Name: Risonanza di superficie-enhanced Raman Scattering Nanosonda Ratiometry per la rilevazione di cancro ovarico microscopico tramite ricevitore di folato di Targeting (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Scopri la ratiometria con nanosonde SERRS per la rilevazione del cancro ovarico microscopico mediante targeting del recettore del folato. Questo metodo migliora la specificità dell'imaging tumorale in vivo.

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Le seguenti fonti di finanziamento (per MFK) sono riconosciute: NIH R01 EB017748, CA222836 R01 e K08 CA16396; Damon Runyon-Rachleff Innovation Award DRR-29-14, premio Sohn Piazza Pershing Pershing Square Sohn Cancer Research Alliance, MSKCC centro per Imaging molecolare & nanotecnologia (CMINT) e lo sviluppo della tecnologia e concede. I riconoscimenti sono estesi anche al supporto sovvenzioni fornito dalla concessione MSKCC NIH Core (P30-CA008748).

Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Comitato del Memorial Sloan Kettering Cancer Center (n. 07/06/11).
1. oro Nanostar nucleo sintesi
Nota: Nanostars oro sono utilizzati come nuclei per entrambi i sapori di nanosonde SERRS utilizzati in questo esperimento.
<ol><li>Preparare 800 mL di soluzione di (C6H8O6) di acido ascorbico di 60 mM in acqua deionizzata (DI) e 8 mL di 20 mM tetrachloroauric (HAuCl4) soluzione acida in acqua deionizzata. Raffreddare a 4 ° C.</li>
	<li>Eseguire questo passaggio di reazione a 4 ° C. Posizionare una beuta contenente 800 mL di soluzione di acido ascorbico su una piastra magnetica e indurre un vortice costante. Aggiungere rapidamente 8 mL della soluzione di acido tetrachloroauric nel vortice. In pochi secondi, nanostars formerà e la soluzione assumerà un colore blu scuro. Nel caso in cui il colore in qualsiasi momento diventa rosa o viola, che significa la formazione di nanosfere, la sospensione deve essere eliminata e la sintesi eseguito un nuovo tentativo.</li>
	<li>Versare la sospensione nanostar in provette coniche da 50 mL e centrifugare per 20 min (4 ° C, 3.220 x g). Aspirare il surnatante lasciando approssimativo 200 µ l della soluzione in ogni provetta. Prestare attenzione per non disturbare il pellet di nanoparticelle nella parte inferiore del tubo. Nota: Il surnatante dovrebbe avere una tinta blu a causa del restante nanostars sospesi.</li>
	<li>Usando una micropipetta, agitare la soluzione per sospendere e raccogliere le nanoparticelle da ciascuna provetta. Parte del pellet può essere compattato sul fondo del tubo e non sarà risospendere anche con vigorosa pipettaggio-scartare questa parte.</li>
	<li>Trasferire la sospensione di nanoparticelle su una videocassetta di dialisi (MWCO 3.5 kDa) e Dializzare almeno tre giorni contro 2 L di acqua deionizzata, cambiando l'acqua ogni giorno. Conservare nanostars in dialisi a 4 ° C per fino a un mese con cambi d'acqua ogni 3-4 giorni. Nota: Il nanostars dovrebbe essere tenuto in dialisi fino a quando richiesto per la reazione di silication, come descritto nella sezione 2.</li>
</ol>2. formazione del guscio di silice
Nota: Due sapori di nanosonde Raman sono sintetizzati. La procedura di sintesi è la stessa per entrambi, con l'unica differenza è la molecola di reporter del Raman (tintura) utilizzata. In questo esperimento, perclorato di IR780 e IR140 sono usati. La reazione deve essere eseguita sempre in contenitori di plastica. La sintesi è altamente scalabile e può essere registrata per la quantità desiderata di injectate richiesto. Qui, una sintesi di lotti medi è descritto, che possono essere scalati in modo lineare a volumi inferiori o superiori secondo le necessità, con le stesse concentrazioni e tempi di reazione. Le reazioni per i due tipi di Nanosonda SERRS possono essere eseguite in parallelo. Prestare attenzione per evitare la contaminazione incrociata. Sonicazione deve essere eseguite per il redispersion di nanoparticella pellet dopo centrifugazione durante fasi di lavaggio, o dopo che le nanoparticelle sono state conservate per più di un'ora. Sonicazione deve essere eseguita fino a quando le nanoparticelle sono chiaramente sospesa nella soluzione, in genere per 1 s.
<ol><li>Nel tubo A (un tubo conico di 50 mL), mescolare 10 mL di isopropanolo, 500 µ l di TEOS, 200 µ l di acqua deionizzata e 60 µ l di colorante (perclorato di IR780 o IR140, 20mm in DMF (dimetilformammide)).</li>
	<li>In tubo B (provetta conica da 15 mL), mescolare 3 mL di etanolo e 200 µ l di idrossido di ammonio. Sonicare nanostars da passo 1.4 per disperdere eventuali cluster in soluzione e aggiungere 1,2 mL di nanostars al tubo. Nota: la soluzione di idrossido di ammonio è altamente volatile e difficile da dispensare con precisione. Conservarlo a 4 ° C, finché necessario, per agevolare il pipettaggio.</li>
	<li>Posizionare il tubo A su un Vortex e indurre un vortice costante. Rapidamente aggiungere il contenuto del tubo B nel vortice e continuando a mescolare per circa 5 s. trasferire immediatamente un agitatore e lasciare reagire per 15 min mentre si stringono a 300 giri/min, a temperatura ambiente.</li>
	<li>Dopo l'incubazione di 15 min, placare la reazione con l'aggiunta di etanolo per riempire il tubo da 50 mL. Centrifugare per 20 min a 3.220 x g e a 4 ° C.</li>
	<li>Aspirare il supernatante, lasciando circa 0,5 mL di soluzione, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Aggiungere 1 mL di etanolo e agitare con una pipetta per risospendere le nanoparticelle. Trasferire in una provetta da centrifuga da 1,5 mL e lavare 4 volte con etanolo da centrifugazione a 11.000 x g per 4 min, aspirare il supernatante e risospendere il pellet di sonicazione per circa 1 s. Nota: In questa fase, le nanoparticelle silicate possono essere funzionalizzate, come descritto nella sezione 3, o risospesi in DI acqua con un passaggio di lavaggio supplementare, per la conservazione a 4 ° C per fino ad una settimana.</li>
</ol>3. superficie funzionalizzazione
Nota: IR780 SERRS nanosonde saranno coniugati con gli anticorpi recettore-targeting folato tramite un reticolante di PEG a forma αFR-NPs; IR140 SERRS controllo nanosonde saranno coniugati con un monostrato di PEG passivante, per nt-NPs. Entrambi sapori si formano attraverso una reazione di tiolo-maleimide in reazioni separate ma parallele.
<ol><li>Lavare le nanoparticelle due volte da centrifugazione a 11.000 x g per 4 min, aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 1 mL di etanolo di sonicazione. Ripetere la fase di lavaggio una volta di più, ma redisperse in 1 mL di etanolo di 85%, 10% 3-MPTMS (3-mercaptopropyltrimethoxysilane) e 5% DI acqua. Incubare a temperatura ambiente per 1-2 h per introdurre i tioli sulla superficie della particella.</li>
	<li>Lavare le nanoparticelle funzionalizzate tiolo di centrifugazione a 11.000 x g per 4 min, aspirare il supernatante e risospendere il pellet di sonicazione, due volte in etanolo, due volte in DI e infine in HEPES (4-(2-idrossietil) -1- tampone acido piperazineethanesulfonic) (10 mM, pH 7.1) e mettere da parte. Nota: MES (2-(N- morfolino) ethanesulfonic acido) buffer o HEPES deve essere utilizzato. Buffer con maggiore salinità, come PBS (phosphate-buffered saline), può indurre l'aggregazione delle nanoparticelle.</li>
	<li>Per l'anticorpo funzionalizzato αFR-NPs, reagire 200 µ g di anticorpi (clone dell'anticorpo di anti-folato associazione proteina [LK26]) con dieci volte eccesso molare di reticolante PEG (poly(ethylene glycol) (N-Idrossisuccinimide 5-pentanoato) etere N′-(3- maleimidopropionyl) aminoethane (CAS: 851040-94-3), in dimetilsolfossido (DMSO)) in 500 µ l di tampone MES (10 mM, pH 7.1) per 30 min.</li>
	<li>Rimuovere l'eccesso reticolante e concentrato anticorpo mediante centrifugazione la soluzione di anticorpo-PEG in un filtro centrifugo (MWCO 100 kDa). Per i filtri centrifughi utilizzati in questo studio, eseguire centrifugazione per 10 min a 14.000 x g e 23 ° C. Recuperare gli anticorpi coniugati in una nuova provetta invertendo il filtro e centrifugazione a 1.000 x g per 2 min.</li>
	<li>Pipettare le nanoparticelle di IR780 da passo 3.2 nel tubo con gli anticorpi e agitare con la pipetta per mescolare. Incubare la miscela per almeno 30 min a temperatura ambiente, o, in alternativa a 4 ° C durante la notte per formare i αFR-PN.</li>
	<li>Per formare nt-NPs, aggiungere 1% w/v methoxy-terminated (m) PEG5000-maleimide (CAS: 99126-64-4) dissolto in DMSO per le nanoparticelle IR140 SERRS da passo 3.2 e lasciare reagire in 500 µ l di tampone MES (10 mM, pH 7.1) per almeno 30 min a temperatura ambiente, o, in alternativa a 4 ° C Per la notte.</li>
	<li>Per la somministrazione ai topi (sezione 5), spin-down sia sapori Nanosonda a 11.000 x g per 4 min, aspirare il surnatante per rimuovere la soluzione con libera non reagita anticorpi/PEG e redisperse ogni sapore nel buffer di MES (10 mM, pH 7.1) a 600 concentrazione di pM . Quando risospendere le nanoparticelle, ridurre al minimo l'esposizione non necessaria per l'ecografia, per prevenire la denaturazione dell'anticorpo.</li>
</ol>4. Mouse modello sviluppo
<ol><li>Stabilire una cultura costante della linea cellulare umana dell'adenocarcinoma ovarico (SKOV-3). Facoltativamente, per attivare il monitoraggio tramite bioluminescenza/fluorescenza, è possibile utilizzare celle transfected SKOV-3 Luc+/GFP+ . Cellule di cultura in medium RPMI (Roswell Park Memorial Institute) con 10% siero fetale di vitello e passaggio due volte a settimana. Per iniezione, incubare le cellule con 0.25% trypsin/0.05% EDTA per 3 min a staccare e successivamente lavare e risospendere in PBS a 2 x 106 cellule/100 µ l.</li>
	<li>Per stabilire il modello di micrometastasi ovarico, iniettare 200 µ l di sospensione cellule SKOV-3 intraperitonealmente in topi athymic femminili (FOXn1nu/FOXn1nu topi, 6-8 settimane di età). Diffusione peritoneale diffusa si verifica in circa 4 settimane. Se usando le cellule SKOV-3 Luc+ , la crescita del tumore può essere monitorata con bioluminescenza attraverso la somministrazione di 2 mg di luciferina beetle in 50 µ l PBS tramite iniezione retroorbital.</li>
</ol>5. Nanosonda iniezione e Imaging
<ol><li>Preparare nanosonde (αFR-NPs e nt-NPs) come descritto nelle sezioni 1-3 e mescolare con un rapporto di 1:1, per una concentrazione finale di 300 pM di ogni tipo nel buffer di MES (10 mM, pH 7.1). Facoltativamente, preparare gli standard di riferimento di 30 pM di ciascuno dei sapori Nanosonda in piccole provette coniche (100 µ l).</li>
	<li>Iniettare per via intraperitoneale 1 mL della sospensione di nanoparticelle in ogni mouse e massaggiare delicatamente il ventre per distribuire le nanoparticelle all'interno della cavità peritoneale. Restituire il mouse nella sua sede. Dopo 25 o più minuti, eutanasia il mouse via CO2 asfissia.</li>
	<li>
Fissare il mouse su una piattaforma chirurgica, in posizione supina (per tutto l'addome di imaging, la piattaforma deve essere montabile sul palco microscopio dritto).
	<ol>
<li>Utilizzando seghettate pinze e le forbici di dissezione, togliere la pelle per esporre il peritoneo ed eseguire una grande incisione sagittale (tra 2 e 3 cm di lunghezza) per esporre l'intero addome. Allegare i lembi peritoneali sulla piattaforma. Lavare l'interno della cavità peritoneale con almeno 60 mL di PBS utilizzando una spruzzetta in plastica. Nota: Per abilitare sgomberata imaging dell'intero addome, intestini devono essere mobilitate o asportato. Per l'asportazione, resecare con una legatura dei vasi mesenterici al fine di ridurre l'emorragia nella cavità addominale.</li>
		<li>In alternativa, per specifici organi di immagine, asportare li dopo il lavaggio con PBS e metterli su un vetrino da microscopio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Trasferire la piattaforma o la diapositiva di un microspectrophotometer di Raman con configurazione ottica verticale e un tavolino motorizzato per l'imaging; utilizzare un sistema commerciale con un 300 mW 785 nm diodo laser, con una grata di 1.200 scanalature ogni mm, centrato a 1.115 cm-1.
	<ol>
<li>Concentrarsi sulla zona di interesse utilizzando ottiche luce bianca, parafocale con il laser Raman. Selezionare l'area per l'imaging e la risoluzione desiderata; in questo rapporto è stata utilizzata una modalità di acquisizione ad alta velocità (spettri acquisiti nell'ambito dell'illuminazione laser continuo con il tavolino del microscopio costantemente in movimento, con risoluzione spaziale efficace 14,2 µm di 200 µm; all'ingrandimento 5x, 100 mW di potenza all'obiettivo, e < 100 ms esposizione per punto). Nota: I tubi con le nanosonde di riferimento dal passaggio 5.1 è collocabile all'interno dell'area immagine se lo si desidera, per fornire standard di riferimento interno per l'analisi successiva. Assicurarsi che nessun estranei sorgenti luminose tranne il laser raggiungono l'obiettivo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Facoltativamente, preparare il campione per l'elaborazione istologica e la convalida tramite la fissazione in paraformaldeide al 4% in PBS durante la notte a 4 ° C. Sciacquare almeno due volte con PBS a 4 ° C per 15 min. Conservare il campione in etanolo al 70% in acqua fino elaborazione istologica standard e inclusione in paraffina. Per la convalida istologica dei tumori, sezioni (5 µm di spessore) da diverse profondità del blocco paraffina possono essere macchiati con ematossilina ed eosina (H & E).</li>
</ol>6. elaborazione dei dati e visualizzazione
Nota: Ogni trattamento dei dati è stato effettuato con un'interfaccia di utente grafica sviluppata internamente, utilizzando il software commerciale. Tutte le funzioni utilizzate sono equivalenti generici disponibili in altri ambienti informatici.
<ol><li>Ottenere gli spettri di riferimento per i due sapori, interrogando puri sospensioni di ciascuno. Gli spettri di riferimento possono essere derivati da punto scansioni di nanosonde, imaging di nanosonde in piastre a pozzetti, o includendo riferimenti interni nelle scansioni sperimentale nei tubi di riferimento (cfr. punto 5.1).</li>
	<li>Elabora gli spettri di riferimento, utilizzando la sottrazione della linea di base (filtro Whittaker, λ = 200), normalizzazione dall'area sotto la curva e filtro derivato Savitzky Golay (polinomio di secondo grado in forma, primo ordine derivato, larghezza = 15 gradini). Questi spettri pre-elaborati servirà come riferimenti per il modello classico minimi quadrati (CLS).</li>
	<li>Elabora i dati di esempio dall'immagine nello stesso modo come gli spettri di riferimento. Ottenere punteggi CLS per ogni punto campione utilizzando un algoritmo CLS disponibile. I punteggi di CLS (DCL) diretti sono semplicemente le coordinate della proiezione di uno spettro di campione sullo spazio lineare definito dalla matrice inversa generalizzata (Moore-Penrose inverso) degli spettri di riferimento. Altro raccordo algoritmi possono essere utilizzati (non negativi minimi quadrati, minimi quadrati parziali o altri). Nota: Alcuni algoritmi di raccordo possono dar luogo a punteggi negativi, che in questo contesto non sono fisiche. Se questo è il caso, una soglia potrebbe essere impostata per escludere i punteggi negativi o un algoritmo vincolata non negativi minimi quadrati essere impiegato invece.</li>
	<li>Calcolare il rapporto puntuale dei punteggi sul riferimento per le nanoparticelle mirate (punteggiαFR) sopra i punteggi sul riferimento per le nanoparticelle non mirati (punteggint). Se i punteggi sono non negativi, il rapporto può essere espresso in maniera logaritmica: R = log10(αFRdi spartiti partiturent). Il rapporto R migliore viene visualizzato in una scala di colori divergenti centrata a zero, per esprimere l'abbondanza relativa delle sonde in ordini di grandezza. L'immagine risultante può essere sovrapposta sull'immagine luce bianco del campione, per rivelare aree di sovraespressione del recettore di folato.</li>
</ol>

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</ol>

• MFK è elencato come un inventore su parecchi rilasciato o istanze di brevetto relative a questo lavoro. MFK è co-fondatore di RIO Imaging, Inc., che mira a tradurre SERRS nanoparticelle in cliniche.
• Gli autori dichiarano di non avere nessun altri concorrenti interessi finanziari.

Il protocollo descritto qui vengono fornite istruzioni per la sintesi di due "gusti" di nanosonde SERRS e il loro impiego nei topi per Raman imaging del tumore ovarico che iperesprimono il recettore del folato, utilizzando un algoritmo raziometrici. Il vantaggio principale di Raman imaging rispetto ad altre tecniche di imaging ottici (quali la fluorescenza) è l'alta specificità del segnale Nanosonda che non può essere confuso con eventuali segnali di origine biologica. In questa incarnazione del Raman imaging, le nanopar...

Imaging con 'surface enhanced Raman scattering' Raman (SERS) nanoparticelle ha mostrato grande promessa nel delineare le lesioni in una varietà di impostazioni e per molti differenti del tumore tipi1,2,3,4 . Il vantaggio principale di nanoparticelle SERS è la loro firma spettrale di impronte digitali-come, offrendo loro indiscutibile rilevazione che non è confuso dal fondo biologico segnali5. Inoltre, l'intensità del segnale emesso viene ulteriormente amplificato con l'uso di molecole reporter (coloranti) con massimi di assorbanza in linea con il laser di eccitazione, dando luogo a 'superficie maggiore risonanza Raman scattering' (SERRS) nanoparticelle con ancora maggiore sensibilità6,7,8,9,10,11,12.
Una barriera che deve essere affrontato per l'adozione del SE(R)RS nanoparticelle13 e molti altri nanoparticella costrutti14,15 per uso clinico è la loro modalità di somministrazione, come iniezione endovenosa cause sistemiche esposizione dell'agente e necessita di test approfonditi per escludere potenziali effetti avversi. In questo articolo, vi presentiamo un altro paradigma basato sull'applicazione di nanoparticelle localmente in vivo, direttamente nella cavità peritoneale durante la chirurgia, seguita da una fase di lavaggio per rimuovere eventuali nanoparticelle non associati1. Questo approccio è in linea con i nuovi approcci terapeutici che sono attualmente sotto inchiesta che fanno anche uso di instillazione locale di agenti nella cavità peritoneale, chiamata chemioterapia ipertermica intraperitoneale (HIPEC). Così, lo stesso principio dovrebbe essere relativamente facile da integrare in un flusso di lavoro clinico. Abbiamo studiato la biodistribuzione delle nanoparticelle dopo applicazione intraperitoneale e non hanno osservato alcun assorbimento rilevabile nella circolazione sistemica1. Inoltre, l'approccio di applicazione locale aggira il sequestro delle nanoparticelle dal sistema reticoloendoteliale, così i numeri delle nanoparticelle richieste sono marcatamente ridotti. Tuttavia, quando applicato localmente, nanoparticelle funzionalizzate anticorpo tendono ad aderire sulle superfici viscerali anche in assenza del loro obiettivo. Al fine di ridurre al minimo i falsi segnali positivi a causa di adesione delle nanoparticelle non specifici, perseguiamo un approccio raziometrici, dove una Nanosonda molecolare mirata fornisce il segnale specifico e una Nanosonda controllo non mirati, con differente spettro Raman, conti per fondo16,17. Abbiamo dimostrato questa metodologia di risonanza maggiore superficie topica spettroscopia raziometrici Raman recentemente in un modello murino di cancro ovarico diffuso1.
L'obiettivo generale di questo metodo è quello di sviluppare due SERRS nanosonde, uno destinato ed uno non-specifici, da applicare localmente in modelli murini, per la prevalenza e la sovraespressione di un cancro di immagine relativo biomarcatore utilizzando raziometrici rilevamento delle due sonde via Raman imaging. In questo lavoro, il recettore per acido folico (FR) è stato scelto come destinazione, si tratta di un marcatore upregulated in molti cancri ovarici18,19. Raman microimaging con nanoparticelle basato su SERS è stata dimostrata anche per cancro cella identificazione20. Due distinti "sapori" di nanoparticelle di Raman sono sintetizzati, ciascuna derivazione l'impronta digitale da un colorante organico differente. Le nanoparticelle sono costituiti da un nucleo d'oro a forma di stella, circondato da un guscio di silice e dimostrare la risonanza plasmonica di superficie a circa 710 nm. Il reporter di Raman (colorante organico) è depositato in concomitanza con la formazione del guscio di silice. Infine, per le nanosonde FR-mirati (αFR-NPs) il guscio di silice è coniugato con gli anticorpi, mentre le nanosonde non mirati (nt-NPs) sono passivati con un monostrato di polietilenglicole (PEG).
Questa tecnica è stata usata con successo per mappare i tumori al microscopio in un modello di xenotrapianto di topo di cancro ovarico metastatico diffuso (SKOV-3), dimostrando la sua applicabilità per uso in vivo. Può anche essere esteso per uso nei tessuti asportati, fenotipizzazione del tumore, o determinazione di margine dopo debulking come mostrato in un cognate Studio21.
SERRS nanosonde forniscono una robusta piattaforma per la creazione di Tag più mirati per biomarcatori, sintetizzati con semplici reazioni chimiche come indicato schematicamente in Figura 1. Qui, presentiamo il protocollo per la sintesi dei due tipi di nanosonde SERRS (sezioni 1-3), lo sviluppo di un modello murino di cancro ovarico adatto (sezione 4), l'amministrazione di nanosonde e imaging (sezione 5) e infine l'analisi dei dati e visualizzazione (sezione 6).

<table><tbody><tr><td>Name of Reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acido ascorbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>3-MPTMS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>175617</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di ammonio (28%)</td><td>Anticorpo anti-recettore anti-folato Sigma-Aldrich</td><td>338818</td><td></td></tr><tr><td>[LK26]&nbsp;</td><td>AbCam</td><td>ab3361</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido (anidro)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792780</td><td></td></tr><tr><td>IR140</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>260932</td><td></td></tr><tr><td>IR780 perclorato*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>576409</td><td>Fuori produzione*</td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650447</td><td></td></tr><tr><td>N.N.Dimetilformammide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>PEG reticolante</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>757853</td><td></td></tr><tr><td>PEG-maleimmide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>900339</td><td></td></tr><tr><td>Acido tetracloroaurico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244597</td><td></td></tr><tr><td>Ortosilicato</td> <td>tetraetileSigma-Aldrich</td><td>86578</td><td></td></tr><tr><td>*IR792</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>425982</td><td>*Alternativa</td></tr><tr><td><forte>Nome dell'apparecchiatura</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cassetta per dialisi (3.500 MWCO)</td><td>ThermoFIsher</td><td>87724</td><td></td></tr><tr><td>Filtri centrifughi</td><td>Millipore</td><td>UFC510096</td><td></td></tr><tr><td>inVia microscopio confocale Raman</td><td>Renishaw</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB (v2014b)</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLS Toolbox (v8.0)</td><td>Ricerca autovettoriale</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

risonanza di superficie-enhanced raman scattering nanosonda ratiometry per la rilevazione di cancro ovarico microscopico tramite ricevitore di folato di targeting

Surface-enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe Ratiometry for Detecting Microscopic Ovarian Cancer via Folate Receptor Targeting

Cancro ovarico rappresenta la malignità ginecologica più letale. Maggior parte dei pazienti presentano in stadio avanzato (stadio FIGO III o IV), quando già verificata una diffusione metastatica di locale. Tuttavia, il cancro ovarico ha un unico modello di diffusione metastatica, in quanto gli impianti del tumore inizialmente sono contenuti all'interno della cavità peritoneale. Questa caratteristica potrebbe consentire, in linea di principio, la resezione completa del tumore impianti con intento curativo. Molte di queste lesioni metastatiche sono microscopici, che li rende difficili da identificare e trattare. Neutralizzare tali micrometastasi è creduto per essere un obiettivo importante verso l'eliminazione di ricorrenza del tumore e sopravvivenza a lungo termine di raggiungimento. Raman imaging con superficie maggiore risonanza Raman scattering nanosonde può essere utilizzato per delineare microscopici tumori con l'alta sensibilità, grazie alla loro brillante e bioorthogonal firme spettrali. Qui, descriviamo la sintesi di due 'sapori' di tali nanosonde: un anticorpo-funzionalizzati di uno che il recettore per acido folico è destinato — sovraespresso in molti cancri ovarici — e una Nanosonda controllo non mirati, con distinti spettri. Le nanosonde sono co-somministrati per via intraperitoneale di modelli murini di adenocarcinoma ovarico umano metastatico. Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Comitato del Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Cavità peritoneale degli animali è chirurgicamente esposti, lavata e scansionata con un microphotospectrometer di Raman. Successivamente, le firme di Raman delle due nanosonde sono disaccoppiate utilizzando un algoritmo di montaggio classico minimi quadrati, e i loro rispettivi punteggi suddivisi per fornire un segnale raziometrico di folato-mirati tramite sonde non mirati. In questo modo, metastasi microscopiche sono visualizzate con elevata specificità. Il principale vantaggio di questo approccio è che l'applicazione locale nella cavità peritoneale — che può essere fatto comodamente durante la procedura chirurgica — puoi taggare i tumori senza sottoporre il paziente all'esposizione sistemica di nanoparticelle. Falsi positivi segnali derivanti dal legame non specifico di nanosonde su superfici viscerali possono essere eliminati seguendo un approccio raziometrici dove nanosonde mirate e non mirati con distinte firme Raman sono applicati come una miscela. La procedura è attualmente ancora limitata dalla mancanza di un commerciale grandangolari Raman imaging sistema di telecamere, che una volta disponibile consentirà l'applicazione di questa tecnica in sala operatoria.

Ai fini del controllo di qualità, le nanoparticelle possono essere caratterizzate utilizzando una varietà di metodi durante il processo di sintesi, tra cui TEM, DLS, analisi di nanoparticle tracking e la spettroscopia di assorbimento UV/Vis, come mostrato nella Figura 2.
In questo modo, la dimensione del nucleo oro nanostar (descritto nel punto 1), la formazione del guscio di silice (sezione 2) e su...

Cancro ovarico forma metastasi durante la cavità peritoneale. Qui, presentiamo un protocollo per rendere e uso folato-recettore mirati a risonanza superficie-enhanced Raman scattering nanosonde che rivelano queste lesioni con formazione immagine di alta specificità via raziometrici. Le nanosonde sono amministrati intraperitonealmente ai topi vivi, e le immagini derivate correlano bene con l'istologia.

Risonanza di superficie-enhanced Raman Scattering Nanosonda Ratiometry per la rilevazione di cancro ovarico microscopico tramite ricevitore di folato di Targeting

Ovarian cancer represents the deadliest gynecologic malignancy. Most patients present at an advanced stage (FIGO stage III or IV), when local metastatic ...

Questo metodo utilizza l'applicazione topica delle nanoparticelle per l'immagine di tumori microscopici, specialmente nelle neoplasie maligne che non hanno ancora accesso alla vascucolatura, come la metastasi del cancro alle ovaie. Questa tecnica è ratiometrica, imaging di nanoparticelle mirate e non mirate in un'unica scansione per diminuire i falsi segnali e rivelare la vera estensione del tumore. Queste nanoparticelle possono essere somministrate per iniezione endoperitoneale o endovenosa per l'imaging ad alta precisione del cancro alle ovaie e di molti altri tipi di tumore.Per la sintesi del nucleo nanostar d'oro posizionare un pallone conico contenente 800 millilitri di soluzione di acido ascorbico appena preparata su una piastra di agitazione magnetica a quattro gradi Celsius e indurre un vortice costante. Aggiungere rapidamente otto millilitri di soluzione di acido tetracloroaurico appena preparata al vortice. In pochi secondi si formeranno nanostelle e la soluzione assumerà un colore blu scuro.Versare la sospensione nanostar in tubi conici da 50 millilitri per la centrifugazione e aspirare tutti tranne gli ultimi 200 microlitri di supernatante da ogni tubo alla fine dello spin. Utilizzare una micropipetta per rimescolare le nanoparticelle in ogni tubo prima di raggruppare tutte le nanoparticelle in un'unica cassetta di dialisi. Quindi dializzare le nanoparticelle per almeno tre giorni contro due litri di acqua deionizzata che cambia l'acqua ogni giorno.Per la formazione di gusci di silice, aggiungere prima 10 millilitri di isopropanolo, 500 microlitri di TEOS, 200 microlitri di acqua deionizzata e 60 microlitri di colorante in un tubo conico da 50 millilitri. E aggiungere tre millilitri di etanolo, e 200 microlitri di idrossido di ammonio a un tubo da 15 millilitri. Successivamente, sonicare le nanostar dializzate per disperdere eventuali ammassi e aggiungere 1,2 millilitri di nanostar al tubo.Posizionare il tubo da 50 millilitri su un miscelatore a vortice e indurre un vortice costante. Aggiungere rapidamente la soluzione nanostar al tubo da 50 millilitri con circa altri cinque secondi di miscelazione prima di trasferire rapidamente il tubo su uno shaker per 15 minuti a 300 giri/min a temperatura ambiente. I due tubi devono essere combinati rapidamente e sotto costante nixing per garantire che la reazione di silicazione avvenga sulle nanostelle e per ridurre al minimo la produzione libera di silice.Alla fine dell'incubazione riempire il tubo con etanolo per spegnere la reazione e raccogliere le nanostelle per centrifugazione. Aspirare tutti tranne gli ultimi 500 microlitri di supernatante facendo attenzione a non disturbare il pellet e rimescolare le nanoparticelle in un millilitro di etanolo fresco. Quindi trasferire la soluzione in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri per quattro lavaggi di etanolo da un millilitro mediante centrifugazione, rimescolando il pellet ad ultrasuoni per circa un secondo tra ogni lavaggio.Per introdurre tioli sulle superfici delle particelle, dopo l'ultimo lavaggio ha rimescolato il pellet in un millilitro di un etanolo dell'85%, del 10%3-mercaptopropil-trimetossisilano e del 5% di soluzione di acqua deionizzata per un'incubazione da una a due ore a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, lavare le nanoparticelle funzionalizzate al tiolo mediante centrifugazione come indicato, rimontegando il pellet ad ultrasuoni tra i lavaggi. Per l'anticorpo funzionalizzato anti-folato recettore nanoprobes reagire 200 microgrammi di anticorpo proteico legante anti-folato con dieci volte eccesso molare di peg cross-linker in 500 microlitri di tampone HEPES.Dopo 30 minuti concentrare l'anticorpo per centrifugazione in un filtro centrifugo, recuperando l'anticorpo invertendo il filtro in un nuovo tubo per un'ulteriore centrifugazione. Quindi mescolare le nanoparticelle funzionalizzate al tiolo con l'anticorpo concentrato e incubare la miscela per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. Per formare nanoprobiche non mirate aggiungere cinque milligrammi di PEG 5000 maleimmide terminata da metossidi sciolta in DMSO alle nanoparticelle funzionalizzate al tiolo in 500 microlitri di tampone HEPES per un'incubazione di almeno 30 minuti a temperatura ambiente.Per l'iniezione di nanoprobe spingi sia i sapori delle nanoprobe che rimospend i pellet in tampone MES fresco a una concentrazione picomolare di 600. Mescolare le nanoparticelle e caricare un millilitro della soluzione risultante in una siringa da un millilitro dotata di un ago calibro 26 per topo e iniettare per via intraperitoneale l'intero volume nell'addome di ogni topo. Quindi massaggiare delicatamente l'addome per distribuire le nanoparticelle in tutta la cavità peritoneale.Dopo almeno 25 minuti fissare gli arti di un animale iniettato eutanasiato su una piattaforma chirurgica e utilizzare forcep seghettate e forbici di dissezione per rimuovere la pelle per esporre il peritoneo. Incise il peritoneo. Attaccare i lembi peritoneali alla piattaforma e lavare l'interno della cavità peritoneale con almeno 60 millilitri di PBS.Quindi trasferire la piattaforma su uno spettrofotometro Raman con una configurazione ottica verticale e uno stadio motorizzato e immaginare l'addome sotto gli opportuni parametri di imaging. Questo è fondamentale che il piano focale per la scansione Raman si trova sulla superficie della maggior parte dei visceri. Se gli organi sono fuori piano, il segnale acquisito non sarà utile.Per scopi di controllo qualità le nanoparticelle possono essere caratterizzate usando una varietà di metodi durante il processo di sintesi, tra cui microscopia elettronica a trasmissione, scattering dinamico della luce, analisi di tracciamento delle nanoparticelle e spettroscopia assorbente visibile ultravioletta. Le misurazioni di Raman rivelano la presenza degli spettri unici di ogni sapore di nanoparticella durante la sintesi. Le rese e le concentrazioni di reazione tipiche dipendono fortemente dalla tecnica di pipettazione durante le fasi di lavaggio.Gli spettri Raman possono essere elaborati per rimuovere la fluorescenza e normalizzati nell'area unitaria per compensare la potenza del segnale prima di applicare i classici meno quadrati. Sebbene i punteggi classici meno quadrati su ogni spettro di riferimento delle nanoprobe non forniscano individualmente le posizioni specifiche dei tumori, i rapporti punto-saggio rivelano la presenza della diffusione microscopica diffusa. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di convalidare le nanoparticelle in ogni fase della sintesi poiché la qualità delle nanoparticelle influisce fortemente sui risultati finali.Questa tecnica dimostra il potenziale per i ricercatori di utilizzare nanoprobe SERRS per il rilevamento di marcatori correlati al tumore nei modelli animali e nei tessuti dei pazienti asportati con un alto grado di precisione microscopica.

surface-enhanced-resonance-raman-scattering-nanoprobe-ratiometry-for

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In questo video, dimostriamo una tecnica per facilitare l'internalizzazione delle nanoparticelle di solfuro di rame ricoperte di acido folico (NP CuS). Le NP di CuS funzionalizzate con acido folico hanno la capacità di colpire i recettori dei folati che sono sovraespressi in molte cellule di cancro ovarico.

Targeting di nanoparticelle funzionalizzate del cancro ovarico: una tecnica per facilitare l'assorbimento dell'agente di contrasto di nanoparticelle coniugato con acido folico da parte delle cellule di cancro ovarico

In questo video, presentiamo una rilevazione citometrica a flusso fotoacustica di cellule tumorali ovariche contenenti nanoparticelle in una camera a flusso circolante in vitro. Questa tecnica non invasiva identifica con successo le cellule tumorali circolanti in un sistema di flusso utilizzando un agente di contrasto.

Citometria a flusso fotoacustica in vitro: una tecnica fotoacustica a flusso non invasiva per rilevare le cellule di cancro ovarico circolanti contenenti nanoparticelle

Questo protocollo descrive una tecnica per la preparazione del campione mediante la co-coltura di espianti ovarici con le cellule tumorali delle tube di Falloppio. Questi campioni vengono visualizzati utilizzando la spettroscopia di massa per immagini, o IMS, per rilevare lo scambio di piccole molecole tra le cellule e i tessuti che porta allo sviluppo del tumore.

Modellazione della comunicazione del cancro ovarico per l'analisi della spettrometria di massa per immagini: un metodo per identificare i comunicatori chimici di piccole molecole nello sviluppo di tumori ovarici metastatici

Questo video descrive la tecnica di diffusione Raman a risonanza potenziata dalla superficie per rilevare il carcinoma ovarico metastatico utilizzando nanosonde mirate, anticorpi anti-recettore specifici e nanosonde di controllo non mirate. Questo metodo aiuta a determinare l'abbondanza relativa delle due nanosonde e a differenziare le cellule tumorali dallo sfondo viscerale.

Imaging basato su nanosonda SERRS funzionalizzato con anticorpi: una tecnica di imaging Raman altamente sensibile per rilevare il carcinoma ovarico metastatico in vivo

Descriviamo una piattaforma di imaging animale non invasiva che consente il rilevamento, la quantificazione e il monitoraggio della crescita e della recidiva del cancro ovarico. Questo modello di xenotrapianto intraperitoneale imita il profilo clinico delle pazienti con carcinoma ovarico.

Modello murino per l&#39;imaging non invasivo per rilevare e monitorare Ovarian Cancer Ricorrenza

Le sonde ottiche basate su nanoparticelle sono state progettate come veicolo per rilevare antigeni utilizzando la spettroscopia Raman e UV-Vis. Qui descriviamo un protocollo per la preparazione di tali sonde per un test immunologico di spettroscopia UV-Vis/Raman in modo tale da incorporare future capacità di multiplexing.

Realizzazione di un UV-Vis e Raman Spectroscopy Immunoassay Platform

Viene presentato un protocollo per rilevare le cellule tumorali ovariche circolanti utilizzando un sistema di flusso fotoacustico su misura e nanoparticelle di solfuro di rame con cofano con clofatura di acido folico mirati.

Rilevamento del cancro ovarico utilizzando la citometria a flusso fotoacustico

Riportiamo un protocollo di ecografia e imaging fotoacustico coregistrato per l'imaging transvaginale delle lesioni ovariche/annessiali. Il protocollo può essere prezioso per altri studi di imaging fotoacustico traslazionale, in particolare quelli che utilizzano array di ultrasuoni commerciali per il rilevamento di segnali fotoacustici e algoritmi standard di beamforming a distanza e somma per l'imaging.

Un protocollo di ecografia e imaging fotoacustico coregistrato per l'imaging transvaginale delle lesioni ovariche

In questo studio, abbiamo sviluppato una nanosonda di impronte digitali basata su diffusione Raman potenziata dalla superficie (SERS) a basso costo con biocompatibilità favorevole per mostrare il bioimaging delle cellule vive senza etichetta e rilevare due ceppi batterici, mostrando in dettaglio come ottenere spettri SERS di cellule viventi in un metodo non distruttivo.

Bioanalisi dello scattering Raman senza etichetta potenziata dalla superficie basata su nanosonde a Au@Carbon punti

Il protocollo descrive un test di ibridazione in immunofluorescenza tandem con tessuto incluso in paraffina fissato in formalina per rilevare e quantificare contemporaneamente microRNA e proteine multiplexate.

Amplificazione e riconoscimento dei microRNA attraverso l'ibridazione in situ dell'acido nucleico bloccato come nuovo metodo di rilevamento e quantificazione

Scopri la ratiometria con nanosonde SERRS per la rilevazione del cancro ovarico microscopico mediante targeting del recettore del folato. Questo metodo migliora la specificità dell'imaging tumorale in vivo.

Risonanza di superficie-enhanced Raman Scattering Nanosonda Ratiometry per la rilevazione di cancro ovarico microscopico tramite ricevitore di folato di Targeting (Video) | JoVE Journal

Risonanza di superficie-enhanced Raman Scattering Nanosonda Ratiometry per la rilevazione di cancro ovarico microscopico tramite ricevitore di folato di Targeting

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