Generazione di colture del tessuto polmonare umano 3D (3D-LTC) per la modellazione di malattia
12 febbraio 2019
Qui, presentiamo un protocollo per la preparazione di fette di agarosio-riempito umano del polmone di taglio di precisione da tessuto resecato del paziente che sono adatti per la generazione di colture di tessuti del polmone 3D per malattie polmonari umane modello negli studi biologici e biomedici.
Questo metodo consente di investigazione del tessuto umano vivente nella sua struttura e composizione 3D naturale per la traduzione dei principali risultati di laboratorio in potenziali terapie. Questa tecnica consente specificamente la generazione di colture tissutali da tessuto polmonare umano resected chirurgico o espiantato per la visualizzazione di singoli campioni di tessuto polmonare del paziente deceduto. Il tessuto polmonare privo di malattie può essere utilizzato come colture di tessuti 3D per modellare malattie polmonari ex vivo consentendo l'analisi dei pathomechanismi precoci in un'alta risoluzione spaziotemporale.
Iniziare posizionando il campione polmonare resettato in 15 millilitri di mezzo di coltivazione in un piatto sterile da coltura di 15 centimetri e vassoio metallico sterile coperto di carta velina e riempire una siringa da 30 millilitri con agarosio a basso punto di fusione di 42 gradi Celsius. Rimuovere l'otturatore da un catetere venoso periferico e attaccare il catetere alla siringa da 30 millilitri. Identificare un bronco da 0,5 a 3 millimetri di diametro nel tessuto di ventilazione in una sezione intatta del tessuto e inserire delicatamente la canula nel bronco per quanto possibile.
Utilizzare pinze per comprimere la parete bronchiola intorno alla canula, bloccando idealmente qualsiasi arteria polmonare adiacente allo stesso tempo, per sigillare il bronco intorno alla canula e utilizzare un morsetto chirurgico per occludere qualsiasi altra airways aggiuntiva, per prevenire perdite di agarosio. Successivamente, utilizzare le forcep per sollevare il tessuto polmonare dal piatto di coltura e utilizzare la siringa per consegnare manualmente l'agarosio attraverso la canula, non più velocemente di 0,3 millilitri al secondo. Quando il tessuto polmonare viene riempito completamente senza gonfiare e troppo il tessuto, rimuovere immediatamente la canula e bloccare il bronco.
Immergere il tessuto nel terreno di coltura a quattro gradi Celsius per 30 minuti per facilitare la solidificazione dell'agarosio e ripetere la procedura di riempimento dell'agarosio per eventuali aperture aggiuntive di bronchiole. Quindi, conservare le sezioni del tessuto polmonare riempite di agarosio in quattro gradi Celsius medio fino all'affezione. Per l'affezione polmonare tagliata con precisione, identificare le regioni solidamente riempite di agarosio all'interno del tessuto polmonare, che non collassano quando delicatamente premute con pinzette contro il fondo del piatto di coltura cellulare.
Asportare un blocco da 1 a 1,5 centimetri cubi di regione solidamente riempita con un lato ancora coperto di pleura e utilizzare la colla cianoacrilato per attaccare il lato plurale di ogni blocco di tessuto al supporto del vibratomo. Affettare l'intera strada attraverso il lungo blocco tissutale, fino a quando solo due o tre milometri di tessuto non vengono lasciati affettati. Utilizzo di forcep per trasferire ogni sezione di 500 micrometri in un pozzo di un mezzo di coltivazione contenente dodici pozzi, man mano che vengono ottenuti.
Quando tutto il tessuto è stato sezionato, trasferire i campioni da ogni pozzo in singoli piatti di coltura di dieci centimetri e posizionare un punzonatore di biopsia di quattro millimetri ortogonalmente sulla superficie superiore della fetta polmonare tagliata con precisione. Quindi, spostando il punzonatore in rotazioni in senso orario e antiorario, ottenere punzoni tissutali del campione polmonare. Posizionare ogni punzone in un mezzo di coltura cellulare fresco in singoli pozzi di una piastra di 96 po 'mentre si ottengono.
Quando tutti i punzoni tissutali sono stati ottenuti, posizionare la piastra nell'incubatrice di coltura cellulare per un massimo di cinque giorni. L'immunoetichettatura della fibronectina nei nuclei cellulari utilizzando l'immunofluorescenza nelle colture di tessuti polmonari 3D umani consente l'imaging della struttura alveolare preservata ex vivo. Il trattamento dei punzoni a fette polmonari tagliati con precisione umana con un cocktail di citochina profibrotica per 48 ore provoca cambiamenti simili alla fibrosi nelle colture di tessuto 3D polmonare umano, tra cui la significativa induzione dei componenti della matrice extracellulare rilevanti per la fibrosi, il collagene di tipo Uno e i geni della fibronectina.
Inoltre, i livelli proteici della vimentina marcatore mesenchimale sono regolati in tre pazienti su quattro dopo il trattamento dei punzoni di coltura del tessuto polmonare 3D. Seguendo questa procedura, altri metodi come l'analisi dell'RNA mediante PCR quantitativa in tempo reale, o l'analisi proteica mediante gonfiore occidentale, possono essere eseguiti per valutare l'espressione genica e proteica rispettivamente all'interno del tessuto. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada a ricerche nel campo della pneumologia sperimentale, all'espianto della biologia polmonare e all'esecuzione di studi tossicologici e farmacologici su campioni di tessuto umano.
Ricorda che il tessuto umano vivo è potenzialmente infettivo e che le misure precauzionali come l'uso di dispositivi di protezione individuale e un adeguato stoccaggio, trasporto e trattamento dei rifiuti dei tessuti dovrebbero sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per la preparazione di fette polmonari umane tagliate con precisione riempite di agarosio, ottenute da tessuto paziente resecato. Queste fette sono adatte per generare colture di tessuto polmonare tridimensionali utili per modellare le malattie polmonari umane in studi biologici e biomedici.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Ricerca biomedica
- Modellizzazione delle malattie polmonari
- Tecniche di coltura tissutale 3D
Sfondo
- Il tessuto polmonare umano può essere utilizzato per studiare le malattie in una struttura tridimensionale naturale.
- Questo metodo consente la visualizzazione di campioni polmonari provenienti da singoli pazienti.
- Permette l'analisi dei meccanismi patogenetici precoci con elevata risoluzione spaziotemporale.
- Sono necessarie misure precauzionali a causa della natura infettiva del tessuto umano vivo.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo per la creazione di colture tridimensionali di tessuto polmonare.
- Facilitare lo studio delle malattie polmonari ex vivo.
- Permettere l'analisi dell'espressione genica e proteica nel tessuto polmonare umano.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di campioni di tessuto polmonare mediante agarosio a basso punto di fusione.
- Taglio preciso di sezioni polmonari contenenti agarosio.
- Tecniche di immunomarcatura per la visualizzazione della struttura tissutale.
- Analisi dell'espressione genica e proteica mediante PCR e western blotting.
Risultati principali
- Induzione di cambiamenti simili alla fibrosi in colture di tessuto polmonare dopo trattamento con citochine.
- Superespressione dei geni del collagene di tipo I e della fibronectina.
- Aumento dei livelli proteici del marcatore mesenchimale vimentina nei campioni trattati.
- Potenzialità per ulteriori ricerche in pneumologia e farmacologia sperimentale.
Conclusioni
- Questa tecnica migliora la comprensione della biologia polmonare.
- Fornisce una piattaforma per studi tossicologici e farmacologici.
- La ricerca futura potrà basarsi su questo metodo per ottenere modelli di malattia più accurati.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Colture tridimensionali di tessuto polmonare umano derivate da fette polmonari tagliate con precisione forniscono un modello ex vivo fisiologicamente rilevante per lo studio dei meccanismi delle malattie e delle risposte ai farmaci nell'architettura tissutale umana nativa. Questo approccio supporta la validazione degli obiettivi e la riduzione del rischio meccanicistica, permettendo la valutazione diretta degli effetti dei composti in campioni polmonari malati o peritumorali provenienti da singoli pazienti. Il modello aumenta la fiducia predittiva nella valutazione preclinica preservando la diversità cellulare, la composizione della matrice extracellulare e le proprietà biomeccaniche fondamentali per la rilevanza traslazionale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche in tessuto polmonare umano integro, con struttura tridimensionale e diversità dei tipi cellulari preservate.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale dei bersagli misurando le variazioni indotte dai farmaci nei biomarcatori associati alla fibrosi, come il collagene di tipo I e la fibronectina.
- Valore scientifico: Facilita la chiarificazione dei percorsi molecolari mediante l'analisi spaziotemporale dei primi meccanismi patogenetici in tessuti umani rilevanti per la malattia.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera campioni di tessuto standardizzati e riproducibili adatti allo screening di composti in piastre multipozzetta.
- Valore operativo: Consente letture quantitative mediante immunofluorescenza, qPCR e western blotting per analisi di risposta dose-dipendente e nel tempo.
- Valore scientifico: Aumenta il rendimento del tessuto ottenuto da campioni paziente limitati tramite biopsia a punzonatura, migliorando la scalabilità del saggio e la capacità di replicazione.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Modella processi fibrotici specifici dell'uomo a livello subcellulare, utilizzando modifiche indotte da citochine che simulano la fibrosi in fette polmonari tagliate con precisione.
- Valore operativo: Fornisce un sistema rilevante per la malattia per valutare l'interazione con il bersaglio e il meccanismo d'azione in tessuto umano prima di studi in vivo.
- Valore scientifico: Favorisce l'allineamento dei biomarcatori traslazionali consentendo la correlazione tra risposte molecolari e esiti funzionali a livello tissutale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla verifica iniziale dell'ipotesi sul bersaglio all'identificazione di composti promettenti fino alla validazione preclinica, consentendo un'affinamento iterativo basato sulle risposte dei tessuti umani.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi consentendo la visualizzazione della struttura alveolare e delle risposte cellulari in espianti polmonari umani integri.
- Screening: Fornisce biopsie di tessuto pronte per i saggi, con dimensioni e vitalità costanti, per lo screening di librerie di composti in formati a 96 pozzetti.
- Analisi: Permette letture multiplex, inclusa l'espressione genica (qPCR), i livelli proteici (western blot) e l'analisi strutturale mediante imaging (immunofluorescenza), per confrontare diverse condizioni di trattamento.
- Ricerca traslazionale: Collega la fase di scoperta al lavoro preclinico mantenendo la complessità del tessuto umano e consentendo l'analisi delle risposte stratificate per paziente.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la modellizzazione delle malattie polmonari, applicabile a diversi progetti e aree terapeutiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo le lacune legate alla traduzione tra specie mediante l'uso diretto di tessuto polmonare umano.
- Valore operativo: Standardizza la preparazione del tessuto attraverso l'inclusione in agarosio e il taglio di precisione, migliorando la riproducibilità tra diversi utilizzatori e siti.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo fornendo precoci segnali di efficacia e tossicità basati su tessuto umano.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei composti in base al rischio, sulla base degli effetti meccanicistici osservati in campioni polmonari umani malati o peritumorali.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione di tessuti umani, nella tecnica asettica e nella sezionatura con vibratomo.
- Dipende dall'accesso a tessuto polmonare resecato chirurgicamente e ad agarosio a basso punto di fusione per la preservazione della struttura.
- Necessita di condizioni di coltura standardizzate e di controlli contro la contaminazione a causa del potenziale infettivo del tessuto umano vivo.
- Richiede l'ottimizzazione delle dimensioni del punch per biopsia e della tecnica di rotazione per garantire l'uniformità del campione tra i replicati.
- È limitato dalla finestra di vitalità del tessuto, che richiede una lavorazione tempestiva e l'avvio rapido della coltura dopo la resezione.
