Name: Lentivirali terapia genica mediata da vettore di epatociti Ex Vivo per trapianto autologo nei suini (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Scopri la terapia genica ex vivo e il trapianto autologo di epatociti per trattare la tirosinemia ereditaria di tipo 1 nei suini. Questo metodo riduce l'immunosoppressione e offre una piattaforma per diverse malattie epatiche.

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Gli autori ringraziano Duane Meixner per competenza nell'eseguire l'iniezione della vena portale, Steve Krage, Joanne Pederson e Lori Hillin per assistenza durante le procedure chirurgiche. Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione dell'ospedale del Minnesota Minnesota di medicina rigenerativa e dei bambini. R.D.H. è stato finanziato attraverso un premio NIH K01 DK106056 e un Mayo Clinic Center per medicina rigenerativa Career Development Award.

Animale tutte le procedure sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali ed erano esaminate e approvate dal istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) prima di studio condotta. Le procedure descritte qui sono state effettuate su maschio e femmina grande bianco allevamento di maiali (background genetico di 50% Landrace/50% Large White) fino a 3 mesi di età che sono ritenuti sani e adatti per la chirurgia.  Gli animali sono alloggiati socialmente se non considerato incompatibile dal personale istituzionale cure veterinarie.  Gli animali sono alimentati livelli appropriati di chow due volte quotidiane e osservati per segni clinici di cura personale almeno una volta al giorno.
1. preparazione per la chirurgia
<ol><li>Somministrare 5 mg/kg telazol e xilazina 2 mg/kg per via intramuscolare per indurre sedazione. Amministrare la buprenorfina SR per via sottocutanea alla dose di 0,18 mg/kg per l'analgesia post-operatoria (anticipato l'analgesia da questa dose sarà fino a 72 h). Controllare manualmente l'animale per le risposte verificare sedazione.</li>
	<li>Una volta sedata, inserire un catetere endovenoso in una vena periferica dell'orecchio per accesso farmacologico.</li>
	<li>Amministrare la cefazolina 25 mg/kg per via endovenosa ed intramuscolare 5 mg/kg di ceftiofur pre-operatively.<ol>
<li>Amministrare la normale soluzione salina per via endovenosa per mantenere la pressione sanguigna e la frequenza cardiaca entro i limiti fisiologici normali durante tutta la procedura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Posto un tubo orogastrico per decomprimere lo stomaco. Eseguire l'intubazione endotracheale con un tubo endotracheale di dimensione appropriate, verificare il corretto posizionamento comprimendo il petto manualmente per rilevare l'espirazione e quindi ventilare meccanicamente l'animale con isoflurane 1 – 3%.</li>
	<li>Posizionare l'elettrocardiogramma (ECG) conduce, polsino di pressione sanguigna, sonda di temperatura e pulsossimetro per monitorare e registrare i segni vitali. Metti l'animale in posizione supina, strofinare l'addome da gabbia toracica al bacino con betadine e drappo sterilmente.</li>
	<li>Ventilare soggetto con 1-3% isoflurane durante la procedura per mantenere un aereo chirurgico di anestesia. Continuare a monitorare i segni vitali per le modifiche e regolare di conseguenza isoflurano per mantenere la frequenza cardiaca a livelli pre-incisione se la pressione del sangue scende drasticamente, ridurre isoflurano e avviare gli agenti istituzionalmente approvato per ripristinare la vitalità, come epinefrina endovenosa.<ol>
<li>Registrare la frequenza cardiaca, frequenza respiratoria, pressione arteriosa e temperatura corporea su un record di procedura chirurgica per tenere traccia e mantenere il benessere degli animali secondo criteri di istituzione-specifiche per garantire la conformità con gli standard di benessere degli animali grandi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. laparoscopica Hepatectomy parziale
<ol><li>Eseguire la voce del sito porta iniziale utilizzando una tecnica aperta Hassen cephalad al umbilicus. Quando viene visualizzata la finestra di peritoneo, introdurre in modo sicuro un trocar 12 millimetri nella cavità addominale. Passare un 5 mm, 30°, portata attraverso questa porta.</li>
	<li>Sniffare l'addome con CO2 a 15 mmHg. Sotto visualizzazione diretta con la telecamera laparoscopica, posizionare due porte aggiuntive 5 mm triangolando sul lobo laterale di sinistra del fegato. Posizionamento esatto dei porti dipenderà dalla dimensione e anatomia dell'animale.<ol>
<li>A questo punto, posizionare il laparoscopio in una delle porte 5 mm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Identificare il segmento laterale di sinistro del fegato sul punto della fessura principale del lobo di sinistra. Questa fenditura separa i segmenti laterali sinistro e medicali. Garantire le strutture portale insieme con la vena epatica lungo questa fessura usando una spillatrice chirurgica (Vedi Tabella materiali). Transetto del parenchima attraverso questa fessura utilizzando sequenziali infornamenti dalla graffatrice utilizzando 60, 45 o carichi lungo vascolare 30 mm.<ol>
<li>Quando la resezione parenchima è completa, è necessario valutare il fegato residuo per garantire un'adeguata emostasi. Controllare qualsiasi sanguinamento dal parenchima con cautery o sutura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recuperare la sezione del fegato utilizzando atraumatiche endoscopici e un sacchetto di retrieval endoscopica del tessuto.</li>
	<li>Rimuovere le porte e chiudere l'incisione porta 12 mm a tre strati con sutura interrotta dimensione 0 per la fascia del midline, un suturare corrente 2-0 per lo strato cutaneo profondo e un suturare corrente di 4-0 per lo strato di subcuticular. Le porte di 5 mm possono essere chiuso in un unico strato con 2-0.</li>
	<li>Posizionare una garza sterile sulle incisioni (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Quando le cellule sarà pronte in meno di 4 ore, mantenere gli animali in anestesia generale postoperatorio fino al momento del autotransplantation.</li>
	<li>In alternativa, se le manipolazioni delle cellule richiedono periodi più lunghi (tali da permettere la formazione di sferoidi degli epatociti o lunghi periodi di trasduzione/selezione basati su singole applicazioni di questo metodo) permettere all'animale di recuperare da anestesia e ripetere la passaggi di induzione anestetica prima del autotransplantation quando le cellule sono pronte.</li>
</ol>3. dell'epatocita isolamento
<ol><li>Collegare una pompa peristaltica con perfusione impostato per fornire soluzioni di dispersione caldo (mantenuti in bagno di acqua di 43 ° C) per cateteri siano disposti nei grandi vasi esposti della sezione del fegato, tale che la temperatura della soluzione è 38 ° C su Introduzione al tessuto. Tutti i tubi, attrezzature e soluzioni devono essere mantenute sterile affinché che le cellule sono adatte per il trapianto.<ol>
<li>Adescare la pompa e la tubazione con Per II fino a un rubinetto posizionato per passare ai e al II consegna al tessuto. Passare il rubinetto per il Per I Posizionare e adescare il resto del set di tubi, riempiendo un gorgogliatore in linea completamente per evitare l'introduzione di bolle d'aria nel tessuto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare una trasversale pulita tagliata perpendicolarmente la circolazione epatica per rivelare le sezioni trasversali dei rami della vena portale e vene epatiche per cateterizzazione.</li>
	<li>Cateterismo disponibili vene esposte con un catetere aderente per evitare la fuoriuscita del perfusato. Incannulare almeno 1 portale e 1 della vena epatica per garantire un'adeguata perfusione del tessuto.<ol>
<li>Assicurarsi che i catheter(s) siano innescato/libero dell'aria prima di inserire il catetere in vena.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Irrorare con il caldo Per I a 100 mL/min, passando il tubo di scarico da vena a vena ogni 30 secondi per 1 min. ciclo disponibili tutte le vene per 15 – 20 min. Durante Per I set di infusione, un tubo di evacuazione per svuotare il cassetto di routine in un contenitore per rifiuti sotto vuoto.</li>
	<li>Passare a Per II a 100 mL/min, escursioni in bicicletta attraverso le vene come con Per I, per un totale di 30 min. Durante Per II, è possibile utilizzare una pompa di ritorno per riciclare Per II Torna al serbatoio per Risomministrazione conservare la preparazione dell'enzima attivo. Impostare la pompa di ritorno a meno della pompa di efflusso (cioè, 94 mL/min), facendo attenzione a non rimettere eccessiva aria nel flacone di origine.<ol>
<li>Se si rompe la capsula del fegato, questo tempo può essere ridotto.</li>
		<li>Se il fegato non è completamente digerito (non rimane fossette con una leggera pressione focale) possono essere eseguite ulteriori 5 min di aspersione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Occasionalmente (circa ogni 5 minuti) documento temperatura superficiale il gorgogliatore e/o fegato affinché gli epatociti non si stanno raffreddando. Se il fegato sta facendo freddo (< 35 ° C) aumentare il calore del bagno d'acqua per ripristinare la temperatura del fegato più vicino a 38 ° C. Il fegato deve blanche come procede la perfusione.</li>
	<li>Rimuovere il fegato alla piastra sterile o capsula di Petri per il trasporto alla cappa di cultura cellulare. Copertura campo sterile con un telino sterile per mantenere l'integrità durante l'elaborazione dell'epatocita.</li>
	<li>Esporre la sezione del fegato da telo sterile e immergere il fegato con media di lavaggio freddo dell'epatocita (HWM). Interrompere la capsula trascinando le forbici nella parte superiore. Indossare guanti sterili, massaggiare delicatamente il fegato per rilasciare gli epatociti nel mezzo.</li>
	<li>Filtrare la HWM contenente gli epatociti attraverso una garza sterile in bottiglie da centrifuga grande (~ 200 mL). Lavare gli epatociti attraverso la procedura seguente in triplice copia, combinando il pellet cellulare dalle bottiglie multiple dopo la risospensione prima (come applicabile):<ol>
<li>Centrifugare a 50 x g, 5 min, 4 ° C.</li>
		<li>Aspirare e risospendere in 150 mL di HWM.</li>
		<li>Lasciare il pellet nella HWM dopo il lavaggio 3rd .</li>
	</ol>
</li>
	<li>Contare la concentrazione cellulare mediante un emocitometro o un altro dispositivo, come disponibile. Queste cellule sono ora pronte per manipolazione ex vivo di interesse, tra cui la terapia genica, ordinamento delle cellule o altra specializzazione prima del autotransplantation. Volume finale di HWM può essere regolata per una concentrazione specifica (cellule/mL) di destinazione.</li>
</ol>4. dell'epatocita trasduzione
<ol><li>Risospendere gli epatociti in media (medium di eagle modificate di Dulbecco [DMEM], 10% di siero fetale bovino [FB], penicillina-streptomicina, 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acido [HEPES], desametasone, fattore di crescita epidermico [EGF] e NTBC) a 1 – 2 milioni di cellule per mL in una provetta conica sul ghiaccio.</li>
	<li>Scongelare il vettore lentivirale a temperatura ambiente e aggiungere alla provetta conica sul ghiaccio presso il molteplicità 20 bersaglio dell'infezione (MOI) per associare le celle. Ruotare le cellule a 4 ° C a 10 giri/min per 90 min associare il vettore virale alla superficie delle cellule.</li>
	<li>Trasferimento tubi a 37 ° C per 30 – 40 min. Inverti per mescolare ogni 5 minuti per facilitare il vettore di trasduzione delle cellule associate.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 50 x g a 4 ° C per 4 min. pellet e risospendere in soluzione salina a concentrazione desiderata sul ghiaccio. Ripetere questo lavaggio per garantire la rimozione di qualsiasi vettore non associato dalla preparazione.</li>
	<li>Se possibile, piastra sufficiente aliquote delle cellule (cioè, 500.000 cellule per pozzetto in un 6 celle ben piastra di coltura) per verificare la redditività, efficienza di trasduzione, adesione, ecc. Nota: Non è spesso possibile valutare questi parametri prima del autotransplantation, soprattutto per le procedure di stesso-giorno. Ad esempio, la procedura descritta nel presente documento impiegato un cDNA di Fah senza tag sotto il controllo del promotore epatocitari alfa-1 antitripsina, che non era prontamente saggiabili negli epatociti prima del trapianto. Tuttavia, queste cellule placcate possono essere analizzate dopo il autotransplantation come indicatore di successo di trasduzione (vale a dire, tramite Western blotting) o un predittore del successo generale della procedura.</li>
</ol>5. dell'epatocita trapianto
<ol><li>Identificare la vena portale mediante ultrasuoni utilizzando un trasduttore di 2 a 5 MHz. Dirigere un 18 G, ago 5 pollici verso la vena principale prossimale alla sua biforcazione.</li>
	<li>Iniziare infusione lenta manuale di a 1 x 109 epatociti (circa 10 g) utilizzando una siringa. Monitoraggio delle pressioni portale durante il trapianto usando un catetere di infusione.<ol>
<li>Se aumenta la pressione portale più di 8 mmHg di sopra della linea di base, sospendere infusione e permettere la pressione tornare ai livelli basali.</li>
		<li>Se portale pressioni non ritornano ai valori basali dopo una sospensione infusione per cinque minuti, interrompere l'infusione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo trapianto e rimozione del catetere, è necessario utilizzare l'ecografia per valutare la presenza di eventi trombotici e inoltrare il flusso nella vena portale.</li>
</ol>6. manutenzione e recupero postoperatorio
<ol><li>Spostare soggette a un'area di ripristino corretto e osservare fino a quando l'animale è completamente ambulatoria, monitoraggio frequenza cardiaca, saturazione dell'ossigeno e la temperatura corporea ogni 15-30 min. Mantieni la temperatura corporea con coperte calde o un involucro di aria riscaldata, come necessario.</li>
	<li>Amministrare omeprazole 1 mg/kg per via orale al giorno (fino alla fine dello studio) per ridurre le possibilità di ulcerazione gastrica che può verificarsi con attacchi di inappetenza.</li>
	<li>Postoperatorio, l'animale è monitorato da vicino da lab e personale veterinario e in genere non richiede ulteriori antidolorifici separata dalla dose di buprenorfina pre-operative.  Se si osservano segni di sofferenza/dolore da personale qualificato cure veterinarie (incisione a guardia, inappetenza, letargia), agenti anti-infiammatori (cioè, Carprofen) possono essere somministrati.</li>
</ol>7. le ricette
<ol><li>Vedere la tabella 1 per ricette utilizzate in questo protocollo.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td>HWM</td>
			<td>Reagente</td>
			<td>Per I (10x)</td>
			<td>Per II (10x)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Williams'-E polvere (g/L)</td>
			<td>10,8</td>
			<td>NaCl (g/L)</td>
			<td>83</td>
			<td>39</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3 (g/L)</td>
			<td>2.2</td>
			<td>KCl (g/L)</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (g/L)</td>
			<td>2.6</td>
			<td>HEPES (g/L)</td>
			<td>24</td>
			<td>240</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep (100 x, mL/L)</td>
			<td>10</td>
			<td>EGTA (g/L)</td>
			<td>9.5</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Siero bovino fetale (mL/L)</td>
			<td>100</td>
			<td>N-acetile-L-cisteina</td>
			<td rowspan="2">8</td>
			<td rowspan="2">8</td>
		</tr>
<tr>
<td>pH</td>
			<td>7.3</td>
			<td>(N-A-C, g/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>Nitroglicerina (mL/L)</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>CaCl2 2 H2O (g/L)</td>
			<td>-</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>Collagenasi D (mg/mL)</td>
			<td>-</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>pH</td>
			<td>7.4</td>
			<td>7.6</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Ricette per le soluzioni utilizzati nell'isolamento degli epatociti da sezioni del fegato.

<ol><li>Mak, C. M., Lee, H. C., Chan, A. Y., Lam, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inborn+errors+of+metabolism+and+expanded+newborn+screening%3A+review+and+update%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Clinical+Laboratory+Sciences%22%5BJournal%5D)">Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update.</a> Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 50 (6), 142-162 (2013).</li>
<li>Hansen, K., Horslen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+liver+disease+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Metabolic liver disease in children.</a> Liver Transplantation. 14 (5), 713-733 (2008).</li>
<li>Schneller, J. L., Lee, C. M., Bao, G., Venditti, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+for+inborn+errors+of+metabolism%3A+advancing+towards+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genome editing for inborn errors of metabolism: advancing towards the clinic.</a> BMC Medicine. 15 (1), 43(2017).</li>
<li>Brunetti-Pierri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+inborn+errors+of+liver+metabolism%3A+progress+towards+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Italian+Journal+of+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for inborn errors of liver metabolism: progress towards clinical applications.</a> Italian Journal of Pediatrics. 34 (1), 2(2008).</li>
<li>Carlson, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+TALEN-mediated+gene+knockout+in+livestock%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17382-17387 (2012).</li>
<li>Lindblad, B., Lindstedt, S., Steen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+enzymic+defects+in+hereditary+tyrosinemia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">On the enzymic defects in hereditary tyrosinemia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (10), 4641-4645 (1977).</li>
<li>Hickey, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+3-dimensional+imaging+of+liver+regeneration+in+a+mouse+model+of+hereditary+tyrosinemia+type+1+using+the+sodium+iodide+symporter+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Noninvasive 3-dimensional imaging of liver regeneration in a mouse model of hereditary tyrosinemia type 1 using the sodium iodide symporter gene.</a> Liver Transplantation. 21 (4), 442-453 (2015).</li>
<li>Hickey, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curative+ex+vivo+liver-directed+gene+therapy+in+a+pig+model+of+hereditary+tyrosinemia+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Curative ex vivo liver-directed gene therapy in a pig model of hereditary tyrosinemia type 1.</a> Science Translational Medicine. 8 (349), (2016).</li>
<li>Naldini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272 (5259), 263-267 (1996).</li>
<li>Bouard, D., Alazard-Dany, D., Cosset, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors%3A+from+virology+to+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Viral vectors: from virology to transgene expression.</a> British Journal of Pharmacology. 157 (2), 153-165 (2009).</li>
<li>Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors%3A+basic+to+translational%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors: basic to translational.</a> Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).</li>
<li>Chowdhury, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+improvement+of+hypercholesterolemia+after+ex+vivo+gene+therapy+in+LDLR-deficient+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-term improvement of hypercholesterolemia after ex vivo gene therapy in LDLR-deficient rabbits.</a> Science. 254 (5039), 1802-1805 (1991).</li>
<li>Elgilani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+Phenotype+Characterization+of+a+Large-Animal+Model+of+Hereditary+Tyrosinemia+Type+1%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Chronic Phenotype Characterization of a Large-Animal Model of Hereditary Tyrosinemia Type 1.</a> The American Journal of Pathology. 187 (1), 33-41 (2017).</li>
<li>Patyshakuliyeva, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbohydrate+utilization+and+metabolism+is+highly+differentiated+in+Agaricus+bisporus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Carbohydrate utilization and metabolism is highly differentiated in Agaricus bisporus.</a> BMC Genomics. 14, 663(2013).</li>
<li>Hickey, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fumarylacetoacetate+hydrolase+deficient+pigs+are+a+novel+large+animal+model+of+metabolic+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Fumarylacetoacetate hydrolase deficient pigs are a novel large animal model of metabolic liver disease.</a> Stem Cell Research. 13 (1), 144-153 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo rapporto descrive un ex vivo autologo approccio di terapia genica per curare un modello porcino di HT-1. Si tratta di un'epatectomia parziale, seguita da ex vivo dell'epatocita isolamento e trasduzione di epatociti isolati con lenti virus che trasportano il transgene correttivo. Corretti gli epatociti autologhi sono poi trapiantati torna all'animale carente di FAH attraverso la vena porta8. Anche se il metodo descritto è applicabile a tutti i grandi modelli animali con alc...

Errori congeniti del metabolismo del fegato sono una famiglia di malattie genetiche che colpiscono collettivamente altretanto come 1 in 800 nati vivi1. Molte di queste malattie sono singolo gene difetti2 e può essere curate in modo funzionale con l'introduzione di una singola copia corretta del gene interessato in un numero sufficiente di epatociti3. La percentuale effettiva di epatociti che deve essere corretto varia a seconda della malattia4 e dipende in larga misura la natura della proteina che codifica, ad esempio, viene escreta proteine contro citoplasmico. Nella maggior parte dei casi, l'efficacia di qualsiasi trattamento per la malattia metabolica è facilmente analizzato attraverso la presenza di biomarcatori spesso disponibile nella circolazione.
HT-1 è un errore innato del metabolismo del fegato che deriva da un difetto in fumarylacetoacetate idrolasi (FAH)5, l'ultimo passaggio enzimatico in tirosina metabolismo6. Deficit di FAH conduce alla generazione di metaboliti tossici nel fegato che può causare morte e insufficienza epatica acuta o in forma cronica della malattia possono causare cirrosi e carcinoma epatocellulare. La malattia è clinicamente gestita dall'amministrazione di 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), un inibitore di piccola molecola di un enzima a Monte di FAH nel metabolismo della tirosina. La malattia fornisce un ambiente ideale in cui sperimentare tecniche di terapia genica, come riuscita correzione di anche un piccolo numero di epatociti alla fine si tradurrà nel ripopolamento del fegato intero con cellule corrette nei modelli animali piccoli e grandi 7 , 8. ciò si verifica perché rettificato le cellule hanno un vantaggio di sopravvivenza profonda sopra cellule non corrette a causa dell'accumulo di metaboliti tossici in quest'ultimo. La perdita degli epatociti non corretti consente l'espansione selettiva degli epatociti corretti coerenza con la capacità rigenerativa del fegato. Il trattamento può essere seguito facilmente misurando la diminuzione nei livelli di tirosina ed eritrocitaria dopo trapianto di circolazione.
Al fine di giustificare la natura invasiva della procedura, che comprende un'epatectomia parziale, l'obiettivo di questo approccio deve essere una cura durevole. Pertanto, vettori lentivirali incompetente replica vengono utilizzati perché saranno integrati stabilmente nel genoma dell'epatocita9. garantire la consegna del gene corretto per tutte le cellule della figlia come il fegato cresce e si espande per sostituire la perdita rapida di cellule non rivedute. Questo è vantaggioso su vettori virali adeno associato (AAV), che esiste principalmente come episomi che possono essere passati solo a una singola cella della figlia durante la mitosi10 perdendo così qualsiasi effetto della terapia in poche settimane.
Anche se un corpo crescente di letteratura supporta la sicurezza di lentivirus11, preoccupazioni su eventi genotossici sono mitigati limitando la trasduzione di cellule dell'ospite in un ambiente controllato in vitro . Vettore libero mai sistemica è introdotto all'host quando questo metodo viene eseguito, limitando l'esposizione agli epatociti che sarà reintrodotto con trapianto autologo tramite la vena portale.
Questo rapporto descrive il metodo di chirurgica ed ex vivo le procedure utilizzate per isolare gli epatociti per terapia genica ex vivo e il conseguente trapianto autologo12 per il trattamento del maiale HT-18. Il processo completo include 1) un'epatectomia parziale che serve come fonte di epatociti e un stimolo di crescita per fegato dell'host, 2) isolamento degli epatociti dal fegato asportato seguita da ex vivo correzione genica e infine 3) reintroduzione della epatociti corretti nuovamente dentro l'host. Il metodo descritto è applicabile a tutti i grandi modelli animali con alcune modifiche, ma solo il maiale di FAH-carenti13 avrà il vantaggio dell'ambiente selettivo per gli epatociti corretti.

<table><tbody><tr><td>2-(2-nitro-4-trifluorometilbenzoil)-1,3-cicloesandione (NTBC)</td><td>Yecuris</td><td>20-0027</td><td></td></tr><tr><td>12 mm Trocar</td><td>Covidien</td><td>B12STS</td><td></td></tr><tr><td>5 mm Trocar</td><td>Covidien</td><td>B5SHF</td><td></td></tr><tr><td>Endo Surgical Stapler 60</td><td>Covidien</td><td>EGIA60AMT</td><td></td></tr><tr><td>Endo Surgical Stapler 45</td><td>Covidien</td><td>EGIA45AVM</td><td></td></tr><tr><td>Endo Succatrice chirurgica 30</td><td>Covidien</td><td>SIG30AVM</td><td></td></tr><tr><td>Endo catchbag</td><td>Covidien</td><td>173050G</td><td></td></tr><tr><td>0 PDS</td><td>Ethicon</td><td>Z340H</td><td></td></tr><tr><td>2-0 Vicryl</td><td>Ethicon</td><td>J459H</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Vicryl</td><td>Ethicon</td><td>J426H</td><td></td></tr><tr><td>Dermabond</td><td>Ethicon</td><td>DNX12</td><td>Medicazione sterile</td></tr><tr><td>Williams'-E Polvere&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>ME16060P1</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8875-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Penna/Streptococco</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Corning</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (g/L)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1679-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl (g/L)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911-500G</td><td></td></tr><tr><td>EGTA (g/L)</td><td>Oakwood Chemical</td><td>45172</td><td></td></tr><tr><td>N-acetil-L-cisteina</td><td>Oakwood Chemical</td><td>3631</td><td></td></tr><tr><td>(N-A-C, g/L)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165-100G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 2H2O (g/L)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>223506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi D (mg/mL)</td><td>Crescent Chemical</td><td>17456.2</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Desametasone</td><td>Fresenius Kabi</td><td>NDC6337</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita epidermico</td><td>Gibco</td><td>PHG0314</td><td></td></tr></tbody></table>

lentivirali terapia genica mediata da vettore di epatociti ex vivo per trapianto autologo nei suini

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

La terapia genica è una scelta ideale per curare molti errori congeniti del metabolismo del fegato. Ex-vivo, vettori lentivirali sono stati utilizzati con successo nel trattamento di molte malattie ematopoietiche in esseri umani, come il loro utilizzo offre l'espressione del transgene stabile grazie alla capacità del vettore di integrare nel genoma ospite. Questo metodo viene illustrata l'applicazione di ex vivo terapia genica degli epatociti a un grande modello animale della tirosinemia ereditaria di tipo I. Questo processo è costituito da 1) isolamento di epatociti primari dall'animale autologo donatore/ricevente, 2) ex vivo consegna del gene tramite trasduzione degli epatociti con un vettore lentivirale e 3) autologo trapianto di epatociti corretti tramite portale della vena di iniezione. Successo del metodo si basa generalmente su rimozione efficiente e sterile della resezione epatica, un'attenta gestione dell'esemplare asportato per l'isolamento degli epatociti vitali sufficienti per trasduzione del ri-innesto, ad alta percentuale di cellule isolate, e procedure chirurgiche asettiche in tutto per prevenire l'infezione. Guasto tecnico presso uno di questi passaggi si tradurrà in basso rendimento degli epatociti trasdotte praticabili per trapianto autologo o infezione dell'animale donatore/ricevente. Il modello di maiale di tirosinemia ereditaria di tipo 1 umano (HT-1) scelto per questo approccio è unicamente suscettibile di tale metodo, come anche una piccola percentuale di attecchimento di cellule corrette porterà alla ripopolazione del fegato con le cellule sane, basate su un potente vantaggio selettivo negli epatociti nativo-malato. Anche se questa selezione di crescita non sarà vera per tutte le indicazioni, questo approccio è una Fondazione per l'espansione in altre indicazioni e permette per la manipolazione di questo ambiente di affrontare ulteriori malattie, sia all'interno del fegato e oltre, controllo per l'esposizione al vettore virale e opportunità per fuori bersaglio tossicità e carcinogenicità.

La resezione epatica e trapianto autologo sono rappresentati schematicamente in Figura 1. In un gruppo rappresentativo di 5 maiali che hanno subito la resezione epatica, la maggior parte avevano rendimenti di &gt; 1 x 109 epatociti con circa 80% di vitalità (tabella 2), fornendo un sacco di cellule per qualsiasi tipo di desiderato manipolazioni, tra cui gene terapia. Successiva cultura della parte non sottoposti a trapianto di epat...

Questo protocollo è destinato per descrivere la consegna di porcino dell'epatocita isolamento ed ex vivo del gene per curare modelli di malattie metaboliche tramite trapianto autologous della cellula. Anche se questo particolare modello gode di vantaggi unici che favoriscono la riuscita terapia, l'applicazione è una Fondazione pertinente all'indirizzo di indicazioni e altre malattie.

Lentivirali terapia genica mediata da vettore di epatociti Ex Vivo per trapianto autologo nei suini

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...

La terapia genica ex vivo e il trapianto di cellule autologhe per il trattamento degli errori inborni del metabolismo nel fegato è un'importante alternativa alla terapia per questi disturbi. E ci permette non solo di trattare questi disturbi, ma anche di capire la biomassa necessaria per poter ottenere un risultato terapeutico. Questo approccio evita anche le significative conseguenze dell'immunosoppressione e altre conseguenze con diversi tipi di terapie.Nel contesto attuale, stiamo usando questo approccio per trattare la tirosinemia ereditaria di tipo 1. Tuttavia, l'idea è che questo sarà un approccio piattaforma per trattare una moltitudine di diverse malattie del fegato con alterazione minima. È importante essere in grado di visualizzare questa tecnica perché c'è una certa variabilità quando si tratta di visualizzare l'efficienza della perfusione, che è essenziale per ottenere epatociti vitali per il trapianto.Procedura chirurgica eseguita da Robert Kaiser e Joseph Lillegard. Isolamento cellulare eseguito da Zeji Du, Bruce Amiot. La purificazione cellulare UAU e la trasduzione ex vivo delle cellule sono state fatte da Caitlin VanLith.La preparazione degli animali e la preparazione or è stata fatta da Kari Allen e Laurie Hillin. Per eseguire l'ingresso iniziale del sito portuale, eseguire una tecnica Hasson aperta cephalad all'ombelico di un maiale da fattoria bianco anestetizzato, fino a tre mesi, grande. Introduzione di un trocar di 12 millimetri nella cavità addominale, dove è visibile il peritoneo.Quando il trocar è in posizione, passare un mirino di 5 millimetri e 30 gradi attraverso la porta di ingresso e insufflate l'addome con anidride carbonica a 15 millimetri di mercurio. Sotto visualizzazione diretta con la fotocamera laparoscopica, posizionare 2 porte aggiuntive da 5 millimetri, triangolando sul lobo laterale sinistro del fegato. E posizionare il laparoscopio in una delle nuove porte.Identificare il segmento laterale sinistro del fegato nel punto della fessura maggiore del lobo sinistro che separa i segmenti mediali e laterale sinistro. E usa una cucitrice chirurgica per fissare le strutture vascolari e la vena epatica lungo questa fessura. Trasmetti il parenchima attraverso questa fessura usando cotere sequenziali e carichi vascolari lunghi 60, 45 o 30 millimetri.Al termine della resezione, valutare il fegato residuo per garantire un'emostasi adeguata e utilizzare afferratori endoscopici e un sacchetto di recupero del tessuto endoscopico per recuperare la sezione epatica. Ora, rimuovere le porte e utilizzare una sutura zero di dimensione interrotta per la fascia della linea mediana. Una sutura 2-0 in esecuzione per lo strato dermico profondo.E una sutura 4-0 in esecuzione per lo strato sottocuticolare, per chiudere l'incisione della porta di 12 millimetri nei tre strati. Quindi chiudere le porte di cinque millimetri in uno strato con 2-0 suture. E mettere una medicazione sterile sulle incisioni.Per l'isolamento degli epatociti, collegare prima una pompa peristaltica impostata per fornire le soluzioni di dispersione, mantenute in un bagno d'acqua di 43 gradi Celsius, ai cateteri da posizionare nei grandi vasi esposti della sezione epatica. Innescare la pompa e i tubi con la perfusione due soluzioni, fino a una posizione di arresto del cazzo per passare tra la perfusione uno e la perfusione due forniture di soluzione al tessuto. E passare il cazzo di arresto alla perfusione in una posizione.Quindi innescare il resto del set di tubi. Riempire completamente una trappola a bolle in linea per evitare l'introduzione di bolle d'aria nel tessuto. Successivamente, fare un'incisione trasversale pulita, perpendicolare alla circolazione epatica per rivelare sezioni trasversali dei rami delle vene portale e delle vene epatiche per la cateterizzazione.E utilizzare un catetere aderente per cateterizzare le vene disponibili e esposte. Quando i cateteri sono in posizione, perfondere il tessuto epatico reinsediato con perfusione calda una soluzione a una portata di 100 millimetri al minuto. Spostare il tubo di uscita dalla vena alla vena ogni 30-60 secondi.E usando un tubo di evacuazione per rimuovere il tampone in eccesso dal vassoio del tessuto. Dopo aver pedalando attraverso tutte le vene disponibili per 15-20 minuti, passare alla perfusione due soluzioni nelle stesse condizioni. Utilizzando una pompa di ritorno per riciclare la perfusione due soluzioni al serbatoio, a una portata più lenta, per la re-somministrazione nel tessuto.Controllare la temperatura superficiale della trappola a bolle e, o il fegato circa ogni cinque minuti per confermare che gli epatociti non si raffreddore. Quando il fegato brilla dopo circa 30 minuti di perfusione, trasferire il tessuto in un contenitore sterile, avvolto con un drap sterile, e posizionare il contenitore in una cappa di coltura cellulare per mantenere la sterilità durante la lavorazione degli epatociti. L'isolamento della collagenasi degli epatociti e la dissociazione cellulare devono essere fatti completamente in modo da non avere un raggruppamento delle cellule che diminuisce la vitalità delle cellule e la frequenza di trasduzione.Immergere il fegato con mezzo di lavaggio epatocita e trascinare le forbici sulla parte superiore del tessuto per interrompere la capsula del fegato. Indossando guanti sterili, massaggiare delicatamente il fegato per rilasciare gli epatociti nel mezzo. E filtrare il supernatante tissutale, attraverso una garza sterile, in bottiglie di centrifuga da 200 millilitri.Raccogliere gli epatociti filtrati per centrifugazione. Mettere in comune le cellule in 150 millilitri di mezzo di lavaggio epatocita fresco in un'unica bottiglia da 200 millilitri per 2 lavaggi aggiuntivi. E contando le cellule dopo la terza centrifugazione.Quindi, diluire le cellule a 1 per 10 al nono epatociti per concentrazione salina millilitro. Per l'autotrapianto degli epatociti isolati, utilizzare un trasduttore da due-cinque megahertz per identificare la vena del portale tramite ultrasuoni e dirigere un ago da cinque pollici e 18 gauge verso la vena del portale principale, approssimativamente alla sua biforcazione. Caricare le cellule in una siringa da 60 millilitri, in base al volume totale della cella e attaccare la siringa all'ago, facendo attenzione a non introdurre bolle.Successivamente, deprimere lentamente lo stantuffo della siringa per infondere manualmente fino a 1 per 10 al nono epatociti attraverso la vena portale utilizzando un catetere per infusione per monitorare la pressione porale durante il trapianto. Una volta consegnate tutte le cellule, rimuovere il catetere e monitorare la vena porta per la presenza di eventi trombotici e il flusso in avanti tramite ultrasuoni. In una coorte rappresentativa di cinque suini, che è stata sottoposta a resezione epatica, la maggior parte aveva rese superiori al 10 al nono epatociti con circa l'80% di vitalità.Fornire un numero sufficiente di cellule per qualsiasi tipo di manipolazione desiderata, compresa la terapia genica. La successiva coltura della porzione non trapiantata di questi epatociti preparati, ha dimostrato una buona vitalità e adesione con una tipica morfologia epatocitaria 46 ore dopo la loro trasduzione e placcatura iniziale. Un innesto iniziale varia in base al numero di cellule reintrodotta durante il trapianto.Queste biopsie rappresentative dimostrano una linea temporale di espansione cellulare corretta dal gene. Unico per malattie, come la tirosinemia ereditaria di tipo 1, che godono di una pressione selezionata positiva per le cellule sane. Questa espansione è in genere completa 12 mesi dopo il trapianto.Una volta che un animale knockout idrolasi fumarilacetato trapiantato ha raggiunto circa il 20% di re-popolazione degli epatociti corretti all'interno del fegato, i livelli di tirosina si normalizzeranno rispetto agli animali di tipo selvatico. Mentre gli animali non corretti mostrano un'elevazione significativa sia nella fosfatasi alcalina che nella transaminasi aspartata rispetto agli animali di tipo selvatico, la terapia genica ex vivo riporta questi livelli di enzimi sieri alla normalità. Inoltre, la salute metabolica generale del fegato viene interrotta nei suini knockout non trattati, come indicato dalle elevazioni nell'ammoniaca circolante che vengono corrette dopo la ripopolamento con gli epatociti trattati.È importante ricordare con l'uso di questa tecnica per gestire e manipolare il tessuto con attenzione e il meno possibile. Una maggiore manipolazione o manipolazione del tessuto, porta a ridurre la vitalità delle cellule e diminuire la resa. Questo approccio può essere applicabile anche alle persone interessate a studiare la distribuzione dell'arco e le inefficienze dei grafici nelle tecniche di etichettatura, utilizzando altre tecniche al di fuori dei protocolli di trasduzione virale.Non dimenticare che lavorare con vettori virali può essere pericoloso, quindi seguire procedure di biosicurezza adeguate, oltre a indossare dispositivi di protezione individuale è necessario quando si utilizzano queste tecniche.

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Le viroterapie oncolitiche sono in fase di sviluppo come nuove terapie per il trattamento del carcinoma epatocellulare (HCC).  Qui descriviamo un metodo per la terapia locoregionale dell'HCC tramite somministrazione arteriosa epatica del virus oncolitico.

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La matrice extracellulare ricellularizzata di un fegato di ratto decellularizzato può essere utilizzata come modello tridimensionale ex vivo umanizzato per studiare la distribuzione e l'espressione transgenica di un virus o di un vettore virale.

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Iniezione della vena della coda idrodinamica di vettori di integrazione basata su trasposone consente trasfezione stabile di epatociti murini in vivo. Qui, presentiamo un protocollo pratico per sistemi di transfezione che consente l'espressione costitutiva a lungo termine di un transgene singolo o combinato espressione costitutiva e doxiciclina-viscoelastico di un transgene o miR-shRNA nel fegato.

Sistemi costitutive e inducibile per la modificazione genetica In Vivo degli epatociti Mouse usando l'iniezione della vena della coda idrodinamica

Descriviamo un protocollo per l'esecuzione di un trapianto in utero (IUT) attraverso vie endovenosa e intra-amniotic di iniezione nel modello murino. Questo protocollo consente di introdurre cellule, vettori virali e altre sostanze nell'unico ambiente fetale immunitario-tollerante.

Endovenosa e Intra-amniotic nell'Utero trapianto nel modello murino

L'obiettivo del presente protocollo è quello di isolare il primate non umano CD34+ cellule dal midollo osseo innescato, gene-modificare queste cellule con vettori lentivirali e preparare un prodotto per infusione nell'ospite autologo. La lunghezza di protocollo totale è di circa 48 ore.

Preparazione e modificazione genetica di staminali ematopoietiche Nonhuman Primate e cellule progenitrici

Qui viene presentato un protocollo per isolare e trasfezionare le cellule epiteliali primarie dell'iride e del pigmento retinico da vari mammiferi (topi, ratti, conigli, suini e bovini). Il metodo è ideale per studiare approcci di terapia genica oculare in vari set-up per analisi ex vivo e studi in vivo trasferibili all'uomo.

Isolamento, coltura e ingegneria genetica delle cellule epiteliali pigmentate primarie dei mammiferi per la terapia genica non virale

Presentiamo un protocollo per l'utilizzo di un sistema di perfusione sanguigna normotermica ex vivo per la somministrazione di terapie a un intero allotrapianto cardiaco in un modello di trapianto di cuore eterotopico suino.

Un protocollo di trapianto di cuore eterotopico suino per la somministrazione di terapie a un allotrapianto cardiaco

Utilizzando il polimero cationico a basso costo polietilenimina (PEI), abbiamo prodotto particelle lentivirali per l'espressione stabile di shRNA in cellule staminali embrionali umane H9 (hESC) e cellule progenitrici neurali derivate da H9 trasdotte transitoriamente (NPC) ad alta efficienza.

Consegna mediata lentivirale di shRNA a hESC e NPC utilizzando polietilenimina polimerica cationica a basso costo (PEI)

In questo protocollo viene descritto un modello di trapianto di fegato ortotopico suino dopo conservazione statica a freddo di organi donatori per 20 ore senza l'uso di un bypass veno-venoso durante l'attecchimento. L'approccio utilizza una tecnica chirurgica semplificata con minimizzazione della fase anepatica e sofisticata gestione del volume e del vasopressore.

Trapianto di fegato suino senza bypass veno-venoso come modello di donatore a criteri estesi

Dimostriamo un protocollo passo-passo per lo studio della funzione genica nei macrofagi residenti nel tessuto peritoneale in vivo, utilizzando vettori lentivirali.

Preparazione di vettori lentivirali per un'efficiente modulazione di geni e microRNA di macrofagi residenti nei tessuti della cavità peritoneale in vivo nei topi

Questo protocollo descrive come l'iniezione intrasplenica di small hairpin RNA erogato da AAV8 raggiunga la stessa efficienza di knockdown genico nel fegato dell'iniezione della vena porta, rappresentando una procedura più semplice con mortalità e complicanze perioperatorie e postoperatorie molto più basse.

Knockdown genico efficiente nel fegato tramite iniezione intrasplenica di piccolo RNA a forcina veicolato dal virus adeno-associato sierotipo 8 (AAV8)

Scopri la terapia genica ex vivo e il trapianto autologo di epatociti per trattare la tirosinemia ereditaria di tipo 1 nei suini. Questo metodo riduce l'immunosoppressione e offre una piattaforma per diverse malattie epatiche.

Lentivirali terapia genica mediata da vettore di epatociti Ex Vivo per trapianto autologo nei suini

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