Name: Sub-acuta microemorragie cerebrale indotta tramite liniezione del Lipopolysaccharide in ratti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Scopri come indurre microemorragie cerebrali sub-acute in ratti Sprague-Dawley tramite iniezione di LPS. Questo metodo permette di studiare la patogenesi delle CMH e il ruolo dell'infiammazione nelle patologie neurologiche.

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Ringraziamo insegnante Jian Feng Lei e i colleghi di università medica di capitale per l'orientamento durante risonanza magnetica. Ringraziamo anche Jing Zeng dal dipartimento di neurologia, ospedale di Yichang del popolo secondo per la fornitura di supporto tecnico.

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dalla cura degli animali e uso Comitato (ACUC) dell'ospedale generale dell'esercito di PLA.
1. materiali
<ol><li>Preparazione dell'iniezione dei LPS<ol>
<li>Aggiungere 25 mL di acqua distillata a 25 mg di polvere di LPS derivata da S. typhimurium ad una concentrazione finale di 1 mg/mL. Memorizzare l'iniezione in una provetta sterile a 4 ° C. Attenzione: LPS è tossico.</li>
		<li>Preparare una soluzione EB 2% in soluzione fisiologica 0,9% normale per mantenere iniezione EB alla concentrazione di lavoro.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. gli animali
<ol><li>Amministrare i LPS a ratti maschii di Sprague-Dawley (deviazione standard), 10 settimane di età (peso medio: 280 ± 20 g) tramite l'iniezione intraperitoneale. Attenzione: Se ratti vengono acquistati da un'altra organizzazione, quindi la fase adattiva dovrebbe non essere meno di 7 giorni.</li>
</ol>3. LPS iniezioni
<ol><li>Iniettare per via intraperitoneale LPS ogni ratto alla dose di 1 mg/kg e tornare i ratti alla loro gabbia a casa. Nota: L'anestesia non è necessaria.</li>
	<li>Sei ore più tardi, iniettare la stessa dose di iniezione dei LPS in ratti.</li>
	<li>Sedici ore dopo iniettare la stessa dose di LPS in ratti. Attenzione: L'iniezione ratti SD con LPS ad una dose di 1 mg/kg può provocare un tasso di mortalità del 5%. Il tasso di mortalità potrebbe aumentare ulteriormente in più giovani o più vecchi topi o ratti femminili incinto.</li>
	<li>Restituire i ratti nelle loro gabbie dopo iniezione dei LPS e fornire accesso ad libitum per cibo e bevande. Nota: Ratti esporrà una risposta infiammatoria sistemica distinta, e quindi è essenziale che le gabbie rimangono pulite in tutto l'esperimento. Ratti dovrebbero essere frequentemente (x 2 giorni) il monitoraggio per peso, aspetto generale e atteggiamento dopo la prima iniezione di LPS. Se i ratti iniziano ad esporre una postura ricurva, riluttanza a muoversi, perdita di peso significativa (> 20%), porfirina colorazione che umanamente essere euthanized prima del giorno 7 EB studio punto finale.</li>
</ol>4. campionario
<ol><li>Iniezione di EB<ol>
<li>Sette giorni dopo la prima iniezione, anestetizzare il ratto di intraperitonealmente secondo il protocollo approvato IACUC.</li>
		<li>I ratti non mostrano risposte riflesse corneale, attendere 1-2 min. Eseguire un 5-8 mm-puntura profonda cardiaca su ogni ratto; il punto di foratura deve essere 5 mm al margine sinistro dello sterno presso lo spazio di 3 ° e 4 ° intercostali.</li>
		<li>Attendere fino a quando il recupero sangue è osservato e poi iniettare EB alla dose di 0,2 mL/100 g di peso di corpo nel ventricolo di sinistra del cuore. Attenzione: Cardiaco puntura ed EB dell'iniezione deve essere eseguite con attenzione. EB può essere iniettato in cavità toracica o pericardio invece il ventricolo di sinistra del cuore.<ol>
<li>Succhiare indietro con una provetta vuota e sostituire questo volume con un tubo EB prima dell'iniezione per contribuire a ridurre il tasso di guasto (ad es., iniezione alla gabbia toracica di errore).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Mantenere il ratto in posizione supina per 10 min. Nota: Se il campione non è usato per rilevare fughe di EB nell'imaging di immunofluorescenza, quindi questo passaggio può essere omesso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Osservazione lordo<ol>
<li>Eseguire le aspersioni cardiache utilizzando ghiacciata 1m soluzione salina tampone fosfato (PBS) per cancellare il sistema vascolare cerebrale e il cervello.<ol>
<li>Usando un bisturi, fare un'incisione addominale attraverso l'intera lunghezza del diaframma.</li>
			<li>Taglio attraverso le costole appena a sinistra della linea mediana gabbia toracica.</li>
			<li>Aprire la cavità toracica. Utilizzare fascette per esporre il cuore e per facilitare il drenaggio del sangue e altri fluidi.</li>
			<li>Tenendo costantemente il cuore con il forcipe (cuore dovrebbe essere batte ancora), direttamente inserire un ago dentro la protrusione del ventricolo sinistro per estendere questo a circa 5 mm. Fissare l'ago in quella posizione di bloccaggio vicino al punto di entrata. Attenzione: Non estendere eccessivamente l'ago, come si può perforare la parete interna e la circolazione delle soluzioni di compromesso.</li>
			<li>Rilasciare la valvola per consentire la soluzione PBS ghiacciata di flusso (200 – 300 mL) ad un tasso lento e costante a circa 20 mL/min utilizzando una pompa di perfusione. Se gli animali richiedono fissazione invece di osservazione lordo, quindi utilizzare la stessa dose di soluzione fisiologica 0,9% ghiacciata.</li>
			<li>Utilizzando delle forbici affilate, praticare un'incisione nell'atrio, assicurando che la soluzione fluisce continuamente. Se il liquido non scorre liberamente o proviene da narici o la bocca dell'animale, riposizionare l'ago.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Schermo per CMHs tramite osservazione lordo. Nota: Se il campione non viene utilizzato nel calcolo del numero di CMHs da osservazione lordo, quindi questo passaggio può essere omesso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fissazione<ol>
<li>Eseguire le aspersioni cardiache utilizzando ghiacciata soluzione fisiologica 0,9% (200 – 300 mL) per cancellare il sistema vascolare cerebrale e il cervello.</li>
		<li>Eseguire le aspersioni cardiache utilizzando ghiacciata paraformaldeide al 4% per la fissazione.</li>
		<li>Decapitare il ratto, isolare il cervello e immergete il cervello in soluzione di saccarosio al 20% per almeno 6 ore.</li>
		<li>Cambiare la soluzione in 30% di saccarosio e fix per un altro 6 h.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare 10 sezioni di tessuti del cervello spessore mm utilizzando un criostato.</li>
</ol>5. egli macchiatura
Nota: Questa procedura viene eseguita utilizzando un lui Kit di colorazione.
<ol><li>Lavare i vetrini in acqua distillata.</li>
	<li>Macchia in soluzione di ematossilina per 8 min. lavare in acqua corrente per 5 min.</li>
	<li>Differenziare in alcool acido 1% per 30 s. lavaggio in acqua corrente per 1 min.</li>
	<li>Macchia in 0,2% acqua ammoniacale (azzurrante) o saturato litio carbonato soluzione per 30 s a 1 min. lavare in acqua corrente per 5 min.</li>
	<li>Sciacquare in alcol al 95% (10 immersioni).</li>
	<li>Colorante di contrasto con soluzione di eosina per 30 s a 1 min.</li>
	<li>Disidratare attraverso alcol al 95%, due cambi di alcool assoluto, per 5 minuti ciascuno.</li>
	<li>Chiaro in xilene per 30 s.</li>
	<li>Montare utilizzando metodo9 di Liu.</li>
	<li>Analizzare utilizzando un microscopio a fluorescenza campo chiaro. Nota: globuli rossi rilasciato da vasi sanguigni, che sono i componenti di CMHs, appaiono in rosso-arancio sotto Egli macchiatura.</li>
</ol>6. blu di Prussia di Perl colorazione
Nota: Questa procedura viene eseguita utilizzando un Kit di colorazione di Perls.
<ol><li>Lavare i vetrini con acqua distillata.</li>
	<li>Macchia in soluzione di reazione con miscela parti uguali di ferrocianuro e acido cloridrico per 10 min.</li>
	<li>Disidratare, deselezionare, montare e analizzare le diapositive come descritto nei passaggi 5.7 – 5,10.</li>
</ol>7. EB double-macchiatura
Nota: Questa procedura segue passo 4.1.3.
<ol><li>Lavare i vetrini con PBS tre volte per 5 minuti ciascuno.</li>
	<li>Incubare i vetrini con 4', 6-diamidino-2-phenylindole soluzione di (DAPI) per 15 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare i vetrini con soluzione di PBS tre volte per 5 minuti ciascuno e montare i vetrini con la soluzione di PBS-glicerolo.</li>
	<li>Analizzare le immagini su un microscopio a fluorescenza. Deposizione di EB è indicato dalla fluorescenza rossa; i nuclei sono indicati da una fluorescenza blu.</li>
</ol>8. MRI-SWI
<ol><li>Eseguire risonanza magnetica su un magnete 7-T equipaggiato con un sistema di gradiente attivamente schermato (16cm di diametro interno).</li>
	<li>Sette giorni dopo il trattamento, anestetizzare i ratti per inalazione facemask di isoflurane 1,5 – 2,0% utilizzando un sistema di anestesia isoflurano.</li>
	<li>Applicare unguento veterinario sugli occhi del ratto per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.</li>
	<li>Tenere i ratti in posizione prona ed eseguire una scansione MRI-SWI.</li>
	<li>Ottenere scansioni SWI ponderata utilizzando una sequenza di fast spin echo utilizzando i seguenti parametri: echo tempo (TE) 8 ms, ripetizione del tempo (TR) 40 ms, angolo di vibrazione = 12°, campo visivo (FOV) 35 mm × 35 mm, matrice di acquisizione 384 × 384, per acquisire fette di spessore mm 1.</li>
	<li>Identificare CMHs in MRI-SWI secondo Greenberg et al. 11, che comprendeva i seguenti criteri: (1) diametro ≤ 10 mm e macchie (2) circolare, isolato e segnale di bassa intensità.</li>
	<li>Alla fine dell'esperimento, eutanasia i ratti utilizzando il metodo di biossido di carbonio (un flusso di 6 L/min) o 30% del volume contenitore di sovradosaggio.</li>
</ol>

<ol><li>Sumbria, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+inflammation-induced+cerebral+microbleeds%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">A murine model of inflammation-induced cerebral microbleeds.</a> J Neuroinflammation. 13 (1), 218(2016).</li>
<li>Vernooij, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+risk+factors+of+cerebral+microbleeds+the+Rotterdam+Scan+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Prevalence and risk factors of cerebral microbleeds the Rotterdam Scan Study.</a> Neurology. 70 (14), 1208-1214 (2009).</li>
<li>Pettersen, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbleed+topography%2C+leukoaraiosis%2C+and+cognition+in+probable+Alzheimer+disease+from+the+Sunnybrook+dementia+study%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Microbleed topography, leukoaraiosis, and cognition in probable Alzheimer disease from the Sunnybrook dementia study.</a> Archives of Neurology. 65 (6), 790-795 (2008).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+microbleeds+and+neuropsychiatric+symptoms+in+an+elderly+Asian+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurology%2C+Neurosurgery%2C+and+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Cerebral microbleeds and neuropsychiatric symptoms in an elderly Asian cohort.</a> Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 88 (1), 7-11 (2017).</li>
<li>Mcauley, G., Schrag, M., Barnes, S., Obenaus, A., Dickson, A., Kirsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+iron+quantification+in+collagenase-induced+microbleeds+in+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+Resonance+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo iron quantification in collagenase-induced microbleeds in rat brain.</a> Magnetic Resonance in Medicine. 67 (3), 711-717 (2012).</li>
<li>Reuter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cerebral+microbleeds+in+the+APP23-transgenic+mouse+model+of+cerebral+amyloid+angiopathy-a+9.4+tesla+MRI+study%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Aging+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development of cerebral microbleeds in the APP23-transgenic mouse model of cerebral amyloid angiopathy-a 9.4 tesla MRI study.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 8 (8), 170(2016).</li>
<li>Scott, L. L., Downing, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+neonatal+exposure+to+BMAA+in+a+rat+model+produces+neuropathology+consistent+with+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">A single neonatal exposure to BMAA in a rat model produces neuropathology consistent with neurodegenerative diseases.</a> Toxins. 10 (1), E22(2018).</li>
<li>Toth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+exacerbates+hypertension-induced+cerebral+microhemorrhages+in+mice%3A+role+of+resveratrol+treatment+in+vasoprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Aging exacerbates hypertension-induced cerebral microhemorrhages in mice: role of resveratrol treatment in vasoprotection.</a> Aging Cell. 14 (3), 400-408 (2015).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+H%26E+and+Prussian+blue+staining+in+a+mouse+model+of+cerebral+microbleeds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of H&E and Prussian blue staining in a mouse model of cerebral microbleeds.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (11), 767-773 (2014).</li>
<li>Zeng, J., Zhào, H., Liu, Z., Zhang, W., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+induces+subacute+cerebral+microhemorrhages+with+involvement+of+Nitric+Oxide+Synthase+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Stroke+and+Cerebrovascular+Diseases%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide induces subacute cerebral microhemorrhages with involvement of Nitric Oxide Synthase in rats.</a> Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 27 (7), 1905-1913 (2018).</li>
<li>Greenberg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+microbleeds%3A+A+guide+to+detection+and+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cerebral microbleeds: A guide to detection and interpretation.</a> Lancet Neurology. 8 (2), 165-174 (2009).</li>
<li>Hoffmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Field+MRI+reveals+a+drastic+increase+of+hypoxia-induced+microhemorrhages+upon+tissue+reoxygenation+in+the+mouse+brain+with+strong+predominance+in+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">High-Field MRI reveals a drastic increase of hypoxia-induced microhemorrhages upon tissue reoxygenation in the mouse brain with strong predominance in the olfactory bulb.</a> Plos One. 11 (2), e0148441(2016).</li>
<li>Sumbria, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+phosphodiesterase+3A+modulation+on+murine+cerebral+microhemorrhages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Effects of phosphodiesterase 3A modulation on murine cerebral microhemorrhages.</a> Journal of Neuroinflammation. 14 (1), 114(2017).</li>
<li>Sumbria, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+exacerbates+development+of+cerebral+microbleeds+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Aging exacerbates development of cerebral microbleeds in a mouse model.</a> Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 69(2018).</li>
<li>Mello, B. S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+influences+in+behavior+and+brain+inflammatory+and+oxidative+alterations+in+mice+submitted+to+lipopolysaccharide-induced+inflammatory+model+of+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Sex influences in behavior and brain inflammatory and oxidative alterations in mice submitted to lipopolysaccharide-induced inflammatory model of depression.</a> Journal of Neuroimmunol. 320, 133-142 (2018).</li>
<li>Souza, D. F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+astroglial+markers+in+a+maternal+immune+activation+model+of+schizophrenia+in+Wistar+rats+are+dependent+on+sex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Changes in astroglial markers in a maternal immune activation model of schizophrenia in Wistar rats are dependent on sex.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (489), (2015).</li>
<li>Dutta, G., Zhang, P., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lipopolysaccharide+Parkinson%27s+disease+animal+model%3A+mechanistic+studies+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Fundamental+%26+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The Lipopolysaccharide Parkinson's disease animal model: mechanistic studies and drug discovery.</a> Fundamental & Clinical Pharmacology. 22 (5), 453-464 (2008).</li>
<li>El-Sayed, N. S., Bayan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+role+of+resveratrol+targeting+estradiol+and+neprilysin+pathways+in+lipopolysaccharide+model+of+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Possible role of resveratrol targeting estradiol and neprilysin pathways in lipopolysaccharide model of Alzheimer disease.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 822 (822), 107-118 (2015).</li>
<li>Combrinck, M. I., Perry, V. H., Cunningham, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+infection+evokes+exaggerated+sickness+behaviour+in+pre-clinical+murine+prion+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Peripheral infection evokes exaggerated sickness behaviour in pre-clinical murine prion disease.</a> Neuroscience. 112 (1), 7-11 (2002).</li>
<li>Pantoni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+small+vessel+disease%3A+from+pathogenesis+and+clinical+characteristics+to+therapeutic+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cerebral small vessel disease: from pathogenesis and clinical characteristics to therapeutic challenges.</a> Lancet Neurology. 9 (7), 689-701 (2010).</li>
<li>Rosand, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+clustering+of+hemorrhages+in+probable+cerebral+amyloid+angiopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Spatial clustering of hemorrhages in probable cerebral amyloid angiopathy.</a> Annals of Neurology. 58 (3), 459-462 (2005).</li>
<li>Robinson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstructural+and+microglial+changes+after+repetitive+mild+traumatic+brain+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice.</a> Journal of Neuroscience Research. 95 (4), 1025-1035 (2017).</li>
<li>Kraft, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypercholesterolemia+induced+cerebral+small+vessel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Hypercholesterolemia induced cerebral small vessel disease.</a> Plos One. 12 (8), e0182822(2017).</li>
<li>Schreiber, S., Bueche, C. Z., Garz, C., Baun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+brain+barrier+breakdown+as+the+starting+point+of+cerebral+small+vessel+disease%3F+-+New+insights+from+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Translational+Stroke+Medicine%22%5BJournal%5D)">Blood brain barrier breakdown as the starting point of cerebral small vessel disease? - New insights from a rat model.</a> Experimental & Translational Stroke Medicine. 5 (1), 4(2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Studi di ricerca su CMHs sono aumentati negli ultimi anni. Tuttavia, il meccanismo di CMHs rimane poco chiaro, spingente gli scienziati a stabilire modelli animali che simulano questa particolare condizione. Per esempio, Hoffmann et al. sviluppato un modello di mouse CMHs indotta da ipossia che mostra che CMHs sono causati da ipossia e la rottura di autoregolamento cerebrovascolare12. Reuter et al. 5 hanno stabilito un modello CMHs in topi transgenici APP2...

Microemorragie cerebrali classiche (CMHs) riferiscono a perivascolare piccoli depositi di prodotti di degradazione del sangue come emosiderina dai globuli rossi nel cervello1. Secondo lo studio di Rotterdam Scan, CMHs potrebbe essere trovato in quasi il 17,8% di persone di età 60-69 anni e 38,3% in quelli oltre 80 anni2. La prevalenza di CMHs negli anziani è relativamente alta, e una correlazione tra l'accumulo di CMHs e disfunzione conoscitiva e neuropsichiatrica è stata stabilita3,4. Diversi modelli animali di CMHs recentemente sono stati segnalati, tra cui modelli del roditore indotti dal tipo IV collagenosi iniezione stereotassica5, transgenici APP6, β-N-methylamino-L-alanina esposizione7e ipertensione8, con CMHs indotta da infiammazione sistemica come una delle scelte più ben accettate. Fisher et al. 9 in primo luogo usato LPS derivati da Salmonella typhimurium per sviluppare un modello di topo CMHs acuto. Successivamente, lo stesso gruppo segnalato lo sviluppo di un modello di topo CMHs sub-acuto utilizzando lo stesso approccio2.
LPS è considerato come un stimolo infiammatorio standardizzato tramite l'iniezione intraperitoneale. Precedenti studi hanno confermato che iniezione dei LPS potrebbe causare neuroinfiammazione come riflesso di grandi quantità di microglia e attivazione di astrociti in animale modelli2,10. Inoltre, una correlazione positiva tra l'attivazione del neuroinflammation attivazione e il numero di CMHs è stato stabilito2,10. Sulla base di questi studi precedenti ci hanno richiesto di sviluppare un modello di ratto CMHs tramite l'iniezione intraperitoneale di LPS.
I progressi nella rilevazione tecnologie hanno provocato un aumento del numero di ricerche su CMHs. Il più ampiamente riconosciuto di metodi di rilevazione CMHs includono il rilevamento dei globuli rossi di ematossilina ed eosina (HE), rilevazione di ferro ferrico di blu di Prussia macchiatura9, rilevamento di Evans blue deposizione (EB) mediante immunofluorescenza Imaging e 7,0 Tesla risonanza magnetica-suscettibilità weighted imaging (MRI-SWI)10. Il presente studio mira a sviluppare un metodo di screening per CMHs.

<table><tbody><tr><td>LPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-2630</td><td>per l'induzione dell'infiammazione</td></tr><tr><td>EB</td><td>Sigma-aldrich</td><td>E2129</td><td>per il rilevamento di perdite EB</td></tr><tr><td>Soluzione di tintura DAPI</td><td>Servicbio</td><td>G1012</td><td>terreno di conteggio per IF</td></tr><tr><td>Perl' s Colorazione prussiana</td><td>Solarbio</td><td>G1424</td><td>Kit per la colorazione prussiana</td></tr><tr><td>Colorazione HE</td><td>Solarbio</td><td>G1120</td><td>Kit per la colorazione HE</td></tr><tr><td>idrato di cloralio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47335U</td><td>Per anestesia</td></tr><tr><td>tampone fosfato soluzione salina (PBS)</td><td>Solarbio</td><td>P1022</td><td>un tipo di soluzione tampone comunemente usata nell'esperimento</td></tr><tr><td>Soluzione</td> <td>salina allo 0,9%Hainan DonglianChangfu Pharmaceutical Co., Ltd., Cina</td><td></td><td>soluzione per</td></tr><tr><td>perfusione paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>un tipo di soluzione comunemente usata per la fissazione</td></tr><tr><td>soluzione di saccarosio al 20%</td><td>Solarbio</td><td>G2461</td><td>un tipo di soluzione comunemente usata per la fissazione</td></tr><tr>soluzione di<td>saccarosio al 30%</td><td>Solarbio</td><td>G2460</td><td>un tipo di soluzione comunemente usata per la fissazione</td></tr><tr><td>unguento veterinario</td><td>Solcoseryl gel per gli occhi, Bacel, Svizzera</td><td></td><td>per la protezione degli occhi dei ratti</td></tr></tbody></table>

sub-acuta microemorragie cerebrale indotta tramite l'iniezione del lipopolysaccharide in ratti

Sub-acute Cerebral Microhemorrhages Induced by Lipopolysaccharide Injection in Rats

Microemorragie cerebrali (CMHs) sono comuni in pazienti invecchiati e sono correlati a vari disordini neuropsichiatrici. L'eziologia di CMHs è complessa e neuroinfiammazione è osservato spesso come un co-avvenimento. Qui, descriviamo una sub-acuta CMHs modello di ratto indotta dall'iniezione di lipopolisaccaride (LPS), come pure un metodo per la rilevazione di iniezione CMHs. sistemica LPS è relativamente semplice, economico e conveniente. Uno dei principali vantaggi di iniezione dei LPS è la sua stabilità per indurre l'infiammazione. CMHs causato da iniezione dei LPS potrebbe essere rilevata da osservazione lordo, ematossilina ed eosina (HE), di Perl macchiatura prussiano, doppia marcatura blu di Evans (EB) e tecnologia di imaging a risonanza magnetica-suscettibilità weighted imaging (MRI-SWI). Infine, altri metodi di sviluppare modelli animali CMHs, compresi i loro vantaggi e/o svantaggi, inoltre sono discussi in questo rapporto.

CMHs può essere rilevato utilizzando vari approcci. I metodi più ben accettati sono i seguenti: (1) lordo osservazione e valutazione della superficie CMHs (illustrato nella Figura 1, pannello superiore); (2) egli macchiando per la rilevazione di cellule di anima rosse (mostrato in Figura 2A, pannello superiore) o prussiano macchiatura rilevazione ferro ferrico derivato dalla lisi dei globuli rossi (Figura 2A<...

Vi presentiamo un protocollo per indurre e rilevare CMHs causato da iniezione dei LPS in ratti Sprague-Dawley, che può essere utilizzato in futuro le indagini di ricerca sulla patogenesi di CMHs.

Sub-acuta microemorragie cerebrale indotta tramite l'iniezione del Lipopolysaccharide in ratti

Cerebral microhemorrhages (CMHs) are common in aged patients and are correlated to various neuropsychiatric disorders. The etiology of CMHs is complex, ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della micro-emorragia cerebrale come l'eziologia, la distribuzione e il rilevamento della micro-emorragia cerebrale e così via. Il principale vantaggio di questa tecnica è che le iniezioni di LPS inducono stabilmente infiammazione. Inoltre, l'iniezione LPS è abbastanza semplice, economica ed economica.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'induzione dell'emorragia cerebrale, può anche essere applicato ad altri disturbi cerebrali come depressione, schizofrenia, morbo di Parkinson, morbo di Alzheimer e malattia dei prioni. Somministrare LPS a una dose di un milligrammo per chilogrammo di peso corporeo ai ratti maschi Sprague Dawley di 10 settimane per iniezione intraperitoneale, quindi riportare ogni topo nella gabbia di casa. Ripetere l'iniezione LPS dopo sei ore e 16 ore.Si prega di notare che l'iniezione di ratti SD con LPS a una dose di un milligrammo per chilogrammo può comportare una mortalità del 5%. La mortalità potrebbe aumentare ulteriormente nei ratti più giovani o più anziani o nei ratti femmine in gravidanza. Riportare i ratti nelle loro gabbie dopo l'iniezione di LPS e fornire accesso ad libitum a cibi e bevande.In anestesia terminale, eseguire una puntura cardiaca profonda da cinque a otto millimetri su ogni ratto. Il punto di puntura dovrebbe essere di cinque millimetri al margine sinistro dello sterno nel terzo e quarto spazio intercostale. Tenere l'ago in posizione e sostituire il tubo vuoto con un tubo contenente blu Evans.Attendere fino a quando non si osserva il recupero del sangue, quindi iniettare Evans blu a una dose di 0,2 millilitri per 100 grammi di peso corporeo nel ventricolo cardiaco sinistro. Mantenere il topo in posizione supina per 10 minuti se si valuta la perdita blu di Evans attraverso la barriera ematica / encefalica mediante imaging di immunofluorescenza. Eseguire perfusioni cardiache utilizzando gelido da 200 a 300 millilitri di soluzione salina allo 0,9% per cancellare la vascucolatura cerebrale e il cervello.Passare alla paraformaldeide ghiacciata al 4% per la fissazione. Quindi, dopo aver isolato il cervello, immergerlo nel 20% di saccarosio in PBS per almeno sei ore o fino a quando il cervello non affonda sul fondo del tubo. Modificare la soluzione in 30% di saccarosio e fissarla per altre sei ore.Infine, preparare sezioni di tessuto cerebrale spesse 10 millimetri usando un criostato. Lavare gli scivoli con PBS tre volte per cinque minuti ciascuno, quindi incubare diapositive con soluzione 4, 6'diamidino-2-fenilindolo o DAPI per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver lavato le diapositive in PBS come prima, montare le diapositive con soluzione pbs-glicerolo.Cattura le immagini su un microscopio a fluorescenza. La deposizione EB è indicata dalla fluorescenza rossa, i nuclei sono indicati dalla fluorescenza blu. Inizia la colorazione H&E lavando gli scivoli in acqua distillata.Quindi immergersi in soluzione di ematossilina per otto minuti. In alternativa, per la colorazione blu prussiana Perl, macchia in soluzione di reazione con miscela di parti uguali di ferrocianuro e acido cloridrico per 10 minuti. Dopo la colorazione, lavare in acqua corrente del rubinetto per cinque minuti.Differenziare in 1% alcol acido per 30 secondi. Dopo aver lavato in acqua corrente del rubinetto per un minuto, macchiare in acqua di ammoniaca allo 0,2% o soluzione di carbonato di litio saturo per 30 secondi a un minuto. Quindi, lavare in acqua corrente del rubinetto per cinque minuti.Contro-macchia con soluzione di eosina per 30 secondi a un minuto. Disidratare attraverso il 90% di alcol, quindi il 95% di alcol e alcol assoluto per 0,5-due minuti ciascuno. Dopo la disidratazione, cancellare in xilene per 30 secondi.Dopo il montaggio, analizzare la colorazione H&E utilizzando un microscopio a fluorescenza a campo luminoso. I globuli rossi rilasciati dai vasi sanguigni, che sono componenti delle CMH, appaiono in rosso-arancio sotto la colorazione H&E. Le CMH superficiali possono essere rilevate mediante osservazione lorda come indicato dalle frecce rosse.La colorazione blu di Evans rivela una visibile fluorescenza rossa in cui le molecole blu di Evans sono fuoriuscite da una barriera eencefalica ferita. La colorazione H&E mostra i globuli rossi trovati al di fuori dei capillari e la colorazione prussiana rivela punti di ioni ferrici derivati dalla lisi dei globuli rossi. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la dose di LPS per indurre micro-emorragia cerebrale è più grande di quella utilizzata nel morbo di Parkinson o nel modello di schizofrenia.Pertanto, l'ambiente degli animali dovrebbe essere mantenuto pulito per ridurre il tasso di mortalità. Seguendo questa procedura, altri metodi come la microscopia elettronica, la risonanza magnetica e l'imaging immunofluorescente potrebbero essere eseguiti per determinare il danno alla struttura esterna della barriera ematico-encefalica nella micro-emorragia cerebrale, la distribuzione di micro-emorragie cerebrali nel parenchima cerebrale in vivo, così come l'attivazione delle cellule gliali.

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Un basso Rat modello di mortalità per valutare ritardata vasospasmo cerebrale dopo emorragia subaracnoidea sperimentale

Modelli animali clinicamente rilevanti di emorragia intracerebrale (ICH) sono necessari per ampliare la nostra conoscenza di ictus emorragico e di esaminare nuove strategie terapeutiche. In questo studio, abbiamo descrivere e valutare due modelli ICH che implementano iniezioni unilaterali di ciascuna sangue autologo intero o collagenasi batterica nel gangli della base (corpo striato) di topi.

Modellazione emorragia intracerebrale in Mouse: iniezione di sangue autologo o collagenasi batterica

Questo video dimostra il processo di induzione dell'interruzione della barriera emato-encefalica (BBB) e delle microemorragie cerebrali in un modello di ratto utilizzando lipopolisaccaride (LPS). Evidenzia la sequenza delle risposte immunitarie che portano ad un aumento della permeabilità della BBB e al conseguente danno al tessuto cerebrale.

Induzione di microemorragie cerebrali in un modello di ratto utilizzando lipopolisaccaride

Questo video mostra un test per rilevare microemorragie cerebrali (CMH) in un modello di ratto. Le CMH sono emorragie cerebrali dovute alla rottura della barriera emato-encefalica, identificate dalla fuoriuscita di globuli rossi (RBC). In un modello di ratto, il tessuto cerebrale fissato viene crioprotetto, sezionato e colorato con ematossilina-eosina per i globuli rossi, consentendo la visualizzazione microscopica dei CMH. I globuli rossi trapelati appaiono al microscopio in rosso-arancio.

Rilevamento di microemorragie cerebrali in un modello di ratto

I modelli preclinici di emorragia intracerebrale vengono utilizzati per imitare alcuni aspetti della malattia clinica. Pertanto, possono essere esplorati i meccanismi di lesione e le potenziali strategie terapeutiche. In questo protocollo vengono descritti due modelli di emorragia intracerebrale, iniezioni intrastriatali (gangli della base) di sangue autologo o collagenasi.

Iniezione intrastriatali di sangue autologo o Clostridial Collagenase come modelli murini di emorragia intracerebrale

L'encefalopatia del prematuro comprende le anomalie del sistema nervoso centrale associate a lesioni da parto pretermine. Questo rapporto descrive un modello di ratto clinicamente rilevante di ipossia-ischemia sistemica transitoria in utero e somministrazione intra-amniotica di lipopolisaccaridi (LPS) che imita la corioamnionite e l'impatto correlato degli stimoli infettivi e della sottoperfusione placentare sullo sviluppo del SNC.

Modellazione Encefalopatia di prematurità Utilizzando prenatale ipossia-ischemia con Lipopolisaccaride intra-amniotico in ratti

Il protocollo qui presentato consente la riproduzione di una diffusa demielinizzazione della materia grigia di entrambi gli emisferi corticali nei ratti Dark Agouti maschi adulti. Il metodo comprende l'impianto intracerebrale di un catetere, l'immunizzazione subclinica contro la glicoproteina degli oligodendrociti mielinici e l'iniezione intracerebrale di una miscela di citochine pro-infiammatorie attraverso il catetere impiantato.

Modello di ratto di demielinizzazione corticale cerebrale diffusa indotta da un'iniezione intracerebrale di citochine pro-infiammatorie

Presentiamo un protocollo per stabilire un massiccio modello di emorragia pontina in un ratto attraverso la doppia iniezione di sangue autologo.

Emorragia pontina massiccia per doppia iniezione di sangue autologo

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Pre-chiasmatico, singola iniezione di sangue autologo per indurre emorragia subaracnoidea sperimentale in un modello di ratto

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Modellazione dell'idrocefalo postemorragico del prematuro nei ratti

In questo studio, una tecnica di instillazione endotracheale non invasiva è dimostrata per sviluppare l'ALI nei ratti utilizzando un laringoscopio di base per garantire una precisa somministrazione di LPS ai polmoni. La LPS viene immessa tramite un tubo endotracheale tramite un laringoscopio. L'entità della lesione polmonare viene valutata in più momenti temporali.

Somministrazione endotracheale non invasiva di lipopolisaccaridi per indurre lesioni polmonari acute nei roditori

Scopri come indurre microemorragie cerebrali sub-acute in ratti Sprague-Dawley tramite iniezione di LPS. Questo metodo permette di studiare la patogenesi delle CMH e il ruolo dell'infiammazione nelle patologie neurologiche.

Sub-acuta microemorragie cerebrale indotta tramite l'iniezione del Lipopolysaccharide in ratti

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