Purificazione dei tripanosomi extracellulare, tra cui africana, dal sangue mediante scambiatori di anioni (colonne Diethylaminoethyl-cellulosa)
6 aprile 2019
Questo metodo di separazione Tripanosoma dal sangue dipende dalla loro carica superficiale essendo meno negativo rispetto a cellule del sangue dei mammiferi. Sangue infetto è collocato e trattati su una colonna di scambiatore di anioni. Questo metodo, più il montaggio diagnostico per la tripanosomiasi africana, fornisce parassiti purificati per indagini immunologiche, biologiche, biochimiche, farmaceutiche e biologia molecolare.
I tripanosomi africani sono responsabili della tripanosomiasi africana umana, della malattia del sonno e della tripanosomiasi africana animale. I tripanosomi che causano la malattia del sonno sono parassiti protisti trasmessi dalla mosca tse-tse presenti in molti focolai geografici nell'Africa subsahariana. Il rilevamento del parassita è essenziale per la diagnosi, il trattamento e il follow-up.
Una sierologia può dare risultati falsi positivi e, sfortunatamente, falsi negativi. Per aiutare il rilevamento nel sangue, i tripanosomi devono essere concentrati. Sono state utilizzate varie tecniche di concentrazione dei parassiti.
Il metodo più sensibile è la separazione dei parassiti dal sangue da una colonna di scambiatore di anioni, cellulosa DEAE seguita da centrifugazione e osservazione microscopica. Di conseguenza, il metodo della cellulosa DEAE è il migliore e rimane fino ad oggi, il metodo di riferimento per visualizzare e isolare i parassiti dal sangue per la diagnosi di tripanosomiasi africana umana, specialmente in condizioni di campo. Questo metodo, la diagnosi più appropriata per la tripanosomiasi africana fornisce anche parassiti purificati per indagini immunologiche, biologiche, biochimiche, farmaceutiche e biologiche molecolari.
Tutte le indagini sono conformi alla guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio e l'accordo è stato ottenuto dalle autorità francesi e tutti i protocolli utilizzati sono stati approvati dal nostro comitato etico locale. Pesare ogni sostanza secondo il protocollo scritto. Aggiungere acqua distillata e regolare con precisione al pH 8 con fosfato di diidrogeno di potassio per fare le seguenti soluzioni tamponate, concentrato tampone fosfato saline 2X.
Aggiungere acqua distillata e glucosio per il glucosio salino tamponato con fosfato. Per 100 millilitri di tampone di eluizione, aggiungere 100 unità per millilitro di penicillina, 100 microgrammi per millilitro di streptomicina e cinque microgrammi millilitro di fenolo rosso a glucosio salino tamponato fosfato. 100 grammi di cellulosa DEAE vengono prima lavati con tre litri di acqua distillata e poi lasciati depositare.
Le particelle fini vengono scartate. I lavaggi vengono ripetuti fino a quando il supernatante non è chiaro. Viene aggiunta una salina tamponata con fosfato concentrato 2X e viene mescolata la cellulosa DEAE.
Il pH è regolato a otto con un fosfato molare di potassio. La cellulosa viene quindi lavata due volte con acqua distillata e due volte con glucosio salino tamponato con fosfato. La cellulosa DEAE e il glucosio salino tamponato con fosfato sono mescolati in volumi uguali.
Lega squartata e conservata a temperatura ambiente o a quattro gradi Celsius o a meno 20 gradi Celsius per una conservazione prolungata. Il sangue infetto da tripanosoma viene conservato in azoto liquido. Un quarto di lega di un millilitro viene scongelato a temperatura ambiente.
I parassiti vengono accuratamente raccolti dal criotubo usando un ago e una siringa millilitro. La vitalità dei parassiti scongelati è valutata dalla motilità come visualizzato dall'osservazione della microscopia leggera prima dell'infezione. I parassiti vengono iniettati nelle cavità peritoneali di due topi, 500 microlitri per topo.
Ogni giorno dopo l'infezione, la parasitemia viene valutata raccogliendo una goccia di sangue dalla coda con un ago e controllata per microscopia. Quando la parasitemia è a un livello adatto, viene raccolto sangue infetto. Una siringa da 10 millilitri è supportata in un morsetto o in un supporto e viene aggiunto un pezzo di carta filtrante pretaglio.
La cellulosa DEAE preparata viene versata nella siringa fino al livello di otto o nove millilitri. La colonna viene lavata con il buffer di eluizione. Due millilitri di sangue infetto vengono accuratamente posizionati sopra la colonna e i tripanosomi vengono raccolti nell'eluito della colonna in un tubo di centrifugazione da 50 millilitri.
Il tampone di eluizione viene regolarmente aggiunto in base al transito dei tripanosomi. Il transito dei tripanosomi attraverso la colonna viene controllato prendendo una goccia di eluato di colonna a intervalli regolari e osservando i tripanosomi usando la microscopia ottica. Quando i tripanosomi non sono più osservati nell'eluito, il tubo conico viene centrifugato a 1.800 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Il supernatante viene scartato e i tripanosomi nel pallet vengono conteggiati con un emocitometro. I tripanosomi raccolti vengono successivamente diluiti nel mezzo necessario per l'indagine pianificata. Questo metodo, la diagnosi più appropriata per la tripanosomiasi africana fornisce parassiti purificati per indagini immunologiche, biologiche, biochimiche, farmaceutiche e biologiche molecolari.
Questi studi sono stati sviluppati perché i parassiti purificati dalla cellulosa DEAE possono essere facilmente ottenuti in grandi quantità da ospiti infetti naturalmente o sperimentalmente e, in particolare, roditori. La vitalità del tripanosoma in presenza di agenti farmaceutici viene valutata mediante osservazione microscopica. La vitalità del parassita è associata alla motilità e quindi può essere controllata a occhio al microscopio leggero a un ingrandimento 40 volte o superiore.
La vitalità dei parassiti viene valutata misurando la percentuale di forme mobile. Le diluizioni dei composti di prova vengono aggiunte in ogni pozzo di una piastra di coltura tissutale di 96 pozzetti mentre i pozzi di controllo vengono trattati in modo fittizio. Ogni concentrazione viene valutata in triplice copia.
Il numero di parassiti vitali per ogni diluizione viene confrontato con il numero di parassiti nei pozzi di controllo. Gli effetti della pentamidina, un farmaco di riferimento, usato nella terapia della tripanosomiasi africana umana sono mostrati in questa figura. Le co-culture del macrofago tripanosoma consentono l'indagine dell'interazione dei parassiti ospiti a livello cellulare.
Nelle co-colture parassitari macrofagi, i tripanosomi cellulari extra inducono la produzione di macrofago arginasi che idrolizzare l'arginina in ornitina. L'ornitina è il precursore delle poliammine e del tripanotione, essenziale per la sopravvivenza e la crescita dei parassiti. Inoltre, l'esaurimento dell'arginina diminuisce la produzione di ossido nitrico tripanocida.
Successivamente, l'aggiunta di un inibitore dell'arginasi, la S-L-cisteina alle co-colture riduce drasticamente la crescita dei parassiti indotta da macrofagi. L'induzione dell'arginasi è mediata da fattori tripanosomi escreti e o secreti. Questo fattore di induttori dell'arginasi è stato identificato come un'ortina cinesina.
La chinasi si lega ai recettori leganti del mannosio di tipo C. L'arginasi è indotta e produce ornitina che favorisce la crescita dei parassiti. L'arginasi non è indotta dalla china nei macrofagi coltivati con mannosio millimolare 12,5 o nei macrofagi dai topi in cui sono stati eliminati i recettori del mannosio macrofago.
Ulteriori esempi di biologia cellulare e sperimentazione biochimica utilizzando tripanosomi purificati con cellulosa DAEA sono dimostrati in studi in cui sono state identificate nuove proteine citoscheletriche come il BILBO1. BILBO1 è necessario per la biogenesi di importanti strutture citoscheletriche e la sopravvivenza dei parassiti. Pertanto, BILBO1 rappresenta un importante bersaglio per l'intervento nei tripanosomi patogeni.
Un'immagine che mostra l'etichettatura dell'immunoflourescenza di una forma di coltura del flusso sanguigno, la cellula brucei del tripanosoma sondata con un anticorpo anti-BILBO1 è mostrata in questa figura. Inoltre, il metabolismo del glucosio e della treonina è stato descritto utilizzando tripanosomi purificati con cellulosa DEAE e gli enzimi coinvolti in questi processi sono stati convalidati sperimentalmente. Una rappresentazione schematica del metabolismo del glucosio e della treonina nei tripanosomi formati dal flusso sanguigno è mostrata in questa figura.
La purificazione dei tripanosomi africani dal sangue da parte degli scambi di anione colonne di cellulosa DEAE con recenti miglioramenti rimane il gold standard per il rilevamento del tripanosoma, non solo negli ospiti naturali con basse parasitemie nelle aree endemiche, ma anche per il requisito di parassiti in gran numero per indagini sperimentali. Le indagini hanno permesso di identificare molecole di tripanosoma che svolgono ruoli essenziali nella sopravvivenza e nella crescita dei parassiti. Gli obiettivi identificati potrebbero rappresentare la base per un futuro vaccino con potenziali antigeni sia per l'uomo che per gli animali in un unico approccio sanitario.
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Panoramica
I tripanosomi africani sono gli agenti causali della tripanosomiasi africana umana e animale, trasmessa dalle mosche tse-tse. Un rilevamento accurato di questi parassiti nel sangue è fondamentale per la diagnosi e il trattamento, richiedendo tecniche di concentrazione per un'identificazione efficace.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Parassitologia
- Malattie infettive
- Metodi diagnostici
Sfondo
- La tripanosomiasi africana, nota anche come malattia del sonno, rappresenta un problema sanitario rilevante nell'Africa subsahariana.
- I test sierologici possono produrre risultati falsamente positivi e falsamente negativi, complicando così la diagnosi.
- La concentrazione dei tripanosomi nel sangue è essenziale per un rilevamento accurato.
- Esistono diverse tecniche per concentrare questi parassiti.
Scopo dello studio
- Migliorare i metodi diagnostici per rilevare i tripanosomi africani nei campioni di sangue.
- Fornire parassiti purificati per ulteriori ricerche biologiche e mediche.
- Approfondire la comprensione della tripanosomiasi e del suo impatto sulla salute.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di una colonna a scambio anionico per separare i tripanosomi in base alla carica superficiale.
- Applicazione di tecniche di concentrazione per facilitare il rilevamento del parassita.
- Valutazione dell'efficacia del metodo nel fornire campioni purificati.
- Valutazione dell'idoneità del metodo per diverse indagini biologiche.
Risultati principali
- La colonna a scambio anionico separa efficacemente i tripanosomi dalle cellule sanguigne dei mammiferi.
- Questo metodo fornisce parassiti purificati adatti a studi immunologici e biochimici.
- I risultati indicano un miglioramento dell'accuratezza nella diagnosi della tripanosomiasi africana.
- La tecnica è applicabile a diversi campi di ricerca, inclusa la biologia molecolare.
Conclusioni
- Il metodo sviluppato è uno strumento diagnostico affidabile per la tripanosomiasi africana.
- Fornisce una base per ulteriori ricerche sulla biologia dei tripanosomi.
- Studi futuri potranno basarsi su questo metodo per migliorare l'accuratezza diagnostica e le strategie terapeutiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
Il rilevamento accurato dei tripanosomi africani nel sangue è essenziale per la diagnosi e il trattamento della tripanosomiasi africana umana, in particolare in condizioni di campo dove la parassitemia è bassa. Il metodo di scambio anionico con cellulosa DEAE fornisce una tecnica di purificazione sensibile e rapida che consente l'isolamento affidabile dei parassiti per indagini immunologiche, biochimiche e farmaceutiche successive. Questo approccio supporta la validazione degli obiettivi e la riduzione del rischio meccanicistico nella scoperta di farmaci antiparassitari, fornendo parassiti vitali per screening in vitro e studi sui meccanismi d'azione.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche fornendo tripanosomi purificati e vitali per valutare gli effetti dei farmaci sulla motilità e sulla sopravvivenza del parassita.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico mediante la preparazione standardizzata di parassiti per saggi in vitro riproducibili.
- Valore predittivo: Facilita l'identificazione di composti promettenti consentendo una valutazione quantitativa degli effetti dei composti sulla vitalità del parassita in formati dose-risposta.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi, inclusi test farmacologici in formati a piastre da 96 pozzetti con valutazioni triplicate.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità del saggio attraverso una purificazione costante dei parassiti e la misurazione della loro vitalità mediante motilità.
- Scalabilità: Consente la produzione di elevate quantità di parassiti da ospiti infetti, supportando campagne di screening ad alto rendimento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Sostiene sistemi rilevanti per le malattie mantenendo l'infettività del parassita e consentendo studi di co-coltura con cellule ospiti per indagare meccanismi come l'induzione dell'arginasi nei macrofagi.
- Continuità traslazionale: Collega la scoperta alla validazione preclinica fornendo parassiti per studi meccanicistici su proteine del citoscheletro (ad esempio, BILBO1) e vie metaboliche.
- Riduzione del rischio meccanicistico: Permette di indagare gli effetti dell'eliminazione, mutazione o sovraespressione di geni sulla sopravvivenza del parassita, supportando la fiducia nel bersaglio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione iniziale della proteina bersaglio all'identificazione del composto attivo, fino agli studi meccanicistici preclinici, consentendo di ottenere parassiti da utilizzare in saggi che guidano le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi fornendo parassiti per lo studio delle interazioni ospite-parassita, come i meccanismi di sopravvivenza mediati dall'arginasi.
- Screening: Garantisce la prontezza per i saggi grazie alla purificazione standardizzata e riproducibile dei parassiti, compatibile con letture microscopiche della vitalità.
- Analisi: Produce misurazioni quantitative di variabili dipendenti (ad esempio, percentuale di parassiti mobili) che consentono il confronto tra diverse diluizioni del composto in esame.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica attraverso studi sulla biogenesi del citoscheletro e sui percorsi metabolici essenziali per la sopravvivenza del parassita.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come una capacità riutilizzabile per la generazione di parassiti in diversi contesti di ricerca, dall'immunologia alla biologia molecolare.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Maggiore affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi grazie alla riduzione dell'ambiguità meccanicistica nei percorsi di sopravvivenza del parassita.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità della fornitura di parassiti per piattaforme con più saggi.
- Valore strategico: Decisioni più accurate su prosecuzione o interruzione dei progetti, maggiore efficienza nell'uso del capitale e riduzione del rischio biologico in fase avanzata nei programmi antiparassitari.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per il rischio, basate su dati preclinici di efficacia affidabili.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in parassitologia e tecniche di cromatografia su colonna per la corretta preparazione della cellulosa DEAE e la regolazione del pH.
- Richiede strumentazione come centrifughe, emocitometri e microscopi ottici per la raccolta dei parassiti e la valutazione della loro vitalità.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro nella preparazione dei tamponi, nei protocolli di eluizione e nei modelli di infezione per garantire coerenza.
- Comporta considerazioni di adattamento tra diverse specie di ospiti e ceppi di tripanosomi, poiché le condizioni di cromatografia devono essere ottimizzate per ogni sistema.
- I limiti pratici includono la dipendenza dalla disponibilità di ospiti infetti e la necessità di un'elaborazione tempestiva per mantenere la vitalità dei parassiti.
