Name: Isolamento dei Nuclei del midollo spinale adulto per il sequenziamento massivamente parallelo Single-nucleo RNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Scopri il protocollo di isolamento dei nuclei dal midollo spinale di topo per il sequenziamento RNA single-nucleo. Questo metodo consente l'analisi del profilo di espressione genica a livello di singola cellula anche su tessuti difficili da dissociare.

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Questo lavoro è stato supportato dal programma intramurale di NINDS (1 ZIA NS003153 02) e NIDCD (1 ZIA DC000059 18). Ringraziamo L. Li e C.I. Dobrott per il loro supporto tecnico e discussioni utili e Kathe C. per la revisione del manoscritto.

Tutto il lavoro animale è stato eseguito secondo un protocollo approvato dal Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo Animal Care e Comitato di uso. Bilanciato campioni di maschi e femminili topi wild-type ICR/CD-1, tra 8 e 12 settimane vecchio, sono stati utilizzati per tutti gli esperimenti. Topi devono essere manipolati conformemente alle linee guida istituzionali Animal Care e Comitato di uso locale.
1. preparazione dei materiali e buffer
<ol><li>Preparare tutti i buffer il giorno di utilizzo e pre-chill sul ghiaccio (Vedi tabella 1).<ol>
<li>Se usando il detersivo-meccanica Lisi, preparare il tampone di lisi detergente (> 500 µ l per campione), tampone di saccarosio basso (> 6 mL per campione), tampone di saccarosio densità (> 12,5 mL per campione) e la soluzione di risospensione (> 1 mL).</li>
		<li>Se si utilizza Lisi ipotonica-meccanica, preparare il tampone di Lisi ipotonica (> 5 mL per campione), mezzo di EB (> 5 mL per campione), tampone di saccarosio basso (> 3 mL per campione), buffer di densità di saccarosio (> 12,5 mL per campione) e la soluzione di risospensione (> 1 mL).</li>
		<li>Aggiungere 25 μL di ditiotreitolo (DTT) a 25 mL di buffer di saccarosio basso e un altro 25 μL di DTT a 25 mL di buffer di gradienti di densità di saccarosio appena prima di iniziare il protocollo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coprire la superficie per dissezione con foglio di alluminio per minimizzare la contaminazione del campione con fibre da carta assorbente o delle protezioni di banco, che possono ostruire i canali microfluidici utilizzate per acquisire i singoli nuclei.</li>
	<li>Con una soluzione di decontaminazione di RNasi, spray strumenti per dissezione e spazio sul banco. Inoltre, spruzzare all'interno del tubo di omogeneizzatore lisata (se si utilizza la lisi cellulare detergente-meccanico) e del tubo di Oak Ridge con una soluzione di decontaminazione di RNAsi. Sciacquare il tubo lisata e Oak Ridge con acqua ultrapura, RNAsi-libera.</li>
	<li>Pre-raffreddare tutte le provette per il prelievo (50 mL conica, Oak Ridge) e tubi omogeneizzatore lisata sul ghiaccio.</li>
	<li>Fuoco polacco una serie di pipette Pasteur (se utilizza Lisi ipotonica-meccanica delle cellule).</li>
</ol>2. preparazione del midollo spinale
<ol><li>Se si utilizza il tessuto fresco, eutanasia il mouse da inalazione di CO2 . A seguito di eutanasia, spruzzare il cappotto del mouse con etanolo al 70% per minimizzare la contaminazione di capelli nel campione.</li>
	<li>Decapita il mouse con forbici chirurgiche sharp, RNAsi-libera. Successivamente, si sollevano delicatamente addominale della pelle con il forcipe e fare un'incisione lungo la lunghezza del corpo per esporre gli organi interni.</li>
	<li>Eviscerate il mouse tirando gli organi interni dalla cavità del corpo usando il forcipe. Non usare asciugamani di carta per pulire la zona o per rimuovere gli organi come questo può introdurre contaminanti. Utilizzando le forbici, tagliare la colonna vertebrale tra le vertebre spinali, L2 e L3. Nota: Con la pratica, questo passaggio può essere raggiunto in meno di 30 secondi.<ol>
<li>Per espellere il midollo spinale, adatta una siringa da 3 mL contenenti PBS ghiacciata con un ago da 25 G ¼ di pollice. Posizionare la punta dell'ago nell'estremità sacrale della colonna vertebrale. Utilizzare due dita per pizzicare le vertebre per creare una guarnizione stretta intorno alla punta dell'ago e premere lo stantuffo per espellere il midollo spinale rostralmente. Luogo il midollo spinale in una capsula di Petri con PBS ghiacciata.</li>
		<li>A questo punto, congelare il tessuto e conservare a-80 ° C oppure utilizzare immediatamente per detergente-meccanico (passaggio 3) o lisi di ipotonico-meccanico (passaggio 4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Se utilizzando tessuto congelato, mantenere il tessuto sul ghiaccio secco, procedere al detergente-meccanico (passaggio 3) o ipotonica-meccanico (passaggio 4) lisi.</li>
</ol>3. lisi delle cellule detersivo-meccanico
<ol><li>Mettere il midollo spinale lombare in un omogeneizzatore lisata pre-refrigerato e aggiungere 500 mL pre-refrigerati buffer di lisi detergente. Nota: Un mouse nel midollo spinale lombare è 325,5 mg ± mg 63,9 errore standard della media (SEM, N = 4). 50 mg – 1,5 g di tessuto può essere utilizzato con successo.</li>
	<li>Lisata con 5 colpi di pestello (pestello 'sciolto'), quindi il 5-10 colpi di pestello B ('stretto' pestello). Evitare di sollevare l'omogeneizzatore fuori della soluzione di lisi tra colpi ed evitare di introdurre bolle.</li>
	<li>Posizionare un colino di 40 mm sopra un tubo conico pre-refrigerati da 50 mL e prewet con 1 mL di tampone basso saccarosio.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di tampone basso saccarosio per l'omogeneizzatore lisata contenente i nuclei grezzi nel buffer di lisi e mescolare delicatamente pipettando 2 – 3 volte.</li>
	<li>Passare la preparazione di nuclei grezza sopra il filtro di 40 mm nel tubo conico pre-refrigerati 50 mL.</li>
	<li>Passare un ulteriore 1 mL di tampone di saccarosio basso sopra il filtro di 40 mm, portando il volume finale a 3 mL di buffer di saccarosio basso e 500 mL di tampone di lisi.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 3.1 – 3.6 se combinando più cavi, pool nello stesso tubo conico.</li>
	<li>Centrifugare il campione a 3.200 x g per 10 min a 4 ° C. Una volta terminata la centrifugazione, decantare il supernatante. Procedere al passaggio 5.</li>
</ol>4. lisi delle cellule ipotonico-meccanica
<ol><li>Luogo il midollo spinale lombare in 5 mL di tampone di Lisi ipotonica in un piatto di coltura del tessuto. Utilizzare l'estremità smussata di forbici di primavera per bisecare il midollo spinale, quindi usare le forbici di primavera per il cavo tagliato a pezzi di 3 – 4 mm, ma non tritate. Nota: 50 mg-1,5 g di tessuto può essere utilizzato con successo.</li>
	<li>Incubare in ghiaccio per 15 min, 2 – 3 volte di turbine.</li>
	<li>Aggiungere 5 mL di mezzo di EB per diluire il tampone di Lisi ipotonica.</li>
	<li>Triturare il tessuto 10 volte con una pipetta sierologica di 5ml, o fino a quando tutti i pezzi del tessuto muoversi agevolmente attraverso l'apertura della pipetta.</li>
	<li>Triturare con una serie di tre pipette Pasteur lucidati a fuoco con diametri progressivamente più stretto (~ 900 – 600 mm).<ol>
<li>Per ogni pipetta, triturare 5 - 15 volte, permettono di tessuto per stabilirsi, rimuovere 1 – 2 mL di surnatante contenente nuclei dissociati e passare sopra un filtro di 40 mm in una provetta conica da mL 50 pre-refrigerati.</li>
		<li>Dopo la triturazione con la pipetta di Pasteur più piccolo di dimensioni, assicurarsi che l'omogeneizzato scorre senza intoppi attraverso la punta della pipetta. Passare la soluzione rimanente sopra il filtro di 40 mm nella provetta conica da 50 mL. Nota: Il numero totale di triturazioni può essere registrato a piacere. Le meningi del midollo spinale del mouse resterà, ma è importante triturare qualsiasi blocchi visibili del midollo spinale. Passare il restante omogeneato sopra il filtro di 40 m. Evitare di introdurre bolle durante la triturazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugare il campione filtrato a 1.000 x g per 10 min a 4 ° C. Una volta terminata la centrifugazione, decantare e scartare il surnatante. Procedere al passaggio 5.</li>
</ol>5. omogeneizzazione e gradiente di densità di saccarosio
<ol><li>Dopo il passaggio 3 o 4, risospendere il sedimento con 3 mL di tampone basso saccarosio. Agitare delicatamente per rimuovere il pellet dal muro per facilitare la risospensione. Lasciate che il campione sedersi sul ghiaccio per 2 min e trasferire la sospensione in una provetta di Oak Ridge.</li>
	<li>Utilizzando l'omogeneizzatore a impostazione 1, omogeneizzare i nuclei nel buffer di saccarosio bassa per 15 – 30 s, mantenendo il campione sul ghiaccio. Nota: Utilizzare 15 s se utilizza un midollo spinale lombare o 30 s se utilizzando pool di campioni o un intero midollo spinale.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta sierologica, strato 12,5 mL di tampone di saccarosio di densità sotto omogeneato di buffer del saccarosio basso, avendo cura di non per creare una bolla che sconvolge gli strati di densità.</li>
	<li>Centrifugare le provette a 3.200 x g per 20 min a 4 ° C.</li>
	<li>Una volta terminata la centrifugazione, immediatamente decantare il supernatante in un movimento flicking. Nota: Un volume residuo (meno di 400 mL) di tampone di saccarosio può essere scartato se si desidera produrre un volume più basso e pulitore del campione finale, ma questo volume residuo contengono nuclei e può essere conservato per massimizzare la resa di nuclei.</li>
	<li>Utilizzando 100 mL - 1 mL di soluzione di risospensione, risospendere i nuclei restanti sulla parete. Evitare la mielina 'aggrottare le sopracciglia' che rimane con la preparazione a base di detergente.</li>
	<li>Filtrare i nuclei attraverso un colino di formato del poro di 30 – 35 mm e raccogliere in un tubo pre-refrigerato.</li>
	<li>Determinare i nuclei rendimento utilizzando un emocitometro per contare i nuclei sotto un obiettivo 10x. Nota: Tripan blu possa essere aggiunti per visualizzare i nuclei, che dovrebbero apparire blu. Si noti la quantità di detriti cellulari.</li>
	<li>Procedere al passaggio 6 o 7.</li>
</ol>6. massively Parallel snRNA-Sequencing: piattaforma accademico7
<ol><li>Eseguire il sequenziamento di parallelismo massivo snRNA (ad es., goccia-Seq) metodo descritto in precedenza7 con le seguenti modifiche:4<ol>
<li>Regolare i nuclei ad una concentrazione finale di 225 nuclei / mL.</li>
		<li>Preparare con codice a barre perline ad una concentrazione di 250 perline per mL.</li>
		<li>Preparare il tampone di lisi con 0,7% sarkosyl.</li>
		<li>Regolare le portate a 35 mL / min per perline, 35 mL / min per i nuclei e 200 mL / min per l'olio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. massicciamente parallelo snRNA-sequenziamento: piattaforma commerciale26
<ol><li>Eseguire snRNA-sequenziamento massivamente parallelo utilizzando la piattaforma commerciale (ad es., soluzione di cromo Single Cell Gene Expression) prodotti secondo istruzioni26 con la seguente modifica del produttore:<ol>
<li>A seguito di d'inversione-trascrizione, aggiungere un ulteriore ciclo di PCR il numero calcolato di cicli per l'amplificazione del cDNA basata sul recupero cellulare mirata per compensare la diminuzione del cDNA da nuclei rispetto alle cellule.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li>
<li>Hu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+Cell-Type+Composition+and+Activity-Dependent+Transcriptional+State+in+Mammalian+Brains+by+Massively+Parallel+Single-Nucleus+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq.</a> Molecular Cell. 68 (5), 1006-1015 (2017).</li>
<li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+Activated+Cell+Populations+Using+Single-Cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li>
<li>Sathyamurthy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+Parallel+Single+Nucleus+Transcriptional+Profiling+Defines+Spinal+Cord+Neurons+and+Their+Activity+during+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior.</a> Cell Reports. 22 (8), 2216-2225 (2018).</li>
<li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).</li>
<li>Campbell, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+census+of+arcuate+hypothalamus+and+median+eminence+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types.</a> Nature Neuroscience. 20 (3), 484-496 (2017).</li>
<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+RNA-Seq+Reveals+Hypothalamic+Cell+Diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity.</a> Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).</li>
<li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343 (6172), 776-779 (2014).</li>
<li>Li, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatosensory+neuron+types+identified+by+high-coverage+single-cell+RNA-sequencing+and+functional+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity.</a> Cell Research. 26 (8), 967(2016).</li>
<li>Shin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+RNA-Seq+with+Waterfall+Reveals+Molecular+Cascades+underlying+Adult+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis.</a> Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).</li>
<li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).</li>
<li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).</li>
<li>Villani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+reveals+new+types+of+human+blood+dendritic+cells%2C+monocytes%2C+and+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors.</a> Science. 356 (6335), (2017).</li>
<li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li>
<li>Lacar, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+RNA-seq+of+single+neurons+reveals+molecular+signatures+of+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation.</a> Nature Communications. 7, 11022(2016).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li>
<li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.pnas.org/content/110/49/19802.short">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li>
<li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).</li>
<li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+nuclei+isolation+from+human+postmortem+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).</li>
<li>Bergmann, O., Jovinge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cardiomyocyte+nuclei+from+post-mortem+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li>
<li>Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Filtration-based+Method+of+Preparing+High-quality+Nuclei+from+Cross-linked+Skeletal+Muscle+for+Chromatin+Immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).</li>
<li>Halder, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+changes+in+plasticity+genes+accompany+the+formation+and+maintenance+of+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">DNA methylation changes in plasticity genes accompany the formation and maintenance of memory.</a> Nature Neuroscience. 19 (1), 102-110 (2016).</li>
<li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-nucleus+RNA-seq+with+DroNc-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq.</a> Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).</li>
<li>10X Genomics. Sample Preparation Demonstrated Protocols: Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing</a> (2018).</li>
<li>10X Genomics. <a target="_blank" href="https://www.salk.edu/wp-content/uploads/2017/11/10XUserGuide.pdf">Single Cell 3' Reagent Kits v2 User Guide</a>. , (2018).</li>
<li>Fu, Y., Rusznak, Z., Herculano-Houzel, S., Watson, C., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+composition+characterizing+postnatal+development+and+maturation+of+the+mouse+brain+and+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">Cellular composition characterizing postnatal development and maturation of the mouse brain and spinal cord.</a> Brain Structure and Function. 218 (5), 1337-1354 (2013).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+strategy+for+single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+confirms+accuracy+in+predicted+cell-type+expression+from+nuclear+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6031(2017).</li>
<li>Bakken, T. E. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/early/2017/12/25/239749">Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing.</a> bioRxiv. , (2018).</li>
<li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Div-Seq%3A+Single-nucleus+RNA-Seq+reveals+dynamics+of+rare+adult+newborn+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons.</a> Science. 353 (6302), 925-928 (2016).</li>
</ol>

Non abbiamo conflitti di interesse a divulgare.

L'obiettivo finale di questo protocollo è quello di isolare i nuclei contenente RNA di alta qualità per analisi trascrizionale a valle. Abbiamo adattato snRNA-Seq metodi al fine di profilo di tutti i tipi di cellule nel midollo spinale. Inizialmente, abbiamo trovato che metodi dissociazione tipici delle cellule erano inefficaci per la sequenziazione di singola cellula RNA, come neuroni del midollo spinale sono particolarmente vulnerabili alla morte delle cellule. Inoltre, metodi di dissociazione delle cellule inducono l'...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58413/isolation-adult-spinal-cord-nuclei-for-massively-parallel-single">Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing</a>. The Protocol section was updated.
Step 3.1 was updated from:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 mL pre-chilled detergent lysis buffer.
to:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 &#956;L pre-chilled detergent lysis buffer.
Step 3.6 was updated from:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 mL of the lysis buffer.
to:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 &#956;L of the lysis buffer.
Step 5.5 was updated from:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion. 
NOTE: A residual volume (less than 400 mL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
to:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion. 
NOTE: A residual volume (less than 400 &#956;L) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
Step 5.6 was updated from:
Using 100 mL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin &#8216;frown&#8217; that remains with the detergent-based preparation.
to:
Using 100 &#956;L - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin &#8216;frown&#8217; that remains with the detergent-based preparation.
Steps 6.1.1 - 6.1.4 were&#160;updated from:
<ol>
	<li>Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per mL.</li>
	<li>Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per mL.</li>
	<li>Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.</li>
	<li>Adjust the flow rates to 35 mL per min for beads, 35 mL per min for nuclei, and 200 mL per min for oil.</li>
</ol>
to:
<ol>
	<li>Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per &#956;L.</li>
	<li>Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per &#956;L.</li>
	<li>Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.</li>
	<li>Adjust the flow rates to 35 &#956;L per min for beads, 35 &#956;L per min for nuclei, and 200 &#956;L per min for oil.</li>
</ol>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58413/isolation-adult-spinal-cord-nuclei-for-massively-parallel-single">Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing</a>. The Protocol section was updated.

Erratum: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Il sistema nervoso è composto da gruppi eterogenei di cellule che visualizzano una gamma diversificata di proprietà morfologiche, biochimiche ed elettrofisiologiche. Mentre il sequenziamento di RNA di massa è stato utile per determinare le modifiche a livello di tessuto nell'espressione genica in condizioni diverse, non preclude il rilevamento delle modifiche trascrizionali a livello di singola cellula. Gli avanzamenti recenti nell'analisi trascrizionale monocellulari hanno permesso la classificazione delle cellule eterogenee in gruppi funzionali basati sul loro repertorio molecolare e possono essere sfruttati anche per rilevare insiemi di neuroni che erano stato recentemente attivi. 1 , 2 , 3 , 4 negli ultimi dieci anni, lo sviluppo della singola cella RNA sequenziamento (scRNA-Seq) ha permesso lo studio dell'espressione genica in cellule individuali, offrendo una visione diversità di cellula-tipo. 5
L'emergere di approcci scalabili come parallelismo massivo scRNA-Seq, ha fornito piattaforme ai tessuti eterogenei sequenza, tra cui molte regioni del sistema nervoso centrale. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 tuttavia, metodi di dissociazione di singola cellula possono portare a morte cellulare, nonché di modifiche sperimentali nell'espressione genica. 16 lavoro recente ha adattato i metodi di sequenziamento di singola cella per consentire la conservazione dei profili trascrizionali endogeni. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 queste strategie sono state particolarmente adatte per la rilevazione di espressione genica (IEG) inizio immediato seguito stimolo sensoriale o comportamento. 3 , 4 In futuro, questa strategia potrebbe essere utilizzata anche per studiare i cambiamenti dinamici in tessuti negli Stati di malattia o in risposta allo stress. Di questi metodi, sequenziamento singolo nucleo RNA (snRNA-Seq) è un approccio promettente che non comporta la dissociazione di cella stressanti e può essere utilizzato su difficile dissociare il tessuto (ad esempio il midollo spinale), come pure congelati tessuto. 4 , 17 , 18 , 19 adattato da precedenti metodi di isolamento di nuclei,20,21,22,23,25 snRNA-Seq in genere utilizza delle cellule e la rottura rapida dei tessuti Lisi sotto condizioni di freddo, centrifugazione e separazione dei nuclei da detriti cellulari. 4 nuclei possono essere isolati per il sequenziamento di nuova generazione a valle su piattaforme multiple di incapsulamento gocciolina microfluidica. 4 , 7 , 24 , 25 questo metodo permette un'istantanea dell'attività trascrizionale di migliaia di cellule in un momento nel tempo.
Ci sono strategie multiple per rilasciare i nuclei dalle cellule prima di isolamento e sequenziamento, ciascuno con i propri vantaggi e svantaggi. Qui, descriviamo e confrontare due protocolli per consentire l'isolamento dei nuclei dal midollo spinale adulto per il parallelismo massivo a valle snRNA-Seq: detergente-meccanica Lisi e Lisi ipotonica-meccanico. Detergente-meccanica Lisi fornisce la rottura completa del tessuto e una maggiore resa finale dei nuclei. Meccanica-Lisi ipotonica includono un livello controllabile di rottura del tessuto, fornendo un'opportunità per la selezione di un equilibrio tra la quantità e la purezza del rendimento nucleare finale. Questi approcci forniscono paragonabile rendimento del RNA, rilevati numeri di geni al nucleo e la cellula-tipo di profilatura e anche entrambi possono essere utilizzati con successo per snRNA-segg.

<table><tbody><tr><td>Saccarosio</td><td>Invitrogen</td><td>15503-022</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES (pH = 8.0)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td></td></tr><tr><td>MgAc</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5661-50G</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA (pH = 8.0)</td><td>Corning</td><td>MT-46034CI</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10197777001</td><td>Aggiungere DTT appena prima dell'uso</td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi</td><td>Crystalgen</td><td>221-238-10</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl (pH = 7,4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2194</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59222C</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate-A</td><td>Gibco</td><td>A12475-01</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>B27 (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Crystalgen</td><td>221-133-10</td><td></td></tr><tr><td>0,04% BSA</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>0,2 U/ &mu; L Inibitore dell'RNAsi</td><td>Lucigen</td><td>30281-1</td><td></td></tr><tr><td>Oak Ridge Centrifuga Tubo</td><td>Thermo Scientific</td><td>3118-0050</td><td></td></tr><tr><td>Monouso Cotone Tappo Borosilicato-Glass Pasteur Pipets</td><td>Fisher</td><td>Scientific 13-678-8B</td><td></td></tr><tr><td>Tessuto di vetro Dounce (2 mL)</td><td>Kimble</td><td>885303-002</td><td></td></tr><tr><td>Pestello in vetro di grande spazio</td><td>Kimble</td><td>885301-0002</td><td></td></tr><tr><td>Pestello in vetro di piccola distanza</td><td>Kimble</td><td>885302-002</td><td></td></tr><tr><td>T 10 Omogeneizzatore Basic Ultra Turrax</td><td>IKA</td><td>3737001</td><td></td></tr><tr><td>Strumento di dispersione (S 10 N &ndash; 5G)</td><td>IKA</td><td>3304000</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0,4%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; filtro per celle m</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers, 30 &mu; m</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche</td><td>Denville Scientific</td><td>1000799</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR Centrifuga</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004505</td><td></td></tr><tr><td>Fiberlite F15-6 x 100y Rotore ad angolo fisso</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75003698</td><td></td></tr><tr><td>Pipette stereologiche: 5 mL, 10 mL</td><td>Denville Scientific</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>Daigger Scientific EF16034F</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemgenes Barcoding Beads</td><td>Chemgenes</td><td>Macosko-2011-10</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap Soluzione di decontaminazione RNasi</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 &mu; m)</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Selezionatore cellulare MoFlo Astrios</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td></td></tr><tr><td>Kit multiplex di cromo i7, 96 rxns</td><td>10X Genomics</td><td>120262</td><td></td></tr><tr><td>Cromo a cellula singola 3' Kit di librerie e perline di gel v2, 4 rxns</td><td>10X Genomics</td><td>120267</td><td></td></tr><tr><td>Kit di chip A a singola cellula di cromo, 16 rxns</td><td>10X Genomics Piastra per coltura tissutale</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(60 mm x 15 mm)</td><td>Corning</td><td>353002</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento dei nuclei del midollo spinale adulto per il sequenziamento massivamente parallelo single-nucleo rna

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Espressione genica di una singola cella di sondaggio consente l'identificazione del tipo di cella e stato della cellula. Sequenziamento di RNA di cella singola è emerso come un potente strumento per lo studio di profili trascrizionali delle cellule, particolarmente in tessuti eterogenei, come il sistema nervoso centrale. Tuttavia, metodi di dissociazione richiesti per il sequenziamento di singola cellula possono portare a modifiche sperimentali nella morte delle cellule e l'espressione genica. Inoltre, questi metodi sono generalmente limitati ai tessuti freschi, limitando così gli studi su archiviazione e materiale bio-banca. Sequenziamento di singolo nucleo RNA (snRNA-Seq) è un'alternativa attraente per gli studi trascrizionale, dato che esso identifica i tipi di cellule con precisione, permette lo studio del tessuto che è congelato o difficile dissociare, e riduce la dissociazione indotta trascrizione. Qui, presentiamo un protocollo ad alta velocità per il rapido isolamento dei nuclei per downstream snRNA-segg. Questo metodo attiva l'isolamento dei nuclei da campioni di midollo spinale fresco o congelato e può essere combinato con due piattaforme di incapsulamento di parallelismo massivo della gocciolina.

Qui, abbiamo effettuato l'isolamento dei nuclei dal midollo spinale lombare topo adulto per sequenziamento di RNA massicciamente parallelo a valle. Il protocollo ha coinvolto tre componenti principali: tessuto rottura e cellular Lisi, omogeneizzazione e saccarosio centrifugazione di densità (Figura 1). In pochi secondi, la lisi di detersivo-meccanici ha reso una preparazione di nuclei grezzo con un gran numero di nuclei così come detriti cellulari e tissutali...

Qui, presentiamo un protocollo per isolare rapidamente i nuclei di alta qualità dal tessuto fresco o congelato per sequenziamento di RNA massicciamente parallelo a valle. Includiamo opzioni lisi delle cellule e la rottura detergente-meccanica e ipotonico-meccanica del tessuto, entrambi dei quali possono essere utilizzati per l'isolamento dei nuclei.

Isolamento dei Nuclei del midollo spinale adulto per il sequenziamento massivamente parallelo Single-nucleo RNA

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula è un potente strumento per studiare i profili trascrittivi delle cellule, in particolare nel tessuto eterogeneo, come il sistema nervoso centrale. Questo protocollo fornisce un metodo per isolare i nuclei per il sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo. Usando nuclei al posto delle cellule, questo metodo può essere applicato a tessuti difficili da dissociare, così come ai tessuti congelati.Inoltre, questo metodo può essere applicato allo studio di cambiamenti specifici del tipo di cellula nelle cellule a seguito di malattia o lesione. Iniziare questa procedura con l'eutanasia del mouse, come descritto nel protocollo di testo. Successivamente, fai un'incisione lungo la lunghezza del corpo per esporre gli organi interni.Eviscerare il topo tirando gli organi interni dalla cavità corporea usando le forcep. Non utilizzare tovaglioli di carta per pulire l'area o rimuovere organi, in quanto ciò potrebbe introdurre contaminanti. Usando le forbici, tagliare la colonna vertebrale tra le vertebre spinali L2 e L3.Per espellere il midollo spinale, montare una siringa da tre millilitri contenente PBS ghiacciato con un ago da 1/4 di pollice calibro 25. Posizionare la punta dell'ago nell'estremità sacrale della colonna vertebrale. Utilizzare due dita per pizzicare le vertebre per creare una tenuta stretta intorno alla punta dell'ago e premere verso il basso sullo stantuffo per espellere il midollo spinale rostralmente.Posizionare il midollo spinale in una piastra di Petri con PBS ghiacciato. Se è richiesta solo la porzione lombare del cordone ombelicale, tagliare le porzioni sacrali e toraciche del midollo spinale. A questo punto, congelare il tessuto e conservare a meno 80 gradi Celsius, o utilizzare immediatamente per la lisi cellulare meccanica del detergente come descritto qui, o lisi meccanica ipotonica come descritto nel protocollo di testo.Per determinare la lisi cellulare meccanica del detergente, posizionare il midollo spinale lombare in un omogeneizzatore Dounce pre-refrigerato e aggiungere 500 microlitri di tampone di lisi detergente prerimorto. Dounce con cinque tratti del pestello sciolto, A, e poi da cinque a 10 colpi del pestello stretto, B.Evitare di sollevare l'omogeneizzatore al di fuori della soluzione di lisi tra un tratto e l'altro ed evitare di introdurre bolle. Ora, posizionare un colino da 40 micron su un tubo conico pre-refrigerato da 50 millilitri e pre-bagnato con un millilitro di tampone di saccarosio basso.Aggiungere un millilitro di tampone di saccarosio basso all'omogeneizzatore Dounce contenente i nuclei grezzi nel tampone di lisi e mescolare delicatamente pipettando da due a tre volte. Passare i nuclei grezzi prep sopra il colino da 40 micron, nel tubo conico pre-refrigerato da 50 millilitri. Passare un ulteriore tampone di saccarosio basso di un millilitro sul colino da 40 micron, portando il volume finale a tre millilitri del tampone di saccarosio basso e a 500 microlitri del tampone di lysis.Ripetere questi passaggi se si combinano più cavi, raffreddando nello stesso tubo conico. Quindi, centrifugare il campione a 3200 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Una volta completata la centrifugazione, decantare il supernatante.Sospendiamo la tavolozza usando tre millilitri di tampone di saccarosio basso. Ruotare delicatamente per rimuovere il pellet dalla parete per facilitare la sospensione. Dopo aver lasciato riposare il campione sul ghiaccio per due minuti, trasferire la sospensione su un tubo Oak Ridge.Utilizzando l'omogeneizzatore all'impostazione di uno, omogeneizzare i nuclei in tampone di saccarosio basso per 15-30 secondi, mantenendo il campione sul ghiaccio. Quindi, utilizzare una pipetta sierologica per stratificazione di 12,5 millilitri di tampone di saccarosio a densità, sotto l'omogeneato tampone di saccarosio basso, facendo attenzione a non creare una bolla che interrompa gli strati di densità. Centrifugare i tubi a 3200 volte G, per 20 minuti a quattro gradi Celsius.Una volta completata la centrifugazione, decantare immediatamente il supernatante in un movimento di sfarfallio. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di rimuovere immediatamente il tubo oak ridge dalla centrifuga e decantare rapidamente il supernatante. Utilizzando 100 microlitri per un millilitro di soluzione di resuspensione, sospendiamo i nuclei rimanenti sulla parete.Evitare il cipiglio di mielina che rimane con la preparazione a base di detergente. La mancata zione rapida di questi passaggi può comportare una preparazione dei nuclei con detriti cellulari in eccesso, o mielina, che può impedire il sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo a valle. Filtrare i nuclei attraverso un colino di dimensioni dei pori da 30 a 35 micron e raccogliere in un tubo pre-refrigerato.Determinare la resa dei nuclei, usando un emocitometro per contare i nuclei sotto un obiettivo 10 x, prima di procedere al sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo, come descritto nel protocollo di testo. Il campo luminoso e le immagini epifluorescenti dei nuclei, isolati utilizzando il protocollo di lisi meccanica del detergente, sono mostrate a 10 x. Questi nuclei sono isolati in modo imparziale, consentendo lo studio dei profili di espressione genica endogena a livello di una singola cellula.Mostrato qui, è un grafico tSNE rappresentativo del sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo, da un midollo spinale lombare del topo, usando una piattaforma di incapsulamento delle goccioline massicciamente parallela. I nuclei isolati dal tessuto fresco o congelato possono essere utilizzati per il sequenziamento su piattaforme commerciali e accademiche. Questa tecnica consente ai ricercatori di esplorare i profili trascrittivi a livello di singola cellula, utilizzando tessuti difficili da dissociare, come il midollo spinale, o anche il tessuto congelato, come il materiale biobancario.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ridurre la quantità di tempo tra eutanasia elisi cellulare. Inoltre, è importante ridurre al minimo le bolle introdotte nelle soluzioni dalla lisi cellulare alla resopensione e acquistare nuclei animali domestici con cura. Seguendo questa procedura, i nuclei possono essere utilizzati per applicazioni alternative, come lo smistamento dei facs, al fine di isolare tipi di cellule specifici.

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Isolamento di Microglia specifico della regione da un emisfero cerebrale di topi adulto per il sequenziamento profondo dell'RNA a singola cellula

Questa pubblicazione descrive un protocollo per l'isolamento dei nuclei dagli adipociti maturi, la purificazione mediante lo smistamento attivato dalla fluorescenza e la trascrittomica a livello di cellula.

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Isolamento dei nuclei da tumori cerebrali freschi congelati per RNA-seq a nucleo singolo e ATAC-seq

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Isolamento dei nuclei dal rene di topo adulto per il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo

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Isolamento del nucleo a basso ingresso e multiplexing con anticorpi con codice a barre dei gangli simpatici del topo per il sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo

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Isolamento di nuclei da tessuto epatico congelato per multiomiche monocellulari

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Isolamento di nuclei da cellule progenitrici cardiache di topo per il profilo dell'epigenoma e dell'espressione genica a risoluzione di singole cellule

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Un protocollo semplice, rapido e parzialmente automatizzato per l'isolamento di singoli nuclei da tessuti di mammiferi congelati per il sequenziamento di singoli nuclei

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Isolamento ottimizzato dei nuclei da campioni di tumore solido freschi e congelati per il sequenziamento di più omi

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Isolamento dei Nuclei del midollo spinale adulto per il sequenziamento massivamente parallelo Single-nucleo RNA

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