Lo studio di proteine importazione in cloroplasti utilizzando protoplasti
December 10th, 2018
Qui descriviamo un protocollo per esprimere proteine in protoplasti utilizzando il metodo di trasformazione PEG-mediata. Il metodo fornisce facile espressione di proteine di interesse e di indagine efficiente di localizzazione della proteina e il processo di importazione per varie condizioni sperimentali in vivo.
Questo mistero può aiutare a rispondere ad alcune domande nel campo della biologia cellulare come l'input proteico nei cloroplasti. Il vantaggio principale di questa tecnologia è che l'apporto proteico nei cloroplasti può essere studiato in condizioni en vivo. A dimostrare la procedura saranno Junho Lee e Hyangju Kang, due post out dal mio laboratorio.
Per iniziare, raccogli tessuti fogliari intatti da piante vecchie di due settimane da uno a due piatti B5. Utilizzare un coltello chirurgico per raccogliere le foglie e posizionarle in un tubo conico da 50 millilitri contenente 25 millilitri di soluzione enzimatica. Posizionare il tubo orizzontalmente su uno shaker rotante e incubare con delicata agitazione a 22 gradi Celsius al buio per otto-12 ore fino a quando nella soluzione rimangono solo piioli e steli.
Dopo aver completato l'incubazione, filtrare la soluzione enzimatica contenente protoplasti rilasciati attraverso una rete di dimensioni dei pori da 140 micrometri in una piastra di Petri fresca. Quindi stratalizza con cura la soluzione sopra 15 millilitri di soluzione di saccarosio al 21% in un tubo conico da 50 millilitri. Centrifugare il tubo in un rotore a benna oscillante a 98 g per 10 minuti con le impostazioni di accelerazione e decelerazione più basse.
Successivamente, utilizzare la pipetta di patura per rimuovere accuratamente i protoplasti dallo strato superiore contenente soluzione enzimatica e dall'interfaccia tra la soluzione di enzimi e la soluzione di saccarosio. Trasferire questa soluzione in un tubo conico da 50 millilitri contenente 30 millilitri di soluzione W5 e invertire il tubo per mescolare. Centrifugare il tubo a 51 g per sei minuti.
Utilizzare una pipetta per scartare attentamente questo supernatante senza disturbare i protoplasti nel pellet. Aggiungere 25 millilitri di soluzione W5 e sospendere delicatamente i protoplasti. Per la stabilizzazione, incubare in un frigorifero di quattro Celsius per un minimo di un'ora.
Dopo quattro gradi Celsius di incubazione, pellet i protoplasti completamente centrifugandoli a 46 g per due minuti. Rimuovere con cura il supernatore completamente e aggiungere la soluzione MANG al pellet di protoplasto per ottenere cinque volte dieci a sei per millilitro. Utilizzare una pipetta per aggiungere 10 microgrammi del DNA plasmatico e 300 microlitri di soluzione di protoplasto a un tubo dal fondo rotondo fresco da 13 millilitri.
Mescolare ruotando delicatamente i tubi a mano e quindi aggiungere immediatamente 300 microlitri di soluzione 40%PEG preparata al momento. Mescolare completamente inclinando il tubo quasi orizzontalmente e ruotandolo dolcemente più volte a mano. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
Quindi aggiungere un millilitro di soluzione W5 e mescolare completamente ruotando delicatamente il tubo a mano come in precedenza. Incubare il campione per 10 minuti a temperatura ambiente. Ripetere altre due volte aggiungendo prima 1,5 millilitri e poi due millilitri di W5 e dopo l'aggiunta finale e la miscelazione, incubare per 30 minuti.
Centrifugare il tubo a 46 g per quattro minuti e quindi scartare il supernatante. Aggiungere due millilitri di soluzione W5 al pellet e mescolare delicatamente, ma completamente, allo stesso modo di prima. Incubare a 22 gradi Celsius in una camera scura per 18 ore.
Per analizzare l'importazione di proteine utilizzando la microscopia a florescence, utilizzare una pipetta con una punta tagliata per posizionare 10 microlitri della soluzione di protoplasto su uno scivolo di vetro. Utilizzare una lapsus per coprire attentamente la soluzione per evitare di danneggiare i protoplasti. Posizionare lo scivolo sul palco di un microscopio a fluorescenza con un filtro di ammissione all'eccitazione impostato per osservare la proteina fluorescente verde e l'autofluorescenza della clorofilla.
Utilizza una fotocamera del dispositivo di coppia di carica raffreddata per acquisire immagini ed elaborarle utilizzando un software di editing immaginato per produrre immagini pseudocolori. Per l'estrazione totale di proteine e l'immunoblotting, rimuovere un millilitro dalla soluzione di protoplasto e mescolare il restante millilitro. Trasferire questa soluzione di protoplasto in un tubo di centrifuga e centrifugare a 46 g per quattro minuti.
Rimuovere il supernatante dopo aver completato la centrifugazione e aggiungere 80 microlitri di tampone di denaturazione. Vortice con vigore per cinque secondi. Aggiungere cinque tamponi campione XDS, mescolare bene e far bollire per 10 minuti alla denaturazione.
Procedere con la pagina STS standard e l'immunoblotting con anticorpo anti-GFP. RbcS e TGFT, un costrutto di fusione che codifica per i 79 residui terminali di amminoacidi terminali di RBCS contenenti il peptide di transito fuso alla GFP, è stato utilizzato per studiare l'importazione di proteine nei cloroplasti mediante microscopia a florescence e immunoblotting. Se esaminati dalla microscopia a florescence, i segnali fluorescenti verdi della proteina bersaglio si sono fusi con i segnali fluorescenti rossi dell'autoflorescenza della clorofilla che indicano l'importazione di proteine nei cloroplasti.
Dopo aver isolato la proteina totale, due bande proteiche sono osservate nell'immunoblot, dimostrando che una proteina è stata correttamente importata nei cloroplasti. La banda superiore corrisponde al precursore di tutta la lunghezza e alla banda inferiore alla forma lavorata dopo l'importazione in cloroplasti. La quantità della forma trasformata della proteina è aumentata in modo dipendente dal tempo, suggerendo che la proteina viene importata in cloroplasti.
In questo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della biologia cellulare per esplorare il stancante proteico o la raccolta del filo di membrana in Arabidopsis.
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Panoramica
Questo articolo descrive un metodo di trasformazione mediato da PEG per esprimere proteine nei protoplasti, permettendo lo studio dei processi di localizzazione e importazione delle proteine in vivo. Il protocollo è dimostrato da Junho Lee e Hyangju Kang, fornendo approfondimenti sull'input di proteine nei cloroplasti.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Biologia cellulare
- Biologia vegetale
- Espressione proteica
Sfondo
- Comprendere la localizzazione delle proteine è cruciale nella biologia cellulare.
- I cloroplasti svolgono un ruolo significativo nel metabolismo delle piante.
- Studiare i processi di importazione delle proteine può migliorare la nostra conoscenza delle funzioni cellulari.
- La trasformazione mediata da PEG è una tecnica ampiamente utilizzata per i protoplasti.
Obiettivo dello studio
- Fornire un protocollo per l'espressione delle proteine nei protoplasti.
- Indagare la localizzazione delle proteine in condizioni in vivo.
- Facilitare la ricerca sui processi di importazione delle proteine nei cloroplasti.
Metodi utilizzati
- Raccolta di tessuti fogliari intatti da piante di due settimane.
- Uso di un coltello chirurgico per preparare i campioni fogliari.
- Incubazione dei tessuti fogliari in una soluzione enzimatica per l'isolamento dei protoplasti.
- Impiego della trasformazione mediata da PEG per l'espressione delle proteine.
Risultati principali
- Espressione di successo delle proteine nei protoplasti.
- Indagine efficiente della localizzazione delle proteine.
- Dimostrazione del protocollo da parte di ricercatori addestrati.
- Approfondimenti sul processo di importazione delle proteine nei cloroplasti.
Conclusioni
- Il metodo di trasformazione mediato da PEG è efficace per l'espressione delle proteine.
- Questo approccio permette lo studio della dinamica delle proteine in vivo.
- Ulteriori ricerche possono approfondire le implicazioni dell'importazione delle proteine nei cloroplasti.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Understanding protein import mechanisms into chloroplasts provides foundational insights for target validation in plant-based bioproduction systems. This protoplast-based assay enables mechanistic de-risking of nuclear-encoded protein trafficking pathways, supporting predictive confidence in chloroplast engineering for therapeutic protein expression. The method offers a disease-relevant system for evaluating targeting signal functionality and import efficiency under near-physiological conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates chloroplast targeting signal functionality and import kinetics for nuclear-encoded proteins.
- Operational Value: Enables rapid assessment of protein localization using fluorescence microscopy and immunoblotting readouts.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing of transit peptide efficacy and import machinery engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative immunoblot data showing precursor-to-processed protein conversion over time.
- Operational Value: Provides a reproducible protoplast isolation and transfection workflow using PEG-mediated transformation.
- Assay Readiness: Delivers dual-readout capability (fluorescence and immunoblot) for import validation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage targeting signal analysis to preclinical evaluation of chloroplast-expressed biologics.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed protein accumulation results from proper import versus cytosolic aggregation.
- Predictive Confidence: Time-dependent increase in processed protein band correlates with functional import progression.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where target validation precedes lead identification, particularly for chloroplast-directed expression systems. It supports screening campaigns by providing import-competent biological systems ready for effector protein testing. Analytics derived from the assay include fluorescence co-localization metrics and immunoblot-based quantification of import efficiency.
- Discovery Biology: Tests whether candidate proteins achieve proper subcellular localization via endogenous import pathways.
- Screening: Delivers standardized protoplast preparations suitable for high-content localization screening.
- Analytics: Enables quantification of import kinetics through precursor/product band ratios in immunoblots.
- Translational Research: Informs construct design for chloroplast expression vectors by validating transit peptide functionality.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating multiple targeting signals across protein therapeutics candidates.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in protein targeting hypotheses through direct visualization of import.
- Operational Value: Delivers a standardized, scalable protoplast isolation protocol with defined centrifugation and resuspension steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for chloroplast expression constructs by confirming import competence.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targeting sequences based on empirical import data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant protoplast isolation, PEG-mediated transfection, and fluorescence microscopy.
- Dependent on enzymatic tissue digestion equipment, sucrose gradient centrifugation, and PEG solution preparation.
- Necessitates standardization of protoplast density (5×10⁶/mL) and DNA input (10 µg) for reproducible expression.
- Involves adaptation considerations when extending to non-Arabidopsis species or alternative chloroplast transformation systems.
- Practical limitations include protoplast viability window post-isolation and sensitivity to osmotic stress during PEG incubation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:33
Protoplast Isolation
2:19
Protoplast Transformation using Polyethylene Glycol
3:53
Analysis of the Protein Import into Chloroplasts
5:10
Results: Fluorescence Microscopy and Immunoblotting to Analyze the Import of Proteins into Chloroplasts
6:07
Conclusion
