fluorescenti cella per cella singola segnalazione analisi e scoperta del biomarcatore
4 ottobre 2018
Qui, un protocollo per analisi di medio-alto rendimento degli eventi di fosforilazione della proteina a livello cellulare è presentato. Phospho flusso cytometry è un approccio potente per caratterizzare la segnalazione aberrazioni, identificare e validare biomarcatori e valutare farmacodinamica.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi della biologia cellulare e dell'immunologia come come vengono influenzate le vie di segnalazione da diversi stimoli o farmaci? Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di eseguire analisi di segnalazione a cella singola in modo medio-alto. Dopo aver nuovamente sospeso le celle in un mezzo RPMI 16/40 integrato, trasferire la quantità richiesta di sospensione cellulare nei pozzi di una piastra inferiore a V da 96 pomp po '.
Trasferire la piastra in un bagno d'acqua preriscaldato di 37 gradi Celsius e lasciare riposare lì per 10 minuti. Quindi aggiungere 60 microlitri di tampone fisso uno ad ogni pozzo di una nuova piastra di pozzo 96 per impostare la piastra fissa. Posizionare questo piatto nel bagno d'acqua di 37 gradi Celsius.
Trasferire un campione di controllo da 50 microliter sulla piastra e mescolare tubazione su e giù. Facoltativamente, aggiungere 10 microlitri per millilitro anti-IgM alle celle per iniziare il corso del tempo di simulazione e mescolare pipettando su e giù. Trasferire un campione di 50 microliter sulla piastra fissa in ogni punto del tempo, mescolando ogni campione man mano che viene aggiunto.
Dopo aver aggiunto l'ultimo campione, lasciare la piastra fissa nel bagno d'acqua per 10 minuti. In primo luogo, lavare le cellule tre volte con PBS. Centrifugare la piastra a 500 volte G per cinque minuti e scartare il supernatante.
Successivamente, preparare una piastra inferiore a V fresca da 96 po 'con reagenti per la posa a barre, pipettando cinque microlitri di ogni reagente di barcodifica in ogni pozzo riempiendo il numero di pozzi necessari per macchiare ciascuno dei campioni. Nella piastra cellulare fissa, rimostrare le cellule in ogni pozzo con 190 microlitri di PBS. Quindi, trasferire ogni pozzo di cellule al pozzo corrispondente nella piastra di barcodifica, mescolandoli bene accuratamente.
Lasciare riposare la piastra a temperatura ambiente per 20 minuti al buio. Centrifugare la piastra a 500 volte G per cinque minuti e scartare il supernatante. Dopo questo, lavare le cellule in ogni bene due volte con il lavaggio del flusso.
Quindi aggiungere 190 microlitri di lavaggio del flusso ad ogni pozzo di cellule. Unire tutti i campioni codificati a barre in un tubo da 15 millilitri e trasferire ogni controllo di compensazione in un tubo separato da 1,7 millilitri. Centrifugare a 500 volte G per cinque minuti e scartare il supernatante.
Per iniziare, trasferire due millilitri di tampone perm tre in un tubo da 15 millilitri. Conservare a meno 20 gradi Celsius in modo che sia ghiacciato quando usato. Quando è pronto, aggiungere 1,5 millilitri di tampone perm ghiacciato al tubo da 15 millilitri contenente la popolazione di celle codificate a barre per poco tempo mentre si vortice per evitare il raggruppamento cellulare.
Aggiungere 100 microlitri di tampone perm ghiacciato a ciascuno dei controlli di compensazione nello stesso modo. Trasferire immediatamente le celle in un congelatore a meno 80 gradi Celsius per un minimo di 30 minuti. Quando è pronto per iniziare la colorazione dell'antigene, rimuovere le cellule dal congelatore e trasferirle in una scatola di ghiaccio.
Lavare le cellule tre volte con un eccesso di lavaggio del flusso. Centrifugare le cellule a 500 volte G e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo la popolazione cellulare codificata a barre in un volume di lavaggio del flusso, tale che ci sono 25 microlitri di sospensione cellulare per macchia fosfo-anticorpale.
Sospendere di nuovo i controlli di compensazione in 200 microlitri di lavaggio del flusso. Per iniziare a preparare gli anticorpi per la colorazione, aggiungere 10 microlitri di anticorpo fosfo-specifico, diluiti nel lavaggio del flusso, ad ogni pozzo di una piastra fresca con fondo a V da 96 po '. Aggiungere 15 microlitri di marcatore di superficie, diluiti nel lavaggio del flusso e 25 microlitri di sospensione cellulare ad ogni pozzo per un volume finale di 50 microlitri per pozzo.
Lasciare riposare le cellule per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. Dopo questo, lavare le celle macchiate due volte con il lavaggio del flusso. Centrifuga a 500 volte G per cinque minuti.
Scartare il supernatante e sospendere di nuovo le cellule in 150 microlitri di lavaggio del flusso. Quindi eseguire l'analisi della citometria del flusso come delineato nel protocollo di testo. Nel protocollo presentato, la stampa a barre tridimensionale viene eseguita combinando tre coloranti per la stampa a barre.
I singoli campioni vengono quindi de-contorti mediante successiva gating su ogni reagente di decodifica a barre rispetto all'area di dispersione laterale. I livelli di fosforilazione indotti dalla basale e stimolazione di 20 molecole di segnalazione a valle del recettore delle cellule B sono quindi caratterizzati in cellule B da pazienti affetti da CLL e controlli normali in varie condizioni. La fosfo tirosina 705 stat3 è considerata significativamente regolata.
Le cellule vengono stimolate con anti-IgM per un massimo di 30 minuti al fine di identificare aberrazioni di segnalazione indotte attraverso la via del recettore cellulare B. Mentre le cellule CLL di pazienti con IGVH non muto mostrano una maggiore sensibilità verso la stimolazione anti-IgM, è statisticamente significativa solo per la serina fosforica AKT 473. Le cellule vengono quindi esposte all'inibitore del delta PI 3-chinasi idelalisib per verificare se il segnale AKT pS473 aberrante può essere invertito.
Come mostrato qui, i livelli di aberrante sono significativamente ridotti al trattamento in modo dipendente dalla concentrazione dimostrando che gli inibitori della chinasi possono essere applicati per normalizzare la segnalazione aberrante nelle cellule CLL. Prima di tentare questa procedura è importante ricordare di titolare reagenti e anticorpi della cotofazione a barre e verificare che i marcatori di superficie selezionati siano compatibili con i reagenti di fissazione e permeabilizzazione. Le cellule devono essere in sospensione per l'analisi del fosforo, tuttavia il protocollo può essere adattato alle cellule aberranti o ai tessuti seguendo procedure per ottenere la sospensione a singola cellula, come l'intera tripzinazione.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per l'analisi da media ad alta produttività di eventi di fosforilazione proteica a livello cellulare mediante citometria a flusso fosfo-specifica. Questo metodo è efficace per caratterizzare anomalie del segnale, identificare e validare biomarcatori e valutare la farmacodinamica.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Biologia cellulare
- Immunologia
- Trasduzione del segnale
Sfondo
- La citometria a flusso fosfo consente l'analisi del segnale a livello di singola cellula.
- Questa tecnica può chiarire come i percorsi di segnalazione siano influenzati da diversi stimoli o farmaci.
- È adatta per analisi da media ad alta produttività.
- Il metodo migliora la capacità di studiare le risposte cellulari a un livello dettagliato.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo affidabile per l'analisi della fosforilazione delle proteine.
- Facilitare l'identificazione di biomarcatori nella segnalazione cellulare.
- Valutare la farmacodinamica di diversi trattamenti.
Metodi Utilizzati
- Le cellule vengono risospese in mezzo RPMI 16/40 integrato.
- Una quantità specificata di sospensione cellulare viene trasferita in una piastra a 96 pozzetti con fondo a V.
- La piastra viene incubata in un bagno termico preriscaldato a 37 gradi Celsius.
- Viene aggiunto il buffer fisso per preparare la piastra da fissare per l'analisi.
Risultati principali
- Il metodo consente un'analisi efficiente delle vie di segnalazione.
- Fornisce informazioni sugli effetti dei farmaci sulla segnalazione cellulare.
- La risoluzione a singola cellula migliora la comprensione delle risposte cellulari.
- I risultati possono portare all'identificazione di potenziali bersagli terapeutici.
Conclusioni
- La citometria a flusso fosfo-specifica è uno strumento prezioso per lo studio della fosforilazione delle proteine.
- Il protocollo consente un'analisi ad alto rendimento, rendendolo accessibile per varie applicazioni di ricerca.
- Studi futuri possono basarsi su questo metodo per esplorare reti di segnalazione complesse.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La citometria a flusso fosfo-specifica con codifica a barre fluorescente delle cellule consente l'analisi single-cellula a media o alta produttività della fosforilazione proteica, supportando la validazione di bersagli e la scoperta di biomarcatori in oncologia e immunologia. Quantificando le variazioni del segnale indotte dai farmaci a risoluzione single-cellula, questo metodo aumenta la sicurezza predittiva nei modelli preclinici e orienta le decisioni di proseguimento o interruzione nello sviluppo terapeutico. La sua compatibilità con l'hardware standard dei citometri ne permette l'integrazione scalabile nei flussi di lavoro di scoperta per l'analisi dei percorsi di segnalazione e la valutazione farmacodinamica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Indaga ipotesi terapeutiche misurando la dinamica della fosforilazione di proteine di segnalazione a valle di recettori come il recettore della cellula B in cellule rilevanti per la malattia.
- Valore operativo: Consente la validazione funzionale di bersagli mediante la rilevazione multiplex di 20 molecole di segnalazione in cellule primarie derivate da pazienti in condizioni stimolate e inibite.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio identificando nodi alterati come AKT pS473 e STAT3 pY705 che si correlano con meccanismi di sensibilità e resistenza ai farmaci.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prontezza del saggio: La codifica fluorescente delle cellule consente l'unione di più campioni e condizioni in un singolo tubo, aumentando la produttività e riducendo la variabilità tra un'analisi e l'altra sui citofluorimetri standard.
- Output quantitativo: Genera dati con risoluzione a livello di singola cellula sui livelli di fosforilazione, permettendo analisi dose-risposta di inibitori delle chinasi come l'idelalisib in modelli di LLC.
- Riutilizzo della piattaforma: Passaggi standardizzati di fissazione, permeabilizzazione e marcatura con anticorpi facilitano l'adattamento a diversi tipi di cellule immunitarie e a diversi paradigmi di stimolazione per campagne di screening longitudinali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Utilizza cellule primarie di pazienti con LLC per modellare alterazioni della segnalazione, fornendo un sistema clinicamente rilevante per la valutazione di terapie mirate.
- Continuità traslazionale: Collega la risposta farmacologica ex vivo alla scoperta di biomarcatori correlando la riduzione di pS473 allo stato di mutazione di IGVH, sostenendo strategie di stratificazione dei pazienti.
- De-risking meccanicistico: Dimostra il ripristino della segnalazione alterata mediante inibizione di PI3Kδ, validando l'interazione con il bersaglio e il meccanismo d'azione degli inibitori delle chinasi in modelli preclinici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione iniziale della proteina bersaglio, attraverso l'ottimizzazione del composto leader, fino ai test di efficacia preclinica, in particolare nei programmi di immunologia e oncologia incentrati su modulatori della trasduzione del segnale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi quantificando le variazioni della fosforilazione indotta da stimoli in linfociti B umani primari, chiarificando gli stati di attivazione delle vie di segnalazione in condizioni basali e in presenza di farmaci.
- Screening: Permette una valutazione riproducibile e multiplex degli effetti dei composti sulle reti di segnalazione, con codici a barre che facilitano il confronto diretto tra diverse concentrazioni, tempi di esposizione e contesti genetici.
- Analisi: Fornisce letture quantitative della fosforilazione a livello di singola cellula che consentono il confronto statistico degli stati di segnalazione tra diverse condizioni, supportando la definizione delle soglie per i biomarcatori e la classificazione delle risposte.
- Ricerca traslazionale: Collega la risposta al farmaco in vitro alla validazione di biomarcatori ex vivo utilizzando campioni primari di LLC, in linea con i criteri di transizione da preclinico a clinico.
- Riutilizzo aziendale: Un pannello di reagenti standardizzato e una strategia di codifica a barre consentono il riutilizzo in progetti diversi che studiano la segnalazione mediata da citochine, l'attivazione del recettore per l'antigene o il meccanismo d'azione dei farmaci in popolazioni cellulari immunitarie e tumorali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica collegando la stimolazione del recettore alla fosforilazione dell'effettore a valle con risoluzione a singola cellula in campioni primari eterogenei.
- Valore operativo: Un flusso di lavoro standardizzato con codifica a barre aumenta la capacità di elaborazione dei campioni, minimizza la varianza tecnica e massimizza l'utilizzo dello strumento sulle piattaforme di citometria a flusso esistenti.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto fornendo evidenze precoci di modulazione del bersaglio e inibizione della via, riducendo gli investimenti in composti con attività biologica insufficiente.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei candidati in base al coinvolgimento del bersaglio e alla normalizzazione della segnalazione in cellule umane rilevanti per la malattia, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in citometria a flusso, titolazione degli anticorpi e validazione di reagenti specifici per fosfoepitopi, per garantire la specificità del segnale e ridurre al minimo il rumore di fondo.
- È vincolato all'accesso a citometri a flusso dotati di configurazione adeguata di laser e detector, necessaria per l'analisi multiparametrica di marcatori fosfo-specifici e di superficie.
- Necessita di una standardizzazione delle fasi di fissazione, permeabilizzazione e lavaggio tra diversi operatori e sedi, al fine di mantenere la riproducibilità dei segnali di fosforilazione.
- Richiede l'ottimizzazione delle concentrazioni dei reagenti per la codifica a barre al fine di evitare sovrapposizioni spettrali e garantire una corretta separazione dei campioni durante l'analisi.
- È limitato a cellule in sospensione; campioni adesivi o di tessuto richiedono una dissociazione preventiva in sospensione monocellulare, mediante metodi enzimatici o meccanici validati.
