Identificazione, caratterizzazione istologica e dissezione dei lobi della prostata Mouse per In Vitro sferoide 3D modelli di coltura

Questo metodo può aiutare all'inizio di modelli di topi geneticamente modificati del cancro alla prostata e allo studio del meccanismo del cancro alla prostata attraverso analisi in vivo e in vitro. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente un'analisi completa del modello di topo tumorale della prostata, dalla dissezione dei tessuti all'isolamento e alla coltura cellulare. Dopo aver esposto il sistema urogenitale, o UGS, afferrare saldamente la vescica urinaria con forcelle smussate medie e sollevare l'intero sistema dall'addome del topo.

Far scorrere un paio di forbici sotto la vescica e la prostata fino alla colonna vertebrale per fare un'incisione attraverso il midollo spinale e tagliare tutte le connessioni rimanenti alla cavità addominale per consentire la rimozione dell'intero UGS. Trasferire l'UGS in una piastra di Petri di sei centimetri contenente da due a sei millilitri di PBS al microscopio sezionato. E usa un paio di forcelle sottili e forbici a microdisezione per cancellare attentamente tutto il grasso dai lati dorsale e ventrale del sistema tissutale senza tagliare alcun tessuto prostatico.

Quando tutto il grasso è stato rimosso, tirare la vescica con le farse e asportare la vescica alla sua base. Posizionare il lato ventrale del tessuto rimanente verso l'alto e tenere un condotto termina con le forcep, seguire il vaso fino alla sua base con forbici e asportare il vaso alla sua base. Rimuovere lo stesso vaso dall'altra parte e inserire le forcep tra le vescicole seminali e la prostata per consentire lo snipping di qualsiasi tessuto connettivo adiacente, se necessario.

Quindi traccia le vescicole seminali fino alla loro base all'uretra e rimuovi i vasi senza forarli. Quando entrambe le vescicole sono state rimosse, posizionare il lato dorsale del tessuto verso l'alto in modo che siano visibili i lobi dorsali che assomigliano alle ali di una farfalla. Tenendo ogni lobo dorsale con le forcelle, tagliare il tessuto alla sua base con le forbici per raccogliere i lobi dorsali e girare il tessuto verso il lato ventrale.

Raccogli i lobi laterali, che sono piccoli e di solito avvolgono l'uretra sul lato e sono incuneati tra i lobi anteriore, ventrale e dorsale allo stesso modo. Raccogli i lobi ventrali, che sono più grandi dei lobi laterale e giacciono sull'uretra ventralmente. Quindi tagliare e scartare l'uretra per raccogliere i lobi anteriori.

Per elaborare il tessuto prostatico per la coltura 3D, trasferire i lobi in un piatto di 10 centimetri contenente da due a tre millilitri di DMEM e utilizzare un bisturi per tritare i tubuli prostatico nel modo più fine e uniforme possibile. Trasferire i frammenti di tessuto in una cappa sterile per la coltura tissutale e aggiungere la soluzione tissutale a un nuovo tubo da 15 millilitri. Portare il volume nel tubo fino a nove millilitri con mezzo fresco e aggiungere un millilitro di soluzione di stock di collagenasi TenX alla miscela tissutale.

Dopo il vortice, incubare il tubo con tremori per due ore a 37 gradi Celsius per degradare la matrice extracellulare. Al termine dell'incubazione, raccogliere il tessuto mediante centrifugazione e sospendere di nuovo il pellet in due millilitri di strisce calde allo 05% in EDTA. Dopo cinque minuti di 37 gradi Celsius per facilitare la fenditura delle aderenze da cellula a cellula e da cellula a matrice, utilizzare una testa di tubo P1000 con una punta larga per triturare il tessuto da otto a 10 volte per rompere eventuali grumi.

Ripetete la dissociazione con una punta della testa di tubo P200. Quindi neutralizzare la triptina con tre millilitri di mezzo completo. Mescolare 500 unità di DNASE1 nel liquame tissutale e passare la soluzione da cinque a 10 volte attraverso una siringa da cinque millilitri dotata di un ago calibro 18, seguita da cinque volte attraverso un ago calibro 20.

Quando non sono visibili più pezzi di tessuto di grandi dimensioni, filtrare la sospensione attraverso un filtro da 40 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Per la placcatura cellulare e la coltura, sospendere il pellet in 0,5 millilitri di mezzo completo di crescita delle cellule epiteliali della prostata e alludono le cellule a una concentrazione media di crescita delle cellule epiteliali cinque volte 10 al quinto per millilitro della concentrazione media di crescita delle cellule epiteliali della prostata. Mescolare le cellule con la matrice extracellulare della membrana basale con un rapporto tra due e tre volumi di soluzione e placcare la sospensione cellulare nell'appropriato contenitore sperimentale di coltura cellulare.

Quindi posizionare le cellule in un incubatore di coltura cellulare per 30 minuti. Quando la matrice extracellulare si è solidificata, coprire la coltura con un mezzo di crescita epiteliale prostatico completo pre-riscaldato, facendo attenzione a non disturbare la spina della matrice extracellulare della membrana basale. Quindi riportare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare per cinque o 10 giorni, rinfrescando metà del mezzo ogni due o tre giorni.

Per raccogliere le sfere, aspirare il mezzo con attenzione senza disturbare la spina in gel a matrice extracellulare della membrana basale e aggiungere un millilitro di soluzione Disbase per 100 microlitri di matrice extracellulare a membrana basale. Utilizzando un raschietto cellulare, raschiare lungo il fondo della piastra per sollevare i gel extracellulari della membrana basale dal fondo della piastra nel supernatante e pipere l'intera soluzione una volta per rompere la spina in pezzi più piccoli. Incubare i pezzi della matrice cellulare extra nell'incubatore di coltura cellulare per una o due ore fino a quando la matrice extracellulare della membrana basale non si è completamente sciolta.

Quindi trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri. E raccogliere le cellule per centrifugazione per un'ulteriore manipolazione a valle. La prostata del topo è composta da quattro paia di lobi situati dorsalmente e ventralmente alle vescicole seminali e all'uretra.

I lobi della prostata sono composti da più profili ghiandolare, ognuno composto da un lume, circondato da cellule epiteliali secretorie. Le forme dei lobi, l'organizzazione delle cellule e la natura della secrezione variano da lobo a lobo. Le cellule prostatiche isolate iniziano a crescere in organoidi già quattro giorni dopo la coltura della matrice extracellulare della membrana basale.

Nei successivi uno o sei giorni, la maggior parte delle cellule cresce in sfere solide con una frazione delle sfere che mostrano un lume parziale o pieno. Gli sferoidi dimostrano anche una forte colorazione beta catenina alle giunzioni da cellula a cellula che co-localizzano con la colorazione F-actin. Durante il tentativo di questa procedura, è molto importante seguire meticolosamente i passaggi di microdisezione.

Ad esempio, isolare i lobi della prostata mentre sono ancora attaccati all'uretra, in modo da sapere quale lobo è che si basa su dove si trovano rispetto all'uretra. Seguendo la procedura di dissezione, i lobi isolati possono essere utilizzati per l'analisi a valle, come il sequenziamento RMA, il gonfiore occidentale o l'immunosocienza. La tecnica primaria della coltura 3D consente di ottenere ulteriori informazioni sul meccanismo del cancro alla prostata, perché è possibile monitorare la vita con gli sferoidi per i cambiamenti morfologici e comportamentali e identificare eventuali cambiamenti neoplastici nello stesso.

In sintesi, questo metodo di dissezione e coltura della prostata può essere incorporato in varie applicazioni a valle per fornire preziose informazioni per indagare il meccanismo del cancro alla prostata utilizzando modelli di topo geneticamente modificati.