Name: Mieloide innata Signaling Pathway regolamento da MALT1 Paracaspase attività (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Scopri come MALT1 regola selettivamente la produzione di citochine nelle vie di segnalazione dei recettori di tipo lectina C nelle cellule mieloidi umane e murine. Questo metodo aiuta a comprendere i meccanismi immunitari innati.

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Ringraziamo Elsevier per la loro autorizzazione (numero di licenza 4334770630127) di riprodurre qui Figura 2A da Unterreiner et al. (2017).

Gli esperimenti sono stati condotti secondo le linee guida e standard del Comitato di etica Novartis umana ricerca.
1. preparazione di cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCs) da umano Buffy Coats
Nota: Abbiamo ricevuto buffy cappotti da volontari sani un giorno dopo la raccolta, in sacchetti da 50 mL. Sono stati forniti sotto consenso informato e raccolti attraverso l' Interregionale trasfusione Schweizeriches Rotes Kreuz. Abbiamo gestito utilizzando la procedura qui di seguito, a temperatura ambiente, se non specificato diversamente.
<ol><li>Preparare una coppia sterile e pulita di forbici e un becher da 1 litro con un sacchetto di plastica (sotto un flusso della lamina).</li>
	<li>Trasferire il buffy-coat nel becher e aprire con cautela con le forbici.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta 25 mL, aggiungere 100 mL di acido etilendiamminotetracetico/tampone salina tampone fosfato (PBS/EDTA: pH di PBS 1X 7.4 contenente nessun CaCl2 e nessun MgCl2, completati con 2 mM pH 8.0 di EDTA). Nota: Utilizzando la stessa pipetta e dopo lentamente pipettaggio la soluzione su e giù, dispensare 25 mL del cappotto buffy diluito in 6 tubi di centrifuga a fondo conico da 50 mL preriempita con 15 mL di pendenza di densità base polisaccaridica.</li>
	<li>Centrifugare 20 min a 800 x g con moderata accelerazione (impostato a 4 su 9) e senza freno per consentire per la separazione delle cellule basato sulla loro densità. Nota: Dopo la centrifugazione, tre strati sarà visibile; un pellet contenenti globuli rossi e granulociti, uno strato superiore in fatto di plasma e tra un anello bianco contenente cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCs).</li>
	<li>Raccogliere l'anello PBMC utilizzando una pipetta da 10 mL e trasferimento in nuove provette da 50 mL. Nota: Due o tre provette da 50 mL sono normalmente richieste per buffy-coat. In questa fase, alcuni plasma probabile contamina i PBMCs raccolti, che non dovrebbe incidere sui passi successivi arricchimento.</li>
	<li>Top fino a 50 mL ogni tubo con PBS/EDTA e procedere a tre lavaggi successivi con la diminuzione della velocità (15 min a 520 x g, 10 min a 330 x g, 8 min a 150 x g) e tempo di centrifugazione. Nota: Ad ogni passo, il surnatante è travasato in un contenitore per rifiuti liquidi e il pellet cellulare è risospeso in 50 mL di PBS/EDTA (pellet può essere riunita dopo il primo lavaggio).</li>
	<li>Dopo il lavaggio finale, risospendere il pellet in 25 mL di un tampone di lisi ghiacciata (Vedi Tabella materiali) per lisare le cellule di anima rosse di pressione osmotica.</li>
	<li>Incubare fino a quando la soluzione diventa chiara (≤ 5 min a temperatura ambiente).</li>
	<li>Fermare la reazione aggiungendo 25 mL di tampone di separazione (PBS 1 x pH 7.4 contenente nessun CaCl2 e nessun MgCl2, completati con 2% inattivati siero bovino fetale (FBS) e 1 mM EDTA pH 8.0).</li>
	<li>Lavare un'altra volta a 150 x g per 8 min. Nota: In questa fase PBMCs può essere utilizzato come una popolazione di massa (vedere il passaggio 3: trattamenti PBMCs e monociti e stimolatori condizioni) o trattati per l'arricchimento del monocito (vedere il passaggio 2: preparazione dei monociti da PBMCs), o congelati giù per un uso successivo (vedere passaggio 5: Monociti e PBMCs procedure di congelamento/scongelamento).</li>
</ol>2. preparazione dei monociti da PBMC
<ol><li>Risospendere i PBMC ottenuti al punto 1.10 nel buffer di separazione e contarli per raggiungere 5 x 107cellule/mL.</li>
	<li>Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica per centrifuga 14 mL con tappo.</li>
	<li>Aggiungere 50 µ l di anticorpo di arricchimento del monocito cocktail per mL di sospensione cellulare, vortice e incubare per 10 minuti a 4 ° C.</li>
	<li>Aggiungere 50 µ l di perline di arricchimento del monocito di cellule per mL. Nota: Le perline devono essere accuratamente agitati con vortex per garantire omogeneità della sospensione.</li>
	<li>Dopo aver aggiunto le perline, poco vortice la sospensione cellulare e incubare per 5 minuti a 4 ° C.</li>
	<li>Sciacquare la parte superiore del tubo con il tampone di separazione fino a quando il tubo è riempito fino a 10 mL.</li>
	<li>Mescolare lentamente la soluzione pipettando su e giù.</li>
	<li>Posizionare il tubo senza cappuccio in un magnete di separazione.</li>
	<li>Incubare per 2,5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Versare lentamente in una provetta conica per centrifuga da 15 mL.</li>
	<li>In questa fase, utilizzare direttamente i monociti (vedere il passaggio 3: trattamenti PBMCs e monociti e stimolatori condizioni) o li differenziano in hommature Monocyte-derivato Dendritic Cells (iMoDCs) (Vedi punto 4), o congelarli giù per un uso successivo (Vedi punto 5).</li>
</ol>3. PBMCs, monociti trattamenti e condizioni stimolatore
<ol><li>Contare le celle e diluirli in terreno di coltura (medie Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 10% FBS, 100 U/mL penicillina streptomicina (Pen/Strep) + 1 mM sodio piruvato + µM 5 β-mercaptoetanolo), fino a 1,25 x 104 cellule/pozzetto.</li>
	<li>Distribuire 30 µ l della sospensione di cellule per pozzetto di una piastra 384 pozzetti.</li>
	<li>Aggiungere 15 µ l di 4 x soluzioni concentrate di composte e pre-Incubare per 1h a 37 ° C, 5% CO2.</li>
	<li>Aggiungere il lipopolisaccaride (LPS) ad una concentrazione finale di 10 ng/mL, impoverito zymosan (DZ) a una concentrazione finale di 100 µ g/mL o tenere nel mezzo di pianura.</li>
	<li>Incubare per una notte a 37 ° C, 5% CO2.</li>
	<li>Prendere 10 µ l del surnatante per misurare i livelli di TNF-a secrete (vedere il passaggio 7: misure di citochine e redditività).</li>
</ol>4. monociti differenziazione in iMoDCs e condizioni stimolatore
<ol><li>Contare i monociti (arricchiti al passo 2) e centrifugare la sospensione cellulare a 520 x g per 5 min.</li>
	<li>Pipettare il sovranatante ed aggiungere il terreno di coltura (RPMI + 10% FBS per ottenere una sospensione cellulare finale di 0,4 x 106 cellule/mL.</li>
	<li>Aggiungere 80 ng/mL ricombinante umano IL-4 + 100 ng/mL GM-CSF.</li>
	<li>Pipettare 5 mL della sospensione di cellule per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.</li>
	<li>Incubare per 7 giorni a 37 ° C, 5% CO2.</li>
	<li>Al giorno 7, è possibile raccogliere le cellule pipettando delicatamente per evitare la loro attivazione.</li>
	<li>Centrifuga a 520 x g per 5 min.</li>
	<li>Aspirato di vuoto e risospendere in 50 mL di terreno di coltura senza fattori di crescita.</li>
	<li>Centrifugare a 520 x g per 5 min e risospendere a 1 x 106 cellule/mL nel terreno di coltura.</li>
	<li>Pipettare 100 µ l di sospensione cellulare (105 celle) per pozzetto di una piastra 96 pozzetti piatto inferiore.</li>
	<li>Pre-incubate per 1 h a 37 ° C dopo l'aggiunta di 50 µ l di 4x concentrato soluzioni composti, preparati come descritto al passo 8: preparazione di composti.</li>
	<li>Aggiungere 50 µ l di stimoli (4x concentrato), preparato come descritto al passaggio 9.</li>
	<li>Incubare per 24 h a 37 ° C.</li>
	<li>Mescolare ogni bene e trasferimento di cellule e il surnatante (SN) in una piastra a 96 pozzetti fondo V.</li>
	<li>Rotazione verso il basso a 475 x g per 5 min.</li>
	<li>Trasferire il surnatante in una nuova piastra di fondo piatto 96 pozzetti, sigillare e congelare a-20 ° C fino al successivo utilizzo.</li>
</ol>5. i monociti e le procedure di congelamento/scongelamento di PBMCs
<ol><li>
Congelamento
	<ol>
<li>Rotazione verso il basso PBMC o monocito preparazioni di cellule a 520 x g per 5 min.</li>
		<li>Vuoto di aspirare il supernatante e risospendere le cellule in mezzo a 1 x 107 cellule/mL di congelamento.</li>
		<li>Dispensare 1 mL di sospensione cellulare in provette per criogenia, i tubi di trasferimento a un dispositivo di raffreddamento specifico (Vedi tabella materiali) e posizionarlo a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lo scongelamento
	<ol>
<li>Scongelare lo stoccaggio provette criogenia e trasferire rapidamente il suo contenuto in una provetta da centrifuga a fondo conico da 15 mL contenente 9 mL di terreno di coltura.</li>
		<li>Centrifuga a 520 x g per 5 min.</li>
		<li>Vuoto di aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 5 mL di terreno di coltura. Le cellule sono pronte per l'ulteriore elaborazione sperimentale.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Mouse milza cellule preparazione e trattamento
Nota: Abbiamo condotto i sacrifici animali secondo le linee guida e norme dell'organizzazione Novartis Animal Welfare. Gli studi sono stati approvati dal comitato etico dell'autorità pubblica regionale (Kantonales Veterinäramt der Stadt Basel). Abbiamo sacrificato animali da sovraesposizione isoflurano, con tutti gli sforzi compiuti per ridurre al minimo la sofferenza.
<ol><li>Raccogliere la milza e dissociare tessuto usando un tubo dotato di un dispositivo di smerigliatrice meccanica del tessuto e riempito con 5 mL di fluido freddo RPMI.</li>
	<li>Utilizzare il programma di milza della macchina dissociazione per macinare gli organi.</li>
	<li>Le celle filtranti attraverso un colino di cella di 100 mm in nylon.</li>
	<li>Trasferire la sospensione in provette da 50 mL e centrifugare a 4 ° C per 10 min a 320 x g.</li>
	<li>Vuoto aspirato il sovranatante, risospendere il pellet cellulare in 3 mL di tampone di lisi ghiacciata e incubare per ≤ 2 min sul ghiaccio.</li>
	<li>Smettere di lisi aggiungendo 7 mL di terreno RPMI.</li>
	<li>Filtrare nuovamente attraverso un colino di cella di 100 µm in nylon.</li>
	<li>Rotazione verso il basso sospensione cellulare a 330 x g per 10 min a 4 ° C.</li>
	<li>Vuoto di aspirare il surnatante e risospendere le cellule a 11 x 106 cellule/mL in medium completo (RPMI supplementato con 10% FBS, 100 U/mL penna/Step e 5 µM. β-mercaptoetanolo).</li>
	<li>Piastra di 1 x 106 cellule/pozzetto (90 µ l) in una piastra a 96 pozzetti (fondo piatto).</li>
	<li>Aggiungere 5 µ l di 20x concentrata soluzione composto precedentemente diluito nel medium RPMI come descritto al punto 8.3: diluizione seriale per cellule murine della milza.</li>
	<li>Incubare per 30 min a 37 ° C, 5% CO2.</li>
	<li>Aggiungere 5 µ l di 20x concentrata DZ (concentrazione finale di 30 µ g/mL) o 20x concentrata LPS + IFN-g (TLR-4) (concentrazione finale di 1 µM LPS e 10 ng/mL IFN-g).</li>
	<li>Incubare per una notte a 37 ° C, 5% CO2.</li>
	<li>Centrifuga a 330 x g per 10 min.</li>
	<li>Trasferire i surnatanti in nuove piastre, sigillare e congelare a-20 ° C fino al successivo utilizzo.</li>
</ol>7. citochine e misure di redditività
<ol><li>
Umano TNF-a misura di HTRF (omogeneo tempo risolto fluorescenza) Nota: Il protocollo seguito le raccomandazioni del fornitore, brevemente riassunte di seguito.<ol>
<li>Mescolare 1 volume di reagente ricostituito (anti-TNF-a-cryptate e anti-TNF-a-XL665) con 19 volumi di tampone di ricostituzione (50 mM tampone fosfato a pH 7.0, fluoruro di potassio 0,8 M (KF), 0,2% albumina di siero bovino (BSA)).</li>
		<li>Mescolare le due soluzioni di ready-to-use anticorpo 1:1 solo prima dell'erogazione i reagenti.</li>
		<li>Pipettare 10 µ l di surnatanti dal passaggio 3.6 in piastre da 384 pozzetti bianche.</li>
		<li>Pipettare 10 µ l della miscela dell'anticorpo.</li>
		<li>Coprire la piastra con un foglio sigillante e incubare a 4 ° C durante la notte.</li>
		<li>Leggere la piastra su un lettore di micropiastre (50 – 200 flash).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Umano IL-23 misura di HTRF (omogeneo tempo risolto fluorescenza) Nota: Il protocollo seguito le raccomandazioni del fornitore, brevemente riassunte di seguito.<ol>
<li>Mescolare 1 volume di reagente ricostituito (anti IL-23-cryptate-anticorpo e anti-IL-23 D2-anticorpo) con 19 volumi di tampone di rilevamento #3.</li>
		<li>Mescolare le due soluzioni di ready-to-use anticorpo 1:1 solo prima dell'erogazione i reagenti.</li>
		<li>Pipettare 10 µ l di surnatanti dal passaggio 3.6 in piastre da 384 pozzetti bianche.</li>
		<li>Pipettare 10 µ l della miscela dell'anticorpo.</li>
		<li>Coprire la piastra con un foglio sigillante e incubare a 4 ° C durante la notte.</li>
		<li>Leggere la piastra su un lettore di micropiastre (50 – 200 flash nm).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Umano IL-6, IL-8, IL-1 β e TNF-α misure di elettrochemiluminescenza Nota: Tutti i campioni sono stati diluiti a 1/150 in diluente 2 (prima diluizione: 10 µ l in 150 µ l, poi 20 µ l in 180 µ l). Il protocollo seguito le raccomandazioni del fornitore:<ol>
<li>Diluire i campioni e standard in diluente 2.</li>
		<li>Procedere alla diluizione dello standard in diluente 2 utilizzando una diluizione seriale piega 1/4.</li>
		<li>Lavare le piastre tre volte con tampone di lavaggio.</li>
		<li>Pipettare 50 µ l di campioni o standard per pozzetto.</li>
		<li>Incubare per 2 ore a temperatura ambiente sotto agitazione.</li>
		<li>Lavare la piastra quattro volte con PBS + 0.05% polisorbato 20.</li>
		<li>Aggiungere 25 µ l di anticorpo di rilevazione (60 µ l di ciascun anticorpo per 3 mL finale) nel diluente 3.</li>
		<li>Incubare per 2 ore a temperatura ambiente sotto agitazione.</li>
		<li>Lavare la piastra quattro volte con PBS + 0.05% polisorbato 20.</li>
		<li>Evitando bolle, aggiungere 150 µ l di buffer di lettura (tampone Tris-base contenente tripropilammina, diluito 2 x ddH20) come un co-reagente per la generazione di luce nei immunoassays elettrochemiluminescenza.</li>
		<li>Leggere la piastra (senza ritardo) su un lettore di multiplex.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mouse TNF-a misura di ELISA seguendo il protocollo del fornitore
	<ol>
<li>Diluire il sopranatante 1:1 in diluente di dosaggio (pronto per l'uso tampone contenente proteine).<ol>
<li>Preparare i reagenti, campioni e diluizioni standard, come descritto nel kit. Aggiungere 50 μL di dosaggio diluente a ciascun pozzetto.</li>
			<li>Aggiungere 50 μL di standard, controllo o campione per pozzetto.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Mescolare scuotendo leggermente il telaio piatto per 1 min.</li>
		<li>Coprire con il nastro adesivo fornito e incubare per 2 ore a temperatura ambiente.</li>
		<li>Aspirare ogni bene e lavare con 400 μL/pozzetto (Ripeti questo passo cinque volte in totale).</li>
		<li>Dopo il lavaggio finale, rimuovere qualsiasi residuo tampone di lavaggio aspirando.</li>
		<li>Capovolgere la piastra e macchia contro gli asciugamani di carta pulito.</li>
		<li>Aggiungere 100 μL di coniugato del mouse TNF-α in ciascun pozzetto. Coprire con una nuova striscia adesiva.</li>
		<li>Incubare per 2 ore a temperatura ambiente.</li>
		<li>Ripetere il lavaggio/aspirazione come descritto al punto 7.4.4.</li>
		<li>Aggiungere 100 μL di soluzione di substrato in ogni pozzetto e incubare per 30 min a temperatura ambiente al riparo dalla luce.</li>
		<li>Aggiungere 100 μL di soluzione di acido cloridrico diluito (soluzione di stop) in ciascun pozzetto. Picchiettare delicatamente la piastra per garantire la completa miscelazione.</li>
		<li>Misurare la densità ottica a 450 nm (con la lunghezza d'onda di correzione impostato a 560 nm) utilizzando un lettore di micropiastre (da fare entro 30 min).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vitalità cellulare
	<ol>
<li>Dopo aver rimosso i surnatanti dalle preparazioni di PBMC o monocito, valutare la vitalità cellulare utilizzando un pronto per usare resazurin soluzione (indicatore di ossido-riduzione) aggiunto direttamente alla sospensione di cellule a concentrazione finale di 10%.</li>
		<li>Incubare per 1-2 ore a 37 ° C, 5% CO2.</li>
		<li>Leggere fluorescenza a 590 nm (eccitazione 540 nm) utilizzando un lettore di micropiastre.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. Preparazione mescole
<ol><li>
Diluizione seriale per iMoDCs
	<ol>
<li>Diluire la soluzione di riserva di MLT-827 (10 mM di solfossido dimetilico (DMSO) in mezzo a raggiungere 8 µM in una sola volta (4x concentrato).</li>
		<li>Eseguire una diluizione seriale di sei-punto 1:5, utilizzando medium + 0,08% DMSO. Utilizzare la stessa medium + 0,08% soluzione di DMSO per la condizione di veicolo (nessun residuo).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Singola dose test per iMoDCs
	<ol>
<li>Diluire le soluzioni stock MLT-827, AFN700 e Cpd11 nel mezzo per raggiungere 4 µM in una sola volta (4x concentrato).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Diluizione seriale per cellule murine della milza
	<ol>
<li>Diluire una soluzione di MLT-827 10 µM (ottenuta da una soluzione madre di 10mm seguendo un'una diluizione vanno in mezzo) a 0.01 µM, con una concentrazione di DMSO fine dello 0,1%.</li>
		<li>Per i passaggi di diluizione, prendere 2 µ l di ciascuna diluizione, aggiungere 38 µ l RPMI e pipettare 5 µ l nel pozzo. Nota: Tutti i trattamenti sono eseguiti in triplice copia.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. stimoli preparazione
<ol><li>
Impoverito zymosan (DZ)
	<ol>
<li>Aggiungere 2 mL di acqua sterile privo di endotossina a 10 mg di DZ.</li>
		<li>Vortice per omogeneizzare la soluzione di riserva, vortice anche preventiva ogni uso.</li>
		<li>Aliquotare aliquote soluzione e conservare a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Trealosio-6,6-dibeenato di glicerina (TDB)
	<ol>
<li>Aggiungere 100 µ l di DMSO a 1mg TDB, riscaldare a 60 ° C a bagnomaria per 15 – 30 s.</li>
		<li>Vortice e immediatamente 900 µ l di PBS sterile, vortice nuovamente.</li>
		<li>Riscaldare per 10 – 15 minuti a 60 ° C e omogeneizzare previo Vortex ogni uso.</li>
		<li>Mantenere la soluzione a 4 ° C.</li>
		<li>Effettuare diluizioni seriali e dose singola preparazione per quanto riguarda il composto MLT-827. Nota: Perché TDB deve essere preparato in DMSO, un finale 1% di concentrazione di DMSO è presente durante la stimolazione di cellule.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In questo lavoro, abbiamo usato semplici impostazioni sperimentali per studiare le vie di segnalazione in umani e cellule innate del mouse e interrogare la loro dipendenza sulla funzione proteolitica MALT1. Espansione sul precedente lavoro11, il nostro studio ha mostrato che MALT1 paracaspase attività controlla C-tipo recettore di lectin-like indotto produzione di citochine, tra cui TNF-α. Al contrario, TLR-4-induced TNF-α è stato indipendente di MALT1 in entrambe le specie. Collettivamente, quest...

L'attività di paracaspase di MALT1 (tessuto linfoide Mucosa-collegato linfoma traslocazione della proteina 1) è stata rivelata nel 20081,2. Da allora, una serie di studi hanno riferito suo contributo critico alla risposte del ricevitore dell'antigene nei linfociti. Modelli genetici nel topo come pure farmacologia dati supportano un ruolo chiave in cellule di T, nell'autoimmunità dipendente di cellule T e nelle cellule B linfoma impostazioni3,4. Nei linfociti, MALT1 paracaspase l'attivazione si verifica al momento del montaggio di un CARD11-BCL10-MALT1 complesso5, che viene attivato da prossimale di segnalazione del ricevitore dell'antigene a valle del recettore della cellula T o B. Inoltre ci sono ampie prove che un simile complesso CARD9-BCL10-MALT1 è importante per la propagazione di segnali a valle dei recettori di tipo C il lectin-like (CLLR), ad esempio, Dectin-1, Dectin-2 e MINCLE in mieloide cellule6,7. Dectin-1 è stato studiato particolarmente bene perché questa via è fondamentale per la difesa dell'ospite contro le infezioni fungine8,9. Implicazione di MALT1 nelle vie di recettori Toll-like (TLR), tuttavia, è rimasto controverso10. La prova recente in cellule mieloidi umane escluso un ruolo diretto per MALT1 paracaspase attività nella regolazione del TNF-produzione a valle di TLR-411.
Nel presente lavoro, abbiamo usato varie impostazioni sperimentali e stimolatori condizioni in essere umano e cellule mieloidi del mouse per sondare le vie di segnalazione innate, basandosi su inibitori specifici strumento farmacologico e misurazione della produzione di citochine.

<table><tbody><tr><td>100 &micro; m filtro cellulare in nylon</td><td>Sigma</td><td>CLS431752</td><td></td></tr><tr><td>provetta Falcon da 14 mL</td><td>BD Falcon</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>provetta Falcon da 15 mL Falcon Falcon</td><td></td><td>352090</td><td></td></tr><tr><td>provetta Falcon da 50 mL Falcon</td><td></td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>piastre a 6 pozzetti</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>piastra a fondo piatto a 96 pozzetti, con coperchio a bassa evaporazione</td><td>Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Piastra con fondo a V a 96 pozzetti</td><td>Costar</td><td>734-1798</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di ammonio - NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Diluente per test RD1-W ELISA</td><td>R& D</td><td>895038</td><td>Diluente per</td></tr><tr><td>test Micropiastra per colture cellulari, 384 pozzetti, Greiner nero</td><td></td><td>781986</td><td></td></tr><tr><td>Zymosan impoverito</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-dzn</td><td>ora: tlrl-zyd</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>EDTA-Na2</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td>Acido etilendiamminotetraacetico sale disodico diidrato</td></tr><tr><td>ELISA muTNF-&alfa;</td><td>R& D</td><td>SMTA00</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>tubi delicati MACS C MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>dissociatore delicato MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Novartis-Siero</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>fetale bovino inattivato a caldo</td><td>Gibco</td><td>10082</td><td>FBS</td></tr><tr><td>HTRF hu IL-23</td><td>CisBio</td><td>62HIL23PEG</td><td></td></tr><tr><td>HTRF hu TNF-&alpha;</td>Tampone di ricostituzione <td>CisBio</td><td>62TNFPEC</td><td></td></tr><tr><td>HTRF</td><td>CisBio</td><td>62RB3RDE</td><td>50mM Tampone fosfato, pH 7,0, 0,8M KF, 0,2%</td></tr><tr><td>BSA IFN-&gamma;</td><td>R& D</td><td>L4516</td><td></td></tr><tr><td>IL-4</td><td>Novartis-Isoflurano</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Abbott</td><td>Forene</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisaccaridi (LPS)</td><td>Sigma</td><td>L4391</td><td>LPS utilizzato in campioni umani</td></tr><tr><td>Lipopolisaccaridi</td><td>Sigma</td><td>L4516</td><td>LPS utilizzato in campioni murini Tampone</td></tr><tr><td>di lisi</td><td>Autoprodotto-155</td><td></td> <td>mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 1 mM EDTA, pH 7,4</td></tr><tr><td>Magnete</td><td>Stemcell</td><td>18001</td><td></td></tr><tr><td>Micropiastra, 384 pozzetti bianco</td><td>Greiner</td><td>784075</td><td></td></tr><tr><td>Kit di arricchimento di monociti</td><td>Stemcell</td><td>19059</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Mr. Frosty Cryo 1&deg; C Contenitore di congelamento</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>dispositivo di raffreddamento (contenente Propanolo-2)</td></tr><tr><td>PBS 1x pH 7,4 [-] CaCl2 [-] MgCl2</td><td>Gibco</td><td>10010</td><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>Pen/Strep</td></tr><tr><td>Bicarbonato di potassio - KHCO3</td><td>Sigma</td><td>P9144</td><td></td></tr><tr><td>PrestoBlue</td><td>Invitrogen</td><td>A13262</td><td>Soluzione di resazurina per la valutazione della vitalità</td></tr><tr><td>Propanolo-2</td><td>Merck</td><td>1.09634</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di lettura</td><td>MesoScale Discovery</td><td>R92TC-3</td><td>Tampone a base di Tris contenente tripropilammina</td></tr><tr><td>Terreno di congelamento per colture cellulari di recupero</td><td>Gibco</td><td>12648-010</td><td>Terreno di congelamento</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) con Glutamax</td><td>Gibco</td><td>61870</td><td>+ 10% FBS per iMoDCs + 10% FBS + 1 mM di piruvato di sodio + 100 U/mL Pen/Strep + 5 &micro; M &beta;-mercaptoetanolo per PBMC e monociti umani + 10% FBS + Pen/Strep + 5 &micro; M &beta;-mercaptoetanolo per splenociti murini</td></tr><tr><td>Tampone di separazione</td><td></td> <td>Autoprodotto-PBS</td> <td>pH 7,4 + 2% FBS + 1 mM EDTA pH 8,0</td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Gibco</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>Trealosio-6,6-dibehenato</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-tdb</td><td></td></tr><tr><td>TDB Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td>Polisorbato 20</td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15675</td><td>Acido etilendiamminertetraacetico</td></tr><tr><td>Sigillante</td><td>Viewseal Greiner BioOne</td><td>676070</td><td></td></tr><tr><td>V-PLEX Pannello proinfiammatorio 1 Kit umano</td><td>MesoScale Discovery</td><td>K15049D</td><td>test multiplex elettrochemiluminescente (IL-1&beta;, TNF-&alpha;, IL-6, IL-8)</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanolo</td><td>Gibco</td><td>31350</td><td></td></tr></tbody></table>

mieloide innata signaling pathway regolamento da malt1 paracaspase attività

Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity

Oltre alla sua funzione in cellule linfoidi, che è stato affrontato da numerosi studi, la paracaspase MALT1 svolge anche un ruolo importante in cellule innate a valle dei recettori di riconoscimento di pattern. Meglio studiati sono i membri Dectin-1 e Dectin-2 della famiglia C-tipo recettore lectin-like che inducono un dipendente SYK e CARD9 segnalazione cascata che portano all'attivazione di NF-κB, in un modo MALT1-dipendente. Per contrasto, recettori Toll-like (TLR), ad esempio TLR-4, propagano l'attivazione n-f-κB ma segnale attraverso una cascata di MYD88/IRAK-dipendente. Comunque, se MALT1 potrebbe contribuire alla segnalazione TLR-4 è rimasto poco chiaro. La prova recente con MLT-827, un inibitore potente e selettivo di MALT1 paracaspase attività, indica che il TNF-produzione a valle di TLR-4 in cellule mieloidi umane è indipendente di MALT1, in contrasto con la produzione di TNF a valle di Dectin-1, che è MALT1 dipendente. Qui, abbiamo affrontato la partecipazione selettiva di MALT1 nel riconoscimento di pattern sensing ulteriormente, utilizzando una varietà di umani e preparazioni cellulari del mouse e stimolazione delle vie Dectin-1, MINCLE o TLR-4. Abbiamo anche fornito ulteriori approfondimenti esplorando citochine di là di TNF- e confrontando MLT-827 di un inibitore SYK (Cpd11) e di un inibitore IKK (AFN700). Collettivamente, i dati forniti ulteriori prove per la MALT1-dipendenza di recettori di tipo C il lectin-like — al contrario di segnalazione per TLR-segnalazione.

In cellule mieloidi, MALT1 trasmette i segnali di attivazione a valle di parecchi ricevitori di lectin-come di tipo C, ad esempio Dectin-1, Dectin-2 e MINCLE6. Queste vie si basano sui recettori contenenti motivi (orlo) ITAM (ad es., Dectin-1) o ITAM contenenti motivi Co-recettori (ad es., FcRγ, per Dectin-2 e MINCLE) che reclutano ed attivano la chinasi SYK (Figura 1). Questo porta all'attivazione di una proteina chi...

MALT1 regola dell'immunità innata, ma come in questo caso rimane mal definita. Abbiamo usato l'inibitore selettivo della paracaspase MALT1 MLT-827 per svelare il contributo di MALT1 alla innata di segnalazione a valle dei Toll-like o C-tipo il lectin-like receptors, dimostrando che MALT1 regola la produzione di citochine mieloide e a valle dei recettori di tipo C il lectin-like, in modo selettivo.

Mieloide innata Signaling Pathway regolamento da MALT1 Paracaspase attività

Besides its function in lymphoid cells, which has been addressed by numerous studies, the paracaspase MALT1 also plays an important role in innate cells ...

Quindi lo scopo del metodo nel nostro manoscritto è quello di fornire un'analisi comparativa delle vie di segnalazione nelle cellule mieloidi usando sistemi umani e topi. Aiuta a definire quale via di segnalazione è coinvolta a valle dei recettori di riconoscimento dei modelli selezionati. Quindi questo metodo è semplice da implementare.Si basa su preparati cellulari primari e composti di riferimento convalidati, che è essenziale per la spiegazione dei meccanismi di segnalazione. A dimostrare la procedura saranno Ratiba Touil e Adeline Unterreiner, rispettivamente scienziata e ricercatrice associata nel nostro gruppo. In un cappuccio di flusso laminare impostare un paio sterile di forbici, un becher da un litro e un sacchetto di plastica.Posizionare il mantello buffy precedentemente ottenuto nel becher e utilizzare le forbici per aprirlo con cura. Utilizzando una pipetta da 25 mm aggiungere 100 ml di PBS integrato con 2 millimolare di EDTA. Mescolare pipettando lentamente su e giù.Quindi trasferire 25 ml del rivestimento di buffy diluito in sei tubi di centrifuga conica da 50 ml che sono stati precompilato ciascuno con 15 ml di gradiente di densità a base di polisaccaride. Centrifugare i tubi per 20 minuti a 800 g con accelerazione moderata senza rottura per consentire la separazione delle cellule in base alla loro densità. Dopo la centrifugazione saranno visibili tre strati, un pellet contenente globuli rossi e granulociti, uno strato superiore fatto di plasma e un anello bianco contenente cellule mononucleari del sangue periferico.Utilizzare una pipetta da 10 ml per raccogliere gli anelli PBMC e trasferirli in un nuovo tubo da 50 ml. Ricaricare con PBS ed EDTA. Eseguire tre lavaggi successivi con tempo e velocità di centrifugazione decrescente, come indicato nel protocollo di testo.Dopo il lavaggio finale, resospendare il pellet in 25 ml di tampone di lysis freddo ghiacciato per lizzare i globuli rossi da pressione osmotica. Incubare la soluzione a temperatura ambiente fino a quando non diventa chiara. Quindi aggiungere 25 ml di tampone di separazione per interrompere la reazione.Centrifugare a 150 g per otto minuti per lavare la soluzione. Versare il supernatante e rimescolare il pellet con tampone di separazione. Dopo aver contato le cellule, diluirle in un mezzo di coltura fino a 12.500 cellule per pozzo.Distribuire 30 ml di questa sospensione cellulare in ogni pondo di una piastra di pozzo 384. Aggiungere quindi 15 microlitri di soluzioni composte quattro volte concentrate ad ogni pozzo e preincubare la piastra a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica per un'ora. Se lo si desidera, aggiungere LPS alla concentrazione finale di 1 ng per ml o Zymosan impoverito a una concentrazione finale di 100 mcg per ml.Quindi incubare la piastra durante la notte a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica. Il giorno dopo prendi 10 microlitri del supernatante per misurare i livelli alfa TNF secreti. Per iniziare la diluizione seriale, diluire la soluzione stock MLT-827 con mezzo per raggiungere una concentrazione di 8 micromolari in una volta sola.Eseguire una diluizione seriale 1:5 in sei passaggio utilizzando un supporto con DMSO dello 0,08%. Per prepararsi per test a dose singola, diluire le soluzioni MLT-827, AFN700 e composto 11 stock con mezzo per raggiungere una concentrazione di 4 micromolari in una volta sola. In primo luogo, aggiungere 2 ml di acqua sterile endotossina-free a 10 mg di Zymosan impoverito.Vortice questa soluzione stock per omogeneizzarlo. Aliquota la soluzione e quindi memorizzare le aliquote a 20 gradi Celsius. In questo studio i PBPC umani e le cellule di milza del topo sono stimolati con Zymosan impoverito, un agonista di Dectin-1, o lipopolisaccaride, un agonista TL4.Il rilascio alfa NTNF nel supernatante viene misurato dopo 20 ore. Sia nel saggio umano che in quello del topo il composto MLT-827 blocca selettivamente la produzione alfa di TNF guidata dalla via Dectin-1 ma non dalla via TLR4. Nei monociti stimolati con LPS, la produzione di TNF alpha è quasi completamente abrogata da AFN700 ma non è sensibile al Cpd11, che è coerente con la dipendenza del percorso TLR4 dall'attività NF-kappa B e la sua indipendenza dall'attività SIC.Al contrario, la produzione alfa TNF guidata da Dectin-1 e MODC mostra sensibilità a MLT-827, AFN700 e Cpd11. Ciò fornisce ulteriori prove del coinvolgimento di una cascata di segnalazione CBM SIC nel percorso Dectin-1. Anche la produzione di IL-1 beta, IL-6 e IL-23 è sensibile ai tre inibitori, indicando meccanismi regolatori simili al TNF alpha.Tuttavia, l'effetto limitato visto sulla produzione di IL-8 suggerisce che questa citochina ha un meccanismo regolatore distinto. L'aumento delle concentrazioni di trehalose-dibehenate superiori a 50 mcg per ml porta alla produzione di TNF alpha, IL-6 e IL-1 beta, che si basavano sull'attività della paracaspasi MALT1 secondo l'effetto di blocco dell'MLT-827. Risultati simili sono stati osservati quando si sfidano i CLC con concentrazioni crescenti di Zymosan impoverito per stimolare il dectin-1.Questo metodo ha permesso di dimostrare che la paracaspasi MALT1 regola selettivamente la segnalazione del recettore simile alla lettarina di tipo C. È essenziale utilizzare composti di riferimento ben caratterizzati. Prestare attenzione alla procedura per la diluizione delle soluzioni stock.Questo è fondamentale per il composto con solubilità limitata.

myeloid-innate-signaling-pathway-regulation-malt1-paracaspase

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Mieloide innata Signaling Pathway regolamento da MALT1 Paracaspase attività

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