Invertire l'amplificazione isotermica mediata da Loop-trascrizione (RT-LAMP) analisi per Virus di Zika e geni Housekeeping in urina, siero ed esempi di zanzara

Questo metodo può determinare rapidamente se i campioni contengono virus Zika. Questo è utile per le donne incinte, le coppie che cercano di concepire o la sorveglianza delle popolazioni di zanzare locali che sono a rischio di infezione da Zika. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è veloce, facile, non richiede attrezzature costose e può essere fatto senza un passaggio di isolamento dell'RNA.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la diagnosi dell'infezione da Zika, perché l'infezione durante la gravidanza è legata a aborto spontaneo, parto morto e altri gravi difetti congeniti e neurologici alla nascita. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni su Zika, può anche essere applicato ad altre malattie infettive come dengue, chikungunya o virus del Nilo occidentale usando primer specifici del virus. Per iniziare, ricostituire ogni primer RT-LAMP in acqua di grado molecolare ad una concentrazione finale di 100 micromolari.

Vortice brevemente la soluzione primer per garantire che la soluzione sia omogenea. Centrifugare per circa cinque secondi alla massima velocità per raccogliere la soluzione primer. Quindi preparare un mix di primer RT-LAMP 10x come delineato nella tabella due del protocollo tecnologico.

Vortice brevemente per garantire omogeneità. E centrifugare brevemente alla massima velocità per evitare qualsiasi perdita. Conservare i primer a meno 20 gradi Celsius, tra un utilizzo e l'altro, evitando cicli di congelamento-scongelamento.

Per campioni di urina umana, utilizzare urina fresca, urina congelata o urina nel conservante. Scongelare eventuali campioni congelati sul ghiaccio prima dell'uso. I campioni di siero umano devono essere freschi o congelati, mentre le linee cellulari infette da ZIKV devono contenere mezzi condizionati o lire cellulari.

Infine, per le zanzare Aedes aegypti, utilizzare carcasse intere, fresche o congelate. Scongelare eventuali carcasse di zanzara congelate sul ghiaccio. Posizionare una zanzara individuale in 100 microlitri di PBS.

L'uso di una punta di pipetta P10 schiaccia la zanzara 10 volte e omogeneizzala per creare un lisato di zanzara grezzo. Centrifugare brevemente il lisato grezzo per pelletare eventuali detriti e utilizzare il supernatante per l'analisi RT-LAMP a valle. Per iniziare, prepara una reazione di master mix RT-LAMP sul ghiaccio per ogni primer impostato per essere utilizzato, come schema per tabella tre nel protocollo della tecnologia.

Vortice ogni campione per assicurarsi che sia ben miscelato. Quindi farli girare brevemente verso il basso per evitare perdite di volume. Per ogni reazione, pipettare 23,0 microlitri del master RT-LAMP in un tubo PCR da 200 microlitri.

Quindi, aggiungere due microlitri di campione per portare il volume totale a 25,0 microlitri. Utilizzare acqua di grado molecolare per il controllo negativo e assicurarsi di includere un controllo positivo. Opzionalmente, includere una reazione di controllo della specificità di un arbovirus correlato come il virus dengue, come delineato nel protocollo tecnologico.

Utilizzando un blocco di calore, un bagno d'acqua o un termociclo, riscaldare i campioni a 61 gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, aumentare il calore a 80 gradi Celsius per 10 minuti per disattivare termicamente la polimerasi. Eseguire l'analisi RT-LAMP in uno spazio chiuso separato.

Diluire il colorante acido nucleico fluorescente da uno a dieci nel tampone TAE. Aggiungere due micorliter della soluzione di colorante acido nucleico fluorescente a 12 micorliter della reazione RT-LAMP. Valutare visivamente le reazioni RT-LAMP cercando la presenza di un cambiamento di colore.

Facoltativamente, utilizzare una fotocamera per scattare foto delle reazioni RT-LAMP su uno sfondo bianco. Quindi, posizionare i campioni sotto una luce UV di 302 nanometri per confermare la presenza di prodotti RT-LAMP per fluorescenza. Usa una fotocamera per scattare una foto del risultato.

Per iniziare a eseguire l'elettroforesi versare il gel di agarosio del 2% in 1 tampone TAE con una macchia di acido nucleico per la visualizzazione. Aggiungere cinque microlitri di una scala del DNA nella prima corsia per confrontare i pesi molecolari. Per ogni reazione RT-LAMP, mescolare 13 microlitri di miscela di reazione RT-LAMP con due microlitri di colorante di carico del DNA.

Caricare questa miscela di 15 microliter. Eseguire il gel a 90 volt per 90 minuti o fino a quando le bande non sono separate. Un'immagine con luce UV di 302 nanometri.

Al termine, smaltire le reazioni RT-LAMP in sacchetti a doppia sigillatura. In questo studio, vengono utilizzati tre diversi metodi per analizzare le reazioni RT-LAMP. Quando si utilizza l'acido nucleico fluorescente, le reazioni positive diventano di colore giallo-verde, mentre le reazioni negative appaiono arancioni.

Questo colorante si traduce anche in un segnale fluorescente quando i campioni sono eccitati dalla luce UV. Infine, le reazioni RT-LAMP possono esaurirsi su un gel di agarosio. Le reazioni positive di RT-LAMP avranno un modello di bande, mentre le reazioni negative non avranno bande di DNA.

Questi metodi sono utilizzati per dimostrare la specificità della reazione ZIKV RT-LAMP. Solo il controllo molecolare ZIKV ha una reazione RT-LAMP positiva. Inoltre, mentre zikv viene rilevato sia nelle urine che nel siero di un paziente con infezione ZIKV nota, non è visto nel paziente di controllo asintomatico senza infezione da ZIKV.

I campioni vengono quindi testati per l'rRNA umano 18S. Solo i campioni prelevati dai pazienti sono considerati positivi per l'rRNA 18S. I campioni di zanzara possono essere testati in modo simile per ZIKV o il controllo di qualità RT-LAMP AEDAE.

Solo il controllo molecolare positivo per ZIKV e la zanzara infetta da ZIKV sono considerati positivi per ZIKV. Tuttavia tutte le zanzare sono positive per AEDAE di RT-LAMP. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di 30 minuti se viene eseguita correttamente.

È importante ricordare che le reazioni RT-LAMP sono soggette a false reazioni positive. Le fasi di prevenzione includono l'uso di una glicosilasi del DNA uracile termolabile nelle reazioni, l'uso di un flusso di lavoro laterale, l'esecuzione di analisi in uno spazio separato e la riduzione dei tubi di post amplificazione del tempo sono aperti. Seguendo questa procedura è possibile eseguire altri metodi come QPCR per rispondere a domande aggiuntive, come quante copie il virus, o altri bersagli, sono presenti nel campione.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare RT-LAMP per rilevare il virus Zika e i controlli del bersaglio nelle urine e nel siero umani, nonché nelle zanzare. Non dimenticare che lavorare con il virus Zika e la macchia di acido nucleico può essere estremamente pericoloso e precauzioni come indossare guanti dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura. Data l'associazione dell'infezione da virus Zika con anomalie congenite, le donne che sono incinte, che cercano di concepire, o partner di queste donne, dovrebbero ridurre significativamente la loro esposizione in laboratorio al virus Zika.