Name: Misurazione del consumo dellossigeno mitocondriale del fegato e cinetica di perdita del protone per stimare la respirazione mitocondriale nei bovini da latte Holstein (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-30T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Scopri come misurare il consumo di ossigeno mitocondriale nel fegato di bovine Holstein per valutare l'efficienza energetica e la perdita di protoni. Questo metodo diretto migliora la precisione nello studio della funzione mitocondriale.

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Questa ricerca è stata sostenuta dai fondi Alltech e USDA Hatch attraverso il centro per la salute di cibo animale presso UC Davis School of Veterinary Medicine.

Tutti i metodi, protocollo e studi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della University of California, Davis.
1. ottenere una biopsia del fegato da una mucca da latte dell'Holstein
Nota: Una biopsia del fegato deve essere eseguita da un veterinario autorizzato. Le biopsie del fegato possono essere eseguite sul sito latteria dove si trovano le mucche. Vacche da latte in lattazione possono continuare a essere munte normalmente e latte non deve necessariamente essere ritirata dall'approvvigionamento di cibo, prima o dopo la procedura. È consigliabile che almeno 4 persone sono necessari per eseguire la biopsia del fegato su una mucca da latte: un veterinario per eseguire la biopsia, un gestore di animale a stare a fianco della mucca per proteggere la zona di biopsia e veterinario, un tecnico di laboratorio all'esterno della penna per trasf er di strumenti, materiali e biopsia del campione da e per il veterinario e mantenere la zona pulita, che può essere nella parte posteriore di un veicolo (Figura 1) e un tecnico per recuperare il campione epatico e iniziare isolamento mitocondriale.
<ol><li>Un mese prima le biopsie del fegato, dare le mucche una vaccinazione di clostridi. Creare pacchetti di chirurgiche di asciugamani chirurgico di sterilizzazione in autoclave, strumento di biopsia, titolari di bisturi e apparecchiature chirurgiche.</li>
	<li>Un giorno prima della biopsia del fegato, iniettare la mucca con Ceftiofur cloridrato 0,044 mL/kg di peso corporeo per via sottocutanea nel collo. Monitorare la temperatura della mucca, assunzione e fecali punteggi da utilizzare come base per la funzione normale.</li>
	<li>Creare i mitocondri isolamento media (MIM) contenenti 220 mM mannitolo, saccarosio 70 mM, 20 mM HEPES, 1 mM EDTA e 0,1% (p/v) dell'acido grasso libero BSA, a pH 7,4 a 4 ° C. Saranno necessari circa 30 mL per campione.</li>
	<li>Trattenga mucca fisicamente utilizzando un headlock con una cavezza come necessario (Figura 2). Usando la cavezza, legare la testa sul lato sinistro del tubo portante. Se necessario, un sistema di ritenuta chimica (xilazina cloridrato 100 mg/mL IV a 0,010-0,015 mg/kg di peso corporeo) può essere utilizzato.</li>
	<li>L'area della biopsia si trova presso lo spazio intercostale di destra 10 - 11 (Figura 3). Disegnare una linea retta da coxae di tubero giusto al punto della spalla destra. Il sito di biopsia è dove questa linea si interseca con il 10-11 ° spazio intercostale. Sterilizzare la zona della mucca per essere sottoposte a biopsia di rasatura un'area quadrata di 10 cm (Figura 4). Lavare la zona con 10% providone scrub (Figura 5) con un movimento circolare. Nebulizzare con soluzione di etanolo 70% (Figura 6). Ripetere lavaggi providone ed etanolo. Nota: Il fegato è in una posizione leggermente diversa nel bovino da latte Holstein rispetto ai bovini da carne.</li>
	<li>Iniettare lidocaina 2% HCl (10-15 mL) localmente nella zona per fornire l'anestesia della pelle e del muscolo sottostante e del tessuto connettivo (Figura 7). Ripetere providone e lavaggi di etanolo 70%. Nota: Le terminazioni nervose sono in pelle e muscoli, ma non interni organi, così solo un locale anesthestic sono necessario. Al massimo, la mucca dovrebbe sentire solo un po' di pressione e nessun dolore durante la procedura di biopsia.</li>
	<li>Fare un'incisione di 1-2 cm attraverso la pelle dello spazio intercostale 10-11 (Figura 8). Passare uno strumento di biopsia del fegato bovino Schackelford-Courtney attraverso la pelle e diretto strumento di biopsia in senso craniale leggero pur continuando attraverso il diaframma e nel fegato (Figura 9, Figura 10). Ottenere un campione di 1 g di fegato e rimuovere lo strumento (Figura 11). Chiudere la pelle con posizionamento della sutura (Figura 12).</li>
	<li>Fegato di collocare il campione in una provetta conica con abbastanza MIM per coprire il campione, il ghiaccio per l'isolamento dei mitocondri immediato</li>
	<li>Incisione di controllo per qualsiasi arrossamento, gonfiore, calore, o dolore entro 24 ore dalla biopsia e iniettare la mucca con Ceftiofur cloridrato 0,044 mL/kg di peso corporeo per via sottocutanea nel collo una volta al giorno per i prossimi 3 giorni (Figura 13). Monitorare quotidianamente la mucca temperatura, assunzione e punteggi fecale per 1 settimana dopo la biopsia del fegato. Se si sviluppa una febbre, è possibile continuare gli antibiotici a discrezione del veterinario. Nota: Se una mucca è che presentino segni di dolore, come calci presso il sito di incisione, recumbancy, arrossamento, calore o reazione al tatto entro 1 h dopo la biopsia del fegato, un'iniezione di IV 1 mg/kg di peso corporeo di flunixin meglumine può essere utilizzato per alleviare il dolore e l'infiammazione. Una seconda iniezione può essere somministrata se necessario.</li>
	<li>Rimuovere le suture 7 giorni dopo la biopsia.</li>
</ol>2. isolare i mitocondri da fegato di mucca da latte
<ol><li>Appena possibile dopo l'esempio del fegato è stato rimosso dalla mucca, lavare il campione epatico in MIM (punto 1.3) per rimuovere le cellule di anima rosse e tritare finemente il campione con le forbici. Il fegato deve essere tritato in un bicchiere ghiacciato contenente sufficiente supporto di isolamento per mantenere il tessuto umido.</li>
	<li>Inserire il fegato tritato in un flaconcino di vetro di 30ml con un pestello di teflon della clearance di 0.16 mm incubati in ghiaccio e contenente MIM (1:4 w/v).</li>
	<li>Omogeneizzare il campione epatico nel pestello teflon a 500 giri/min per un min con 4 colpi/min. Nota: L'omogenati di fegato sono mantenuto in un becher da ghiaccio-pranzo in MIM durante l'intero processo, e tutti i seguenti passaggi di centrifugazione sono stati completati a 4 ° C</li>
	<li>Centrifugare omogeneato a 500 x g per 10 min, scartare pellet, trasferire il surnatante in una provetta da centrifuga refrigerata e poi Centrifugare il surnatante risultante a 10.000 x g per 10 min ottenere il pellet mitocondriale.</li>
	<li>Risospendere e lavare la pallina in 10 mL di MIM con acido grasso libero BSA e centrifugare a 8100 x g per 10 min. Discard surnatante.</li>
	<li>Risospendere e lavare la pallina in 10 mL di MIM senza acido grasso libero BSA e centrifugare a 8100 x g per 10 min. Discard surnatante.</li>
	<li>Sospendere il pellet in 200 µ l di media di isolamento e metterli su ghiaccio fino a quando non utilizzato per il consumo di ossigeno e test di cinetica enzimatica perdita del protone.</li>
	<li>Determinare la concentrazione nella proteina della sospensione della pallina (diluizione 1/100) utilizzando il kit di (BCA) acido bicinconinico secondo il protocollo del produttore con BSA come standard. Tutte le proteine sono considerata proteina mitocondriale.</li>
</ol>3. misurare il consumo di ossigeno mitocondriale (stato 4 3 e statali)
<ol><li>Creare supporti di consumo di ossigeno (OCM) da 120 mM KCl, 5mm KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes e 1 mM EGTA, pH 7,4 a 30 ° C con 0.3% disoleate BSA. Saranno necessari circa 3 mL per campione. Anche preparare una soluzione di 8 μg/mL oligomycin in etanolo.</li>
	<li>Incubare OCM a 30 ° C. Impostare elettrodo di camera, pompa e ossigeno di respirazione secondo le indicazioni del produttore (sistema oxygraph). Il software di oxygraph dovrebbe già essere installato sul computer.</li>
	<li>Posizionare 1 mL di OCM nella camera di respirazione e mescolare energicamente. Questo vi aiuterà a garantire che la soluzione diventa saturo di aria.</li>
	<li>Aggiungere una proteina 0,35 mg di proteina mitocondriale alla camera di respirazione e mantenere la temperatura a 30 ° C.</li>
	<li>Registrare il consumo di ossigeno per circa 5 min. La concentrazione di ossigeno oxygraph record di sistema così come aumenti di respirazione, concentrazione di ossigeno diminuisce. Quando il consumo di ossigeno diventa costante (una linea retta decrescente), consumo di ossigeno record (pendenza della retta = concentrazione di ossigeno/ora). Si tratta di consumo di ossigeno basale.</li>
	<li>1.25 µ l di soluzione di rotenone di 4 mM per inibire complesso ho e quindi aggiungere 5 µ l di soluzione di succinato di 1 M per raggiungere una concentrazione finale nella camera respiratoria di succinato di 5 mM. Si tratta di respirazione di stato 4.</li>
	<li>Aggiungere 1 µ l di soluzione di ADP 100 mM per raggiungere una concentrazione finale nella camera di respirazione di 100 μM. Concentrazione di ossigeno diminuisce (respiratorio aumentato) e poi dopo circa 5 minuti diventa una linea retta. Registrare il consumo di ossigeno (pendenza della retta = concentrazione di ossigeno/ora). Questo è stato 3 respirazione.</li>
	<li>Opzionale: Al termine della corsa, aggiungere FCCP (volume totale di 0,2 μM) per indurre la massima respirazione. Registrare la respirazione per circa 5 min (circa). Quando il consumo di ossigeno diventa consumo di ossigeno costante, record. Si tratta di massimo consumo di ossigeno.</li>
	<li>Calcolare il rapporto respiratorio di controllo (RCR) utilizzando l'equazione di stato 3 consumo di ossigeno / stato 4 consumo di ossigeno.</li>
	<li>Aspirare tutte le soluzioni nella camera di respirazione. Sciacquate la vaschetta più volte con acqua deionizzata doppia.</li>
</ol>4. misurare il potenziale di membrana mitocondriale (MMP) e forza motrice protonica (PMF)
<ol><li>Preparare la soluzione di 80 ng/mL Nigericina in etanolo. Nota: Questi prodotti chimici sono dissolti in etanolo, e ogni sforzo dovrebbe essere fatto per limitare la quantità di etanolo che viene aggiunto a meno di 1 μL, poiché etanolo può disgiungere il sistema di trasporto dell'elettrone e causare la disfunzione di l.</li>
	<li>Dopo aver sciacquato accuratamente la camera con doppia acqua deionizzata, posizionare 1 mL di OCM nella camera di respirazione e mescolare energicamente con un ancoretta magnetica. Questo vi aiuterà a garantire che la soluzione diventa saturo di aria. Aggiungere metil-Trifenil-fosfonio (TPMP +) sensibile elettrodo per camerare installazione. TPMP + elettrodo deve essere collegato ad un misuratore di pH e valori vengono letti dal pH-metro.</li>
	<li>Aggiungi 0,35 mg di proteina mitocondriale alla camera di respirazione.</li>
	<li>1.25 µ l di soluzione di rotenone di 4 mM per inibire la respirazione del complesso I. Record per 2-5 min (circa). Quando il consumo di ossigeno diventa consumo di ossigeno costante, record.</li>
	<li>Aggiungere 0,56 μL di soluzione di oligomycin 8 μg/mL per una concentrazione finale di 2,8 µ g oligomycin 0,35 mg di proteina mitocondriale di inibire l'utilizzo di ADP. Registrare la respirazione per 2-5 min (circa). Quando il consumo di ossigeno diventa consumo di ossigeno costante, record.</li>
	<li>Aggiungere 0,112 μL 80 ng/mL Nigericina soluzione per abolire il gradiente di pH attraverso la membrana mitocondriale interna. Registrare la respirazione per 2-5 min (circa). Quando il consumo di ossigeno diventa consumo di ossigeno costante, record. Nota: Rotenone e oligomycin sono usati per bloccare il trasporto di elettroni della catena nel complesso io e trifosfato di adenosina synthase, rispettivamente. Nigericina viene aggiunto per convertire transmembrana H + sfumatura in una sfumatura di K + che può essere misurata con un elettrodo.</li>
	<li>Preparare una curva standard per TPMP + aggiungendo 5 µ l di soluzione TPMP + 10 mM per l'incubazione mitocondriale. Ripetere questo passaggio quattro volte fino a una concentrazione totale di 2,5 μM TPMP + è stato aggiunto.</li>
	<li>Avviare la respirazione aggiungendo 5 μL di 1m succinato alla camera.</li>
	<li>Registrare la respirazione fino a quando non avete raggiunto una traccia stabile, e quindi titolare il sistema aggiungendo malonato. Aggiunte di malonato dovrebbero essere 1 µ l, 0,5 µ l, 1,5 µ l, µ l 3,0, 6,0 µ l, µ l 9.0, quindi 12,5 µ l della 0,1 malonato soluzione per raggiungere aggiunte successive di malonato concentrazioni nella camera di incubazione di 0.1, 0.2, 0.3, 0.6, 1.2, 1.8 e 2,5 mM.</li>
	<li>Raccogliere dati dai due elettrodi (ossigeno e TPMP+). Software di acquisizione dati dal sistema oxygraph consente di raccogliere misurazioni simultanee di consumo di ossigeno mitocondriale e potenziale di membrana mitocondriale e osservare i cambiamenti nel consumo di ossigeno in tempo reale. La figura 14 Mostra come il sistema di oxygraph registra il consumo di ossigeno come il procedere dell'esperimento.</li>
	<li>Calcolare MMP in base all'equazione di Nernst mV: MMP = 61,5 log ([TPMP +] aggiunto – esterno [TPMP +]) correzione associazione x TPMP+ / (x 0.001 mg di proteina/mL x [TPMP +]) Una correzione di associazione TPMP + 0,4 µ l/mg di proteina mitocondriale-1 viene utilizzata. Esempio di calcolo basato sulle concentrazioni nel protocollo: MMP = log x 61,5 (5 µM – 2 µM) x 0,4 / (0,001 x 0,35 mg proteina mitocondriale/mL x 2 µM) MMP = 198,9 mV</li>
	<li>Stima PMF tracciando un grafico MMP vs del consumo di ossigeno (Figura 15). PMF è segnalato come consumo di ossigeno a un potenziale di membrana di 165 mV. Nota: Titolazione della catena di trasporto degli elettroni con malonato (0.1-2.5 mM) Mostra la risposta cinetica di perdita protonica di MMP. Quindi, tramando MMP contro il consumo di ossigeno determina cinetica di perdita del protone. PMF è determinato calcolando il consumo di ossigeno a un potenziale di membrana comune (165 mV).</li>
	<li>Alla fine dell'ultima esecuzione del campione, aggiungere FCCP (volume totale di 0,2 μM) per indurre la massima respirazione e rilasciare TPMP + per la correzione della linea di base.</li>
	<li>Aspirare tutte le soluzioni nella camera di respirazione. Sciacquate la vaschetta più volte con acqua deionizzata doppia. Alla fine della giornata, la camera anche lavare un paio di volte con etanolo.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il punto più critico nel protocollo è ottenere un campione rappresentativo del tessuto del fegato e cominciando l'isolamento dei mitocondri più presto possibile dopo la biopsia. Variazione nelle misurazioni di respirazione è bassa (tabella 1) a causa di un tempo breve trasporto dalla mucca al laboratorio. Per ridurre i tempi di trasporto, un piccolo laboratorio è stato istituito presso l'ufficio del caseificio, e campioni di fegato sono stati guidati al laboratorio ufficio come ciascuno è stato raccolto ...

I mitocondri sono molto sensibili allo stress e loro ambiente cellulare può contribuire a una vasta gamma di malattie metaboliche. Consumo di ossigeno e perdita di protoni in mitocondri sono indicatori della salute di mitocondri. I metodi descritti in questa efficienza energetica mitocondriale di carta stima utilizzando RCR basano sul consumo di ossigeno con e senza perdita di protoni. Questi risultati possono rappresentare 30% dell'energia perdita in utilizzazione nutriente1. Cambiamenti nella perdita del protone e consumo di ossigeno possono identificare la disfunzione mitocondriale che contribuisce alla malattia metabolica e si traduce in una riduzione dell'efficienza energetica. Questi metodi possono essere utilizzati anche per esaminare l'effetto di trattamenti diversi su respirazione mitocondriale. L'obiettivo generale di misurare il consumo di ossigeno mitocondriale e cinetica di perdita del protone è di valutare la funzione mitocondriale ed efficienza energetica.
Disfunzione mitocondriale epatica è stata associata con parecchie malattie nei bovini da latte. La capacità del metabolismo cellulare per passare tra combustibili del carboidrato e del lipido di fronte a un deficit energetico in lattazione iniziale è influenzata dal numero e dalla funzione dei mitocondri in cellule2. Difetti nella capacità di adattarsi a un aumento della domanda di energia e β-ossidazione aumentata dei mitocondri possono portare ad accumulo di lipidi intracellulari associati con insulino-resistenza e possono portare alla formazione di fegato grasso nelle vacche da latte di inizio lattazione. I mitocondri, come il sito di produzione di corpi chetonici e l'uso, possono giocare un ruolo chiave in chetosi nelle vacche da latte3. Una mancanza di mitocondri o disfunzione mitocondriale urterà la disponibilità di carburante alla periferia e rifletteva in variazioni di consumo di ossigeno o RCR.
Modifiche di consumo di ossigeno mitocondriale in risposta ad infiammazione. Sette-giorno-vecchio polli da carne sono stati assegnati a un gruppo infettato da Eimeria maxima e un gruppo di controllo4. Polli da carne che non subissero sfida coccidiosi aveva più basso consumo di ossigeno a causa di perdita di protone e RCR superiore che indica che i mitocondri del fegato rispondano ad una sfida immune da crescente perdita di protoni. Durante la perdita di protone e reattiva produzione di specie di ossigeno una volta era considerata un segno di disfunzione mitocondriale della membrana e dannosa per l'efficienza energetica, ora è conosciuto che è importante per l'importazione di proteine e di calcio in mitocondri5 e per la generazione di calore1.
Perdita di elettroni dalla catena respiratoria rende i mitocondri suscettibile di produzione di specie reattive dell'ossigeno ed il danno ossidativo alle proteine della membrana mitocondriale, lipidi e DNA mitocondriale. Come età di mitocondri, danno può accumularsi soprattutto al mtDNA causando ulteriore disfunzione nel metabolismo mitocondriale6 e una maggiore suscettibilità della mucca alla malattia. In pratica, molti animali da allevamento sono alimentati alti livelli di integratori come Cu, Zn e Mn per amplificare la funzione antiossidante. Tuttavia, d'alimentazione alti livelli di Cu, Zn e Mn diminuita produzione di latte e aumento del consumo di ossigeno a causa di protone perdita (stato 4 respirazione)7.
Precedenti ricerche sul ruolo della funzione mitocondriale dell'efficienza energetica nei bovini è focalizzata sui cambiamenti nel consumo di ossigeno mitocondriale e perdita di protoni. Molto pochi studi sono stati pubblicati nei bovini da latte e la maggior parte delle carte confrontare l'efficienza di produzione sotto forma di assunzione di mangime residuo (RFI) per la funzione mitocondriale in bovini da carne. Variabilità nella respirazione mitocondriale tariffe sono state esaminate misurando stato 3 4 e RCR in fegati da vacche Holstein in lattazione e allattamento manzo mucche (Angus, Hereford and Brangus)8. I ricercatori non hanno trovato alcuna correlazione nella respirazione mitocondriale con crescita o mungitura tratti per bovini da carne, ma hanno dato una correlazione tra la respirazione mitocondriale e tratti per Holsteins di mungitura. In due studi, RFI è stato confrontato in bovini da carne a tasso di respirazione mitocondriale (stato 3, stato 4 e RCR) nel muscolo mitocondri9,10. Tassi di respirazione mitocondriale ha cambiato in risposta a DMI e tassi bassi sono stati associati con meno efficiente manzo manzi. In un altro studio, RFI di manzi da tori RFI alte o basse sono stati confrontati con i tassi di respirazione mitocondriale e cinetica di perdita del protone fra i due gruppi di progenie11. Le differenze erano dovuto guadagno conferma la conclusione che guadagno fa non respirazione mitocondriale di impatto nei bovini da carne.
In questa carta, un esperimento esame fegato RCR in risposta all'alimentazione 3 minerali antiossidanti per bovini da latte durante l'allattamento viene illustrato l'utilizzo di metodi per misurare il consumo di ossigeno durante stato 4 e stato 3 PMF e respirazione.

<table><tbody><tr><td>Biopsia epatica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schackelford-Courtney strumento per biopsia epatica bovina</td><td>Sontec Instruments Englewood CO</td><td>1103-904</td><td></td></tr><tr><td>Sutura</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-037-516</td><td></td></tr><tr><td>Aghi da sutura</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Inclusi con bisturi da sutura</td></tr><tr><td></td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S2896 / S2646</td><td># per manico e lame</td></tr><tr><td>Asciugamani chirurgici</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-129-6667</td><td></td></tr><tr><td>Provette Falcon 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>Z168750</td><td></td></tr><tr><td>siringhe da 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-314387</td><td></td></tr><tr><td>Aghi per iniezione (22, 2 1/2)</td><td>VWR</td><td>MJ8881-200342</td><td></td></tr><tr><td>cavezza per mucche</td><td>Tractor Supply Co.</td><td></td><td></td>101966599</tr><tr><td>Cotton Swabbing</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-102</td><td></td></tr><tr><td>quadrati di garza di cotone (4x4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-246069</td><td></td></tr><tr><td>Forbici mediche</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>Z265969</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coccidiosis Vaccine 0.75 bottiglia/mucca</td><td></td><td></td><td>Fornito da Veterinario</td></tr><tr>Vaccino <td></td><td></td><td>contro i clostridi</td><td>Fornito dal veterinario</td></tr><tr><td>Biopsia epatica antibiotici eccenel 2 cc/100 libbre per 3 giorni</td><td></td><td></td><td>Fornito dal veterinario</td></tr><tr><td>Providone Scrub</td><td>Aspen Risorse veterinarie</td><td>21260221</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo 70%</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>793213</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina cloridrato 100 mg/mL EV a 0,010-0,015 mg/kg peso</td><td></td><td></td> corporeo <td>Fornito dal veterinario</td></tr><tr><td>2% lidocaina HCl (10-15 ml)</td><td></td><td></td><td>Fornito dal veterinario</td></tr><tr><td>1 mg/kg di iniezione endovenosa di flunixina meglumina</td><td></td><td></td><td>Fornito dal veterinario</td></tr><tr><td>Isolamento dei mitocondri (fegato)<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>strong>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiala di Wheaton da 30 mL con pestello in teflon con spazio di 0,16 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-911-527</td><td></td></tr><tr><td>Omogeneizzatore Motore</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-04369-10</td><td></td></tr><tr><td>Omogeneizzatore Sonda</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-04468-22</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta automatica (10 mL)</td><td>Cole Parmer</td><td>SK-21600-74</td><td></td></tr><tr><td>Becher (500 mL) con ghiaccio</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB100600</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge refrigerato</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-002-441EW3</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microfuge (1,5 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio delle proteine dell'acido bicinchoninico (BCA) (micropiastre per lettore di piastre)</td><td>abcam</td><td>ab102536</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S7903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>EDS-1KG</td><td></td></tr><tr><td>BSA (senza acidi grassi)</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>Mannitolo</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>M4125-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Acqua deionizzata</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>38796</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>Utilizzare per creare terreni di isolamento dei mitocondri: 220 mM di mannitolo, 70 mM di saccarosio, 20 mM di HEPES, 20 mM di Tris-HCl, 1 mM di EDTA e 0,1% (p/v) di BSA privo di acidi grassi, pH 7,4 a 4 gradi; C, durerà 2 giorni in frigorifero</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Consumo di ossigeno mitocondriale</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Attrezzatura</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oxygraph Setup + Elettrodo di ossigeno tipo Clark</td><td>Hansatech (PP Systems)</td>Pompa dell'acqua termoregolata <td>OXY1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ADInstruments</td><td>MLE2001</td><td></td></tr><tr><td>Elettrodo di ossigeno tipo Clark</td><td>NA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NA Autopipetta (1 mL)</td><td>Cole Parmer</td><td>SK-21600-70</td><td>Incluso con Oxy1</td></tr><tr><td>Piccola ancoretta magnetica Fisher</td><td>Scientific</td><td>14-513-95</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetta (10 &mu; L)</td><td>Cole Parmer</td><td>SK-21600-60</td><td></td></tr><tr><td>pHmetro</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P9333-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P5655-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>M1028-100ML</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>E3889-100G</td><td></td></tr><tr><td>Utilizzare per produrre terreni di consumo di ossigeno mitocondriale: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes e 1 mM EGTA,&nbsp; pH 7,4 a 30 gradi; C con 0,3% sgrassato BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotenone (soluzione da 4 mM)</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>R8875-5G</td><td></td></tr><tr><td>Succinato (soluzione da 1 M)</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S3674-250G</td><td></td></tr><tr><td>ADP (soluzione da 100 mM)</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A5285-1G</td><td></td></tr><tr><td>Oligomicina (soluzione da 8 &mu; g/mL in etanolo)</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>Potenziale di membrana mitocondriale e forza motrice del protone</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TPMP elettrodo</td><td>World Precision Instruments.</td>Le soluzioni chimiche <td>DRIREF-2</td><td></td></tr><tr><td> non devono essere fresche, ma devono essere conservate in congelatore tra una tiratura e l'altra</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Malonato (soluzione 0,1 mM)</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>M1296</td><td></td></tr><tr><td>Oligomicina (8 &mu; g/mL in etanolo), conservare in congelatore</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin (80 ng/mL in etanolo), conservare in congelatore</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>N7143</td><td></td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C3920</td><td></td></tr><tr><td>TPMP</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>T200</td><td></td></tr><tr><td>TPMP soluzione: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes e 1 mM EGTA,&nbsp; pH 7,4 a 30 gradi; C con BSA</td><td></td><td></td><td></td> sgrassato allo 0,3%</tr></tbody></table>

misurazione del consumo dell'ossigeno mitocondriale del fegato e cinetica di perdita del protone per stimare la respirazione mitocondriale nei bovini da latte holstein

Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

Consumo di ossigeno, (PMF) della forza motrice protonica e perdita del protone sono misurazioni di respirazione mitocondriale, o quanto bene i mitocondri sono in grado di convertire NADH e FADH in ATP. Poiché i mitocondri sono anche il luogo primario per l'uso di ossigeno e nutrienti ossidazione ad anidride carbonica e acqua, quanto efficientemente usano ossigeno e produrre ATP direttamente riguarda l'efficienza del metabolismo dei nutrienti, esigenze nutrizionali dell'animale, e salute dell'animale. Lo scopo di questo metodo è quello di esaminare la respirazione mitocondriale, che può essere utilizzata per esaminare gli effetti di diversi farmaci, le diete e gli effetti ambientali sul metabolismo mitocondriale. I risultati includono consumo di ossigeno misurato come respirazione dipendente protone (stato 3) e protone perdita dipendente respirazione (stato 4). Il rapporto della respirazione 4 3 / stato stato è definito come rapporto di controllo respiratorio (RCR) e può rappresentare l'efficienza energetica mitocondriale. Perdita di mitocondriale del protone è un processo che permette la dissipazione del potenziale di membrana mitocondriale (MMP) da disgiungere fosforilazione ossidativa da ADP diminuendo l'efficienza della sintesi di ATP. Ossigeno e TRMP + elettrodi sensibili con substrati mitocondriali e inibitori della catena di trasporto degli elettroni sono utilizzati per misurare State 3 e 4 di stato respirazione, membrana mitocondriale PMF (o il potenziale di produrre l'ATP) e perdita del protone. Limitazioni a questo metodo sono che il tessuto del fegato deve essere più fresco possibile e tutte le biopsie e le analisi devono essere eseguite in meno di 10 ore. Questo limita il numero di campioni che possono essere raccolti ed elaborati da una sola persona in un giorno per circa 5. Tuttavia, è necessario solo 1 g di tessuto del fegato, quindi in grandi animali, come bovini da latte, la quantità di campione necessaria è piccola rispetto alle dimensioni del fegato e c'è poco tempo di recupero necessario.

Risultati positivi risultati RCR e protone perdita cinetica sono mostrati in tabella 1 e Figura 15, rispettivamente. In questo studio7, RCR e proteina perdita cinetica sono stati misurati in vacche Holstein a 70 giorni nel latte dopo le mucche erano state alimentate 1 di 5 diversi livelli di Cu, Zn e Mn per 28 giorni. Stato 4, respirazione di protone massima perdita-dipendente, aveva la tendenza a essere influenzato da...

Qui, si condividono i metodi di misurazione del consumo di ossigeno mitocondriale, un concetto di definizione di energetica nutrizionale e perdita di protone, la causa primaria di inefficienza nella generazione mitocondriale di ATP. Questi risultati possono rappresentare 30% di energia perdita nell'utilizzazione dei nutrienti per aiutare a valutare la funzione mitocondriale.

Misurazione del consumo dell'ossigeno mitocondriale del fegato e cinetica di perdita del protone per stimare la respirazione mitocondriale nei bovini da latte Holstein

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo energetico, come la salute mitocondriale, l'efficienza energetica e l'utilizzo di energia. Il principale vantaggio di questa tecnica è che il consumo di ossigeno dei mitocondri isolati viene misurato direttamente. I risultati non devono essere corretti per altri processi metabolici intracellulari.Abbiamo deciso per la prima volta di perseguire questo metodo nei bovini da latte quando volevamo esaminare in che modo l'efficienza mitocondriale influisce sull'efficienza dei mangimi. La dimostrazione video di questo metodo è fondamentale in quanto i passaggi nell'isolamento mitocondriale sono difficili da imparare perché devono essere coerenti e precisi. Il prima possibile dopo che il campione di fegato è stato rimosso dalla mucca lavare il campione in mezzi di isolamento mitocondri per rimuovere i globuli rossi.L'uso di forbici trita finemente il tessuto in un becher refrigerato che contiene abbastanza mezzi di isolamento per mantenere il tessuto umido. Trasferire il fegato tritato in una fiala di vetro da 30 millilitri contenente mezzi di isolamento dei mitocondri. Aggiungere un pestello di Teflon che ha una clearance di 0,16 millimetri e che è stato incubato nel ghiaccio e omogeneizzare il campione di fegato a 500 giri/min per un minuto con quattro colpi al minuto.Successivamente, trasferire l'omogeneato in un tubo contenente mezzi di isolamento dei mitocondri e posizionare questo in un becher pieno di ghiaccio. Centrifuga omogeneizzare a 500 volte G e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Scartare il pellet e trasferire il supernatante in un tubo di centrifuga refrigerato.Centrifugare il supernatante risultante a 10.000 volte G e quattro gradi Celsius per 10 minuti per ottenere il pellet mitocondriale. Resuspend e lavare il pellet in 10 millilitri di mezzi di isolamento dei mitocondri con BSA privo di acidi grassi. Quindi centrifugare a 8,100 volte G e quattro gradi Celsius per 10 minuti.Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in 200 microlitri di mezzi di isolamento. Mettere questo sul ghiaccio fino a quando non è pronto per l'uso per il consumo di ossigeno e test cinetici di perdita di protoni. Determinare la concentrazione proteica della sospensione a pellet utilizzando un kit di acido bicinchoninico per istruzioni del produttore utilizzando BSA come standard.In primo luogo, creare supporti di consumo di ossigeno come delineato nel protocollo di testo. Incubare il supporto di consumo di ossigeno a 30 gradi Celsius. Successivamente, impostare la camera di respirazione, la pompa e l'elettrodo di ossigeno per il sistema di ossimoro secondo le istruzioni del produttore.Quindi posizionare un millilitro di mezzi di consumo di ossigeno nella camera respiratoria. Quindi aggiungere 0,35 milligrammi di proteine mitocondriali alla camera. Mescolare vigorosamente per assicurarsi che la soluzione diventi satura d'aria e mantenere una temperatura di 30 gradi Celsius.Registrare il consumo di ossigeno per circa cinque minuti. Quando il consumo di ossigeno diventa costante rappresentato da una linea retta decrescente, registrarlo come consumo di ossigeno di base. Aggiungere 1,25 microlitri di una soluzione di rotenone a quattro millimolari per inibire uno complesso, quindi aggiungere cinque microlitri di una soluzione succinata molare per raggiungere una concentrazione finale di cinque succinati millimolari nella camera respiratoria.Questo è il consumo di ossigeno dello stato IV. Successivamente, aggiungere un microlitro di una soluzione ADP da 100 millimolare per raggiungere una concentrazione finale di 100 micromolari nella camera di respirazione. Il consumo di ossigeno diminuirà per circa cinque minuti e diventerà quindi una linea retta.Registrare questo consumo di ossigeno come respirazione di stato III. Calcolare il rapporto di controllo respiratorio come indicato nel protocollo di testo. Quindi aspirare tutte le soluzioni fuori dalla camera respiratoria.Risciacquare la camera più volte con doppia acqua deionizzata. In primo luogo, preparare una soluzione di 80 nanogrammi per millilitro di nigericina in etanolo limitando la quantità di etanolo aggiunto a meno di un microlitro. Inoltre, preparare una soluzione di otto microgrammi per oligomicina millilitro in etanolo.Dopo aver risciacquato accuratamente la camera con doppia acqua deionizzata, posizionare un millilitro del supporto di consumo di ossigeno nella camera di respirazione e mescolare vigorosamente con una barra di agitazione magnetica. Aggiungere 0,35 milligrammi di proteine mitocondriali alla camera respiratoria. Aggiungere un elettrodo metil tripfenilfosfonico sensibile alla configurazione della camera assicurandosi che l'altra estremità sia correttamente collegata a un misuratore di pH.Aggiungere 1,25 microlitri di una soluzione di rotenone da quattro millimolare per inibire il complesso I.Registrare la respirazione per due o cinque minuti. Registrare il valore di consumo di ossigeno quando diventa costante. Successivamente, aggiungere 0,56 microlitri di una soluzione di oligomicina per inibire l'utilizzo dell'ADP.Registrare la respirazione per circa due o cinque minuti. Registrare il valore di consumo di ossigeno quando diventa costante. Quindi aggiungere 0,112 microlitri di una soluzione di nigericina da 80 nanogrammi per millilitro per abolire il gradiente di pH attraverso la membrana interna mitocondriale.Registrare la respirazione per due o cinque minuti e notare il valore di consumo di ossigeno quando diventa costante. Aggiungere cinque microlitri di 10 millimolare soluzione di trifenilfosfonio all'incubazione mitocondriale per iniziare a preparare una curva standard. Ripetere questa aggiunta quattro volte in più fino a una concentrazione totale di 2,5.micromolare è stato aggiunto. Successivamente, aggiungere cinque microlitri di una soluzione di succinato molare alla camera per avviare la respirazione. Registrare la respirazione fino a ottenere una traccia stabile.Quindi aggiungere il malonato per titolare il sistema come delineato nel protocollo di testo. In questo studio, l'RCR e la cinetica della perdita di protoni vengono misurate nel latte delle vacche da latte Holstein 70 giorni dopo che le vacche da latte erano state nutrite con diversi livelli di rame, zinco e manganese per 28 giorni. La respirazione di Stato IV è considerata la più alta nelle mucche dati bassi livelli di manganese, ma è più bassa nelle mucche di controllo, indicando che il manganese svolge un ruolo importante nel ridurre al minimo la respirazione dipendente dalla perdita di protoni.L'analisi della respirazione epatica dipendente dalla perdita di protoni rivela che questa respirazione è maggiore nelle mucche trattate con manganese basso e le mucche di controllo più basse. Questi risultati confermano che il gruppo del manganese basso ha la più grande respirazione di stato IV mentre il gruppo di controllo ha il più basso. Mentre l'efficienza dei mangimi è più elevata nei manzi Angus nati da tori RFI bassi rispetto ai tori RFI alti, questo non si riflette nell'RCR mitocondriale o nella cinetica della perdita di protoni.Durante l'esecuzione di questa procedura è importante tenere tutte le fiale e i becher sul ghiaccio durante l'elaborazione dei mitocondri. Dopo il suo sviluppo questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della nutrizione lattiero-casearia per esplorare il ruolo dell'efficienza dei mitocondri nell'efficienza dei mangimi e nella funzione mitocondriale nel fegato. Non dimenticare che lavorare con rotenone può essere pericoloso e precauzioni come indossare guanti, protezione degli occhi e DPI adeguati dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.

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Fonte:Elettra Leo1, Luiza H.D. Cardoso1, Sabine Schmitt1, Erich Gnaiger11Strumenti OroborosQuesto video spiega come il flusso di ossigeno viene utilizzato per valutare la respirazione mitocondriale nelle cellule di mammifero viventi e permeabilizzate. Dimostra l'uso sequenziale della digitonina, dei substrati metabolici, dell'ADP, di un disaccoppiatore e di un inibitore per caratterizzare diversi stati respiratori. Il profilo del flusso di ossigeno risultante rivela la funzione mitocondriale e...

Misure del flusso di ossigeno per valutare la respirazione mitocondriale in cellule viventi e permeabilizzate

I metodi presentati forniscono istruzioni passo dopo passo per l'esecuzione di una raccolta di saggi respirometrici basati su micropiastre utilizzando mitocondri isolati da quantità minime di muscolo scheletrico di topo. Questi saggi sono in grado di misurare i cambiamenti/adattamenti meccanicistici nel consumo di ossigeno mitocondriale in un modello animale di uso comune.

Utilizzo di mitocondri isolati da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per High micropiastre rendimento respiratorie Misure

Ad alta risoluzione respirometria è utilizzato per determinare il consumo di ossigeno mitocondriale. Questa è una tecnica semplice per determinare mitocondriale complessi della catena respiratoria '(I-IV) frequenza respiratoria, la capacità del sistema di trasporto degli elettroni mitocondriale massima, e l'integrità della membrana mitocondriale esterna.

Ad alta risoluzione respirometria mitocondriale per valutare la funzione in permeabilizzate e cellule intatte

In questa carta, è descritto un metodo per misurare il consumo di ossigeno utilizzando ad alta risoluzione manometrica in permeabilized toraci di Drosophila. Questa tecnica richiede una minima quantità di tessuto rispetto alla tecnica classica isolamento mitocondriale e i risultati ottenuti sono più fisiologicamente rilevanti.

Misura del consumo di ossigeno mitocondriale nelle fibre Permeabilized di Drosophila utilizzando la minima quantità di tessuto

Abbiamo progettato e costruito un laboratorio mobile per misurare la frequenza respiratoria nei mitocondri isolati di animali selvatici catturati sul campo. Qui descriviamo la progettazione e l'allestimento di un laboratorio mitocondriale mobile e i protocolli di laboratorio associati.

Sviluppo di un laboratorio mobile di fisiologia mitocondriale per la misura dell'energetica mitocondriale sul campo

La respirometria ad alta risoluzione accoppiata a sensori di fluorescenza determina il consumo di ossigeno mitocondriale e la generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS). Il presente protocollo descrive una tecnica per valutare le frequenze respiratorie mitocondriali e la produzione di ROS nel nervo sciatico permeabilizzato.

Valutazione della funzione mitocondriale nel nervo sciatico mediante respirometria ad alta risoluzione

Descriviamo protocolli graduali che misurano la respirazione mitocondriale di neutrofili di topo e umani e cellule HL60 utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare metabolico.

Misurazione in tempo reale del profilo bioenergetico mitocondriale dei neutrofili

I cavalli hanno un'eccezionale capacità di esercizio aerobico, rendendo il muscolo scheletrico equino un tessuto importante sia per lo studio della fisiologia dell'esercizio equino che per la fisiologia mitocondriale dei mammiferi. Questo articolo descrive le tecniche per la valutazione completa della funzione mitocondriale nel muscolo scheletrico equino.

Fluoro-respirometria ad alta risoluzione del muscolo scheletrico equino

Qui, presentiamo una raccolta di saggi per misurare direttamente la funzione mitocondriale nelle cellule di mammifero indipendentemente dalla loro capacità di consumare ossigeno molecolare.

Saggi indipendenti dall'ossigeno per misurare la funzione mitocondriale nei mammiferi

Qui, descriviamo un metodo completo per misurare la fosforilazione ossidativa mitocondriale in fibre muscolari scheletriche fresche permeabilizzate da muscolo umano o di topo. Questo metodo consente la quantificazione in tempo reale della respirazione mitocondriale e la valutazione della preferenza per il carburante e della flessibilità metabolica, preservando le reti mitocondriali esistenti e l'integrità della membrana.

Misurazione della respirazione mitocondriale nelle fibre muscolari scheletriche umane e di topo mediante repirometria ad alta risoluzione

Scopri come misurare il consumo di ossigeno mitocondriale nel fegato di bovine Holstein per valutare l'efficienza energetica e la perdita di protoni. Questo metodo diretto migliora la precisione nello studio della funzione mitocondriale.

Misurazione del consumo dellossigeno mitocondriale del fegato e cinetica di perdita del protone per stimare la respirazione mitocondriale nei bovini da latte Holstein (Video) | JoVE Journal

Misurazione del consumo dell'ossigeno mitocondriale del fegato e cinetica di perdita del protone per stimare la respirazione mitocondriale nei bovini da latte Holstein

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