Risonanza di superficie-enhanced Raman Scattering Nanosonda Ratiometry per la rilevazione di cancro ovarico microscopico tramite ricevitore di folato di Targeting

Questo metodo utilizza l'applicazione topica delle nanoparticelle per l'immagine di tumori microscopici, specialmente nelle neoplasie maligne che non hanno ancora accesso alla vascucolatura, come la metastasi del cancro alle ovaie. Questa tecnica è ratiometrica, imaging di nanoparticelle mirate e non mirate in un'unica scansione per diminuire i falsi segnali e rivelare la vera estensione del tumore. Queste nanoparticelle possono essere somministrate per iniezione endoperitoneale o endovenosa per l'imaging ad alta precisione del cancro alle ovaie e di molti altri tipi di tumore.

Per la sintesi del nucleo nanostar d'oro posizionare un pallone conico contenente 800 millilitri di soluzione di acido ascorbico appena preparata su una piastra di agitazione magnetica a quattro gradi Celsius e indurre un vortice costante. Aggiungere rapidamente otto millilitri di soluzione di acido tetracloroaurico appena preparata al vortice. In pochi secondi si formeranno nanostelle e la soluzione assumerà un colore blu scuro.

Versare la sospensione nanostar in tubi conici da 50 millilitri per la centrifugazione e aspirare tutti tranne gli ultimi 200 microlitri di supernatante da ogni tubo alla fine dello spin. Utilizzare una micropipetta per rimescolare le nanoparticelle in ogni tubo prima di raggruppare tutte le nanoparticelle in un'unica cassetta di dialisi. Quindi dializzare le nanoparticelle per almeno tre giorni contro due litri di acqua deionizzata che cambia l'acqua ogni giorno.

Per la formazione di gusci di silice, aggiungere prima 10 millilitri di isopropanolo, 500 microlitri di TEOS, 200 microlitri di acqua deionizzata e 60 microlitri di colorante in un tubo conico da 50 millilitri. E aggiungere tre millilitri di etanolo, e 200 microlitri di idrossido di ammonio a un tubo da 15 millilitri. Successivamente, sonicare le nanostar dializzate per disperdere eventuali ammassi e aggiungere 1,2 millilitri di nanostar al tubo.

Posizionare il tubo da 50 millilitri su un miscelatore a vortice e indurre un vortice costante. Aggiungere rapidamente la soluzione nanostar al tubo da 50 millilitri con circa altri cinque secondi di miscelazione prima di trasferire rapidamente il tubo su uno shaker per 15 minuti a 300 giri/min a temperatura ambiente. I due tubi devono essere combinati rapidamente e sotto costante nixing per garantire che la reazione di silicazione avvenga sulle nanostelle e per ridurre al minimo la produzione libera di silice.

Alla fine dell'incubazione riempire il tubo con etanolo per spegnere la reazione e raccogliere le nanostelle per centrifugazione. Aspirare tutti tranne gli ultimi 500 microlitri di supernatante facendo attenzione a non disturbare il pellet e rimescolare le nanoparticelle in un millilitro di etanolo fresco. Quindi trasferire la soluzione in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri per quattro lavaggi di etanolo da un millilitro mediante centrifugazione, rimescolando il pellet ad ultrasuoni per circa un secondo tra ogni lavaggio.

Per introdurre tioli sulle superfici delle particelle, dopo l'ultimo lavaggio ha rimescolato il pellet in un millilitro di un etanolo dell'85%, del 10%3-mercaptopropil-trimetossisilano e del 5% di soluzione di acqua deionizzata per un'incubazione da una a due ore a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, lavare le nanoparticelle funzionalizzate al tiolo mediante centrifugazione come indicato, rimontegando il pellet ad ultrasuoni tra i lavaggi. Per l'anticorpo funzionalizzato anti-folato recettore nanoprobes reagire 200 microgrammi di anticorpo proteico legante anti-folato con dieci volte eccesso molare di peg cross-linker in 500 microlitri di tampone HEPES.

Dopo 30 minuti concentrare l'anticorpo per centrifugazione in un filtro centrifugo, recuperando l'anticorpo invertendo il filtro in un nuovo tubo per un'ulteriore centrifugazione. Quindi mescolare le nanoparticelle funzionalizzate al tiolo con l'anticorpo concentrato e incubare la miscela per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. Per formare nanoprobiche non mirate aggiungere cinque milligrammi di PEG 5000 maleimmide terminata da metossidi sciolta in DMSO alle nanoparticelle funzionalizzate al tiolo in 500 microlitri di tampone HEPES per un'incubazione di almeno 30 minuti a temperatura ambiente.

Per l'iniezione di nanoprobe spingi sia i sapori delle nanoprobe che rimospend i pellet in tampone MES fresco a una concentrazione picomolare di 600. Mescolare le nanoparticelle e caricare un millilitro della soluzione risultante in una siringa da un millilitro dotata di un ago calibro 26 per topo e iniettare per via intraperitoneale l'intero volume nell'addome di ogni topo. Quindi massaggiare delicatamente l'addome per distribuire le nanoparticelle in tutta la cavità peritoneale.

Dopo almeno 25 minuti fissare gli arti di un animale iniettato eutanasiato su una piattaforma chirurgica e utilizzare forcep seghettate e forbici di dissezione per rimuovere la pelle per esporre il peritoneo. Incise il peritoneo. Attaccare i lembi peritoneali alla piattaforma e lavare l'interno della cavità peritoneale con almeno 60 millilitri di PBS.

Quindi trasferire la piattaforma su uno spettrofotometro Raman con una configurazione ottica verticale e uno stadio motorizzato e immaginare l'addome sotto gli opportuni parametri di imaging. Questo è fondamentale che il piano focale per la scansione Raman si trova sulla superficie della maggior parte dei visceri. Se gli organi sono fuori piano, il segnale acquisito non sarà utile.

Per scopi di controllo qualità le nanoparticelle possono essere caratterizzate usando una varietà di metodi durante il processo di sintesi, tra cui microscopia elettronica a trasmissione, scattering dinamico della luce, analisi di tracciamento delle nanoparticelle e spettroscopia assorbente visibile ultravioletta. Le misurazioni di Raman rivelano la presenza degli spettri unici di ogni sapore di nanoparticella durante la sintesi. Le rese e le concentrazioni di reazione tipiche dipendono fortemente dalla tecnica di pipettazione durante le fasi di lavaggio.

Gli spettri Raman possono essere elaborati per rimuovere la fluorescenza e normalizzati nell'area unitaria per compensare la potenza del segnale prima di applicare i classici meno quadrati. Sebbene i punteggi classici meno quadrati su ogni spettro di riferimento delle nanoprobe non forniscano individualmente le posizioni specifiche dei tumori, i rapporti punto-saggio rivelano la presenza della diffusione microscopica diffusa. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di convalidare le nanoparticelle in ogni fase della sintesi poiché la qualità delle nanoparticelle influisce fortemente sui risultati finali.

Questa tecnica dimostra il potenziale per i ricercatori di utilizzare nanoprobe SERRS per il rilevamento di marcatori correlati al tumore nei modelli animali e nei tessuti dei pazienti asportati con un alto grado di precisione microscopica.