Name: Generazione di nanoliposomi cationici per la consegna efficiente In Vitro di trascritti di RNA messaggero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Scopri come generare nanoliposomi cationici con il metodo del film secco per la consegna efficiente di mRNA terapeutico. Questa tecnica aumenta l'espressione proteica senza compromettere la vitalità cellulare.

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1. generazione di nanoliposomi cationici (Figura 1)
<ol><li>Sciogliere i lipidi DC-colesterolo (3beta - cloridrato di colesterolo [N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoil]) e DOPE (dioleoyl phosphatidylethanolamine), consegnato sotto forma di polvere, in cloroformio per ottenere una concentrazione finale di 25 mg/mL. Nota: Conservare i lipidi disciolti a-20 ° C.</li>
	<li>Lavorare con 25 mg/mL di soluzione madre di entrambi i lipidi. Mix 40 µ l del disciolto DC-colesterolo e 80 µ l di the DOPE disciolto in un fiasco di vetro. Nota: La quantità totale di lipidi è di 3 mg. Per evitare la rapida evaporazione del cloroformio, mettere i lipidi sul ghiaccio durante il pipettaggio.</li>
	<li>Vaporizzare il cloroformio per 15 min sotto un flusso di gas argon. Successivamente, riempire un essiccatore con gel di silice, posizionare la boccetta di vetro aperto all'interno e applicare un vuoto durante la notte per assicurarsi che il cloroformio restante è evaporato, e un film lipidico è formato all'interno la boccetta di vetro. Nota: Lavorare velocemente ed evitare inutili O2 contatti.</li>
	<li>Reidratare il film lipidico formata con 1 mL di acqua priva di nucleasi e vortice la sospensione per 15 min (Figura 2A). In seguito, inserire la sospensione in un bagno di sonicazione per 1 h (Figura 2B). Nota: La sospensione sarà leggermente torbida.</li>
	<li>Assemblare il mini estrusore secondo le istruzioni del produttore, riempire una siringa con la sospensione del lipido e posizionare la siringa riempita e una siringa vuota su entrambi i lati dell'estrusore. Premere la sospensione dei lipidi attraverso la membrana da una siringa a altra, 20 x – x 25, per estrudere la sospensione (Figura 2). Nota: La dimensione del NLps è determinata dalle dimensioni dei pori della membrana utilizzata.</li>
	<li>Memorizzare il NLps in un fiasco di vetro a 4 ° C fino all'utilizzo ulteriore. Nota: Dopo il tempo di conservazione prolungata, la NLps devono essere messi nel bagno di sonicazione ancora per 15 min da 35 kHz a eludere la formazione del complesso.</li>
</ol>2. in Vitro trascrizione del mRNA sintetico
<ol><li>Preparare la codifica di eGFP mRNA seguendo il protocollo pubblicato precedenti34.</li>
	<li>Amplificare la sequenza di eGFP dal plasmide con 0,7 µM di andata (5'-TTG GAC CCT CGT ACA GAA GCT AAT ACG-3') e inversa (5'-T120 CTT CTT ACT CAG GCT TTA TTC AAA GAC CA-3') primer e la polimerasi kit con PCR.<ol>
<li>Mescolare 20 µ l di una soluzione tampone commerciale che cambia il comportamento in fusione del DNA (Tabella materiali), così come 20 µ l della miscela 5x dal kit della polimerasi. 7 µ l di ciascun primer (avanti e indietro).</li>
		<li>Aggiungere 25 ng di plasmide eGFP per la miscela e 2 µ l di polimerasi dal kit della polimerasi. Nota: Tenere la polimerasi sul ghiaccio prima di pipettaggio esso alla soluzione.</li>
		<li>Aggiungere privo di nucleasi H2O alla miscela, fino ad un volume di 100 µ l.</li>
		<li>Eseguire i cicli PCR in thermocycler seguendo il protocollo nella tabella 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purificare la sequenza di DNA codifica eGFP con il kit di purificazione di PCR.<ol>
<li>Pertanto, miscelare la soluzione PCR con 500 µ l di tampone di associazione dal kit e si usa per riempire le colonne di purificazione.</li>
		<li>Centrifugare le colonne alla massima velocità per 1 minuto e scartare il filtrato.</li>
		<li>Aggiungere 750 µ l di tampone di lavaggio ho alla colonna, centrifuga nuovamente alla massima velocità per 1 min e scartare il filtrato.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 1 x per rimuovere il buffer dal filtro colonna di centrifuga.</li>
		<li>Trasferire la colonna in una nuova provetta da 1,5 mL.</li>
		<li>Aggiungere 20 µ l di nucleasi-free H2O alla colonna, incubare per 1 min e centrifugare per 1 min alla massima velocità. Ripetere questo passaggio.</li>
		<li>Misurare la concentrazione del DNA con un fotometro e conservare a-20 ° C.</li>
		<li>Eseguire le analisi di qualità del DNA usando elettroforesi del gel. Aggiungere 0,5 g di agarosio in tampone Tris-Borato-EDTA (TBE) e scaldarla nel forno a microonde a fuoco alto fino a quando l'agarosio è completamente sciolto.</li>
		<li>Aggiungere 5 µ l di soluzione di macchiatura del gel di agarosio liquido, riempire la soluzione nella camera di gel e attendere fino a quando il gel viene polimerizzato.</li>
		<li>Mix 200 ng di DNA con 2 µ l di 6x loading dye e riempirlo fino ad un volume finale di 12 µ l. Dispensare una scaletta del DNA, così come il campione di DNA, nei pozzetti gel ed eseguire l'elettroforesi per 1 h a 100 V.</li>
		<li>Analizzare il gel utilizzando una stazione di analisi dei gel ai raggi UV.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire la trascrizione in vitro per generare mRNA dalla sequenza del DNA con un kit in vitro trascrizione contenente polimerasi T7 e sostituire i nucleotidi modificati di UTP e CTP con Ψ-UTP e metil-CTP.<ol>
<li>Per la trascrizione in vitro , mescolare gli ingredienti seguendo la tabella 2. Nota: Sostituire 1,5 µ l di metil-CTP con 01:10 Cy3-CTP diluito in privo di nucleasi H2O durante la trascrizione in vitro di eGFP mRNA per raggiungere Cy3-etichettatura del mRNA.</li>
		<li>Incubare il mix di reazione IVT per 4 h a 37 ° C.</li>
		<li>Aggiungere 1 µ l di dnasi I dalla polimerasi T7 kit e incubare per 15 min da 37 ° C per digerire il modello di DNA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per purificare il mRNA, utilizzare il kit di pulizia del RNA.<ol>
<li>Riempire il mix IVT al volume di 100 µ l con nucleasi-free H2O.</li>
		<li>Aggiungere 350 µ l di tampone di lisi e mescolare pipettando su e giù.</li>
		<li>Aggiungere 250 µ l di etanolo al 100% e mescolare ancora. Dispensare il mix in colonne di purificazione.</li>
		<li>Centrifuga per 15 s a 8.000 x g e scartare il filtrato.</li>
		<li>Aggiungere 500 µ l di tampone di lavaggio in una colonna, centrifugare nuovamente per 15 s a 8.000 x ge Rimuovi il filtrato.</li>
		<li>Lavare la colonna 1 x con 500 µ l di tampone di lavaggio e centrifuga per 2 min a 8.000 x g.</li>
		<li>Spostare la colonna in una provetta di reazione fresco di 1,5 mL. Eluire il mRNA di 2 x di un'incubazione di 1-min di 20 µ l di nucleasi-free H2O sulla membrana colonna, seguita da una centrifugazione di 1 min a velocità massima.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rimuovere i gruppi fosfato da mRNA utilizzando un kit di defosforilazione. Aggiungere 4,5 µ l di tampone di fosfatasi x 10 e 1 µ l di fosfatasi mRNA e incubare per 1h a 37 ° C.</li>
	<li>Purificare il mRNA nuovamente, seguendo passi 2.5.1 - 2.5.7.</li>
	<li>Misurare la concertazione di mRNA con un fotometro.</li>
	<li>Utilizzare l'elettroforesi del gel per analizzare la purezza e la dimensione del mRNA. Pertanto, preparare un gel di agarosio come descritto nei passaggi 2.3.9 - 2.3.10.<ol>
<li>Mix 3.3 µ l di formamide, 1 µ l di formaldeide al 37%, 1 µ l di 10 x-MEN e 1,7 µ l di 6x loading dye con 200 ng di mRNA e riempirlo fino a 10 µ l con nucleasi-free H2O per ogni campione e indicatore di RNA.</li>
		<li>Incubare il mix per 10 min a 65 ° C per denaturazione di mRNA. Caricare i pozzetti del gel con il mRNA e RNA marker ed eseguire il gel per 1 h a 100 V.</li>
		<li>Analizzare il gel utilizzando una stazione di doc gel con luce UV.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. effetti di complessazione di mRNA sintetico
<ol><li>Scongelare il mRNA sintetico sul ghiaccio, vortice e centrifuga poco prima dell'apertura del tubo.</li>
	<li>Mix 10 µ l di mRNA sintetico (concentrazione di mRNA è 100 ng / µ l) con 1 µ l, 2,5 µ l, 5 µ l, 10 µ l o 20 µ l di sospensione di PNL (NLp concentrazione è di 3 mg/mL). Centrifugare brevemente e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente (TA) per la formazione di nanolipoplex. Nota: Non mescolare pipettando. Questo può portare alla perdita di volume. Vortice poco per un'accurata miscelazione.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di medium cellulare regolare per la nanolipoplexes e mescolare pipettando su e giù.</li>
</ol>4. analisi dell'efficienza di incapsulamento di nanoliposomi
<ol><li>Per eseguire gli esperimenti di incapsulamento, utilizzare il kit di quantificazione di RNA.</li>
	<li>Preparare la soluzione di lavoro diluendo la tintura fluorescente 1: 200 per una gamma alta e 1:2,000 per un'analisi di gamma bassa. Nota: Scongelare il colorante fluorescente sul ghiaccio. Preparare la soluzione di lavoro direttamente prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare le curve standard alta gamma e gamma bassa con 1 mL di una soluzione madre di 2 µ g/mL di eGFP mRNA in nucleasi-free H2O. Nota: Per le curve standard, utilizzare il mRNA che verrà utilizzato negli esperimenti incapsulamento.</li>
	<li>Utilizzare la tabella 3 per la preparazione di standard di alta gamma (20 ng/mL - 1 µ g/mL).</li>
	<li>Per gli standard di gamma bassa, diluire il 2 µ g/mL eGFP mRNA soluzione stock 01:20 per ottenere una concentrazione finale di 100 ng/mL. Preparare uno standard di gamma bassa (1 ng/mL - 50 ng/mL) come descritto nella tabella 4.</li>
	<li>Unire 1 µ g di eGFP mRNA (10 µ l) e 7,5 µ g di NLps (2,5 µ l) e incubare per 20 minuti a TA. Nota: Tenere il mRNA sul ghiaccio per evitare un peggioramento.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di nucleasi-free H2O a forma nanolipoplexes e mescolare pipettando su e giù.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di soluzione di lavoro di tintura fluorescente RNA da 1: 200 o 1:2,000 agli standard ed i campioni incapsulati e incubare per 5 min a RT nel buio.</li>
	<li>Pipettare gli standard e i campioni in duplicato in una piastra a 96 pozzetti nera e misurare la fluorescenza a 530 nm su un lettore di micropiastre (Figura 3).</li>
</ol>5. preparazione delle cellule per la transfezione
<ol><li>Piastra a 1,5 x 105 A549 cellule/pozzetto di una piastra 12-pozzetti 1 d prima della transfezione.</li>
	<li>Incubare le cellule a 37 ° C e 5% di CO2 nel medium di cellule normali (DMEM/alto glucosio con 10% siero bovino fetale [FB], 2 mM L-Glutammina, 1% di penicillina/streptomicina) per 24 h prima di transfezione.</li>
</ol>6. transfezione delle cellule
<ol><li>Lavare il preparato cellule 1x con 1 mL/pozzetto PBS (senza Ca2 +Mg2 +).</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di miscela di preparati nanolipoplex, contenente 1 µ g di eGFP che mRNA incapsulato in 1-µ l, 2.5-µ l, 5-µ l, 10-µ l o NLps 20-µ l, in un pozzetto della piastra preparato con cellule A549.</li>
	<li>Aggiungere la sospensione di nanolipoplex per le cellule e incubare a normali condizioni per 24 h analizzare l'efficacia di transfezione, o per 24 h e 72 h per analizzare l'attuabilità delle cellule dopo la trasfezione. Nota: Transfezione con NLps non richiede un cambiamento medio.</li>
</ol>7. analisi dell'efficacia di transfezione delle cellule tramite citofluorimetria e microscopia a fluorescenza
<ol><li>Eliminare il surnatante e lavare le cellule con 1 mL/bene PBS (senza Ca2 +/Mg2 +) per rimuovere il NLps restante.</li>
	<li>Preparare le celle per citometria a flusso.<ol>
<li>Tripsinizzano le cellule con 500 µ l/pozzetto tripsina/EDTA (0,05%) a 37 ° C per 3 min Stop il processo e inattivare la tripsina aggiungendo la stessa quantità (500 µ l/pozzetto) di regolare mezzo FBS-contenente.</li>
		<li>Centrifugare le cellule per 5 min a 400 x g e rimuovere con cautela il supernatante senza toccare il pellet cellulare.</li>
		<li>Lavare le cellule con 1 mL di PBS (senza Ca2 +Mg2 +).</li>
		<li>Risospendere le cellule in 300 µ l di soluzione 1x fissazione e trasferire le cellule in tubi di citometria a flusso.</li>
		<li>Analizzare le cellule a 488 nm in un citometro a flusso (Figura 4A). Nota: Vortex le cellule 1 x direttamente prima della misurazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare le celle per microscopia di fluorescenza.<ol>
<li>Fissare le cellule con 1 mL/pozzetto 100% metanolo, che è stato precedentemente conservato a-20 ° C.</li>
		<li>Aggiungere 500 µ l/pozzetto 300 nM DAPI (4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole) disciolto in PBS (senza Ca2 +/Mg2 +) e incubare per 5 minuti al buio.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione DAPI e lavare le cellule ancora con 100% di metanolo conservati a-20 ° C.</li>
		<li>Analizzare le celle utilizzando un microscopio a fluorescenza (Figura 4B). Nota: Utilizzare le seguenti lunghezze d'onda di eccitazione/emissione: eGFP 488/509 nm, DAPI 358/461 nm e Cy3 550/570 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. cellule
<ol><li>Sciogliere 5 mg di MTT (bromuro di 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium) in 1 mL di RPMI (senza rosso fenolo). Nota: Il MTT disciolto deve essere ulteriormente diluito 01:10 (concentrazione finale: 0,5 mg/mL) in RPMI prima dell'uso.</li>
	<li>Lavare le cellule trasfettate 3 x con 1 mL/pozzetto PBS (senza Ca2 +/Mg2). Nota: I resti del mezzo cellula normale devono essere completamente rimosso.</li>
	<li>Aggiungere 500 µ l/pozzetto di 01:10 diluito soluzione MTT alle cellule e incubare per 4 h a 37 ° C.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione MTT dalle cellule dopo incubazione e aggiungere 500 µ l/pozzetto DMSO (dimetilsolfossido). Incubare nuovamente per 10 min a 37 ° C.</li>
	<li>Dispensare la soluzione di DMSO in terzine in una piastra a 96 pozzetti fondo chiaro e misurare l'assorbimento a 540 nm utilizzando un lettore di micropiastre.</li>
	<li>Impostare la vitalità della cellula non trattata al 100% e calcolare l'attuabilità delle cellule degli altri gruppi rispetto alle cellule non trattate di controllo (Figura 5).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il protocollo presentato descrive la generazione di NLps con efficacia elevata incapsulamento per mRNA sinteticamente modificate, così come la transfezione affidabile di cellule in vitro. Il NLps, inoltre, garantiscono il rilascio di mRNA, che a sua volta, si traduce in una proteina funzionale all'interno delle cellule. Inoltre, le transfezioni utilizzando NLps possono essere eseguite a mezzo cellulare regolare, conseguente alta cella viabilità durante transfezione e durare fino a tre giorni dopo la trasfezione....

L'uso di mRNA modificate per applicazioni terapeutiche ha dimostrato grandi potenzialità nell'ultimo paio di anni. Nelle malattie cardiovascolari, infiammatorie e monogenetica, così come lo sviluppo di vaccini, mRNA è un agente terapeutico promettente1.
Terapia sostitutiva della proteina con mRNA offre diversi vantaggi rispetto alla terapia genica classica, che si basa sulla transfezione del DNA nelle cellule bersaglio2. La funzione di mRNA avvia direttamente nel citosol. Anche se il plasmide DNA (pDNA), un costrutto di double-stranded, circolare DNA che contiene una regione di promotore e una sequenza del gene che codifica la proteina terapeutica3, anche atti nel citosol, può solo essere incorporata nelle cellule che stanno attraversando la mitosi al momento della trasfezione. Questo riduce il numero delle cellule transfettate in tessuto1,4. In particolare, la transfezione di tessuti con attività debole mitosi, come cellule cardiache, è difficile5. A differenza di pDNA, la transfezione e la traduzione di mRNA si verificano nelle cellule mitotiche e non-mitotica in tessuto1,6. L'integrazione virale del DNA nel genoma ospite può venire con effetti mutageni o reazioni immunitarie7,8, ma dopo la trasfezione di cellule con una codifica della proteina mRNA, la sintesi de novo della proteina voluta inizia in modo autonomo9,10. Inoltre, la sintesi delle proteine può essere regolata precisamente alla necessità del paziente attraverso dosi individuali, senza interferire con il genoma e rischiare gli effetti mutageni11. Il potenziale d'attivazione immunitaria del mRNA sinteticamente generato potrebbe essere drasticamente abbassato utilizzando pseudo-uridina e 5'-methylcytidine invece di uridina e citidina12. Pseudo-uridina modificate mRNA inoltre è stato indicato per avere una maggiore stabilità biologica e una significativamente più alta capacità traslazionale13.
Per poter beneficiare delle proprietà promettenti di terapia a base di mRNA in applicazioni cliniche, è essenziale per creare un veicolo adatto per il trasporto del mRNA nella cellula. Questo veicolo dovrebbe sopportare non tossico proprietà in vitro e in vivo, proteggere il mRNA contro nucleasi-degradazione e fornire sufficiente assorbimento cellulare per una disponibilità prolungata e la traduzione del mRNA14.
Tra tutti i tipi di vettore possibile per in vivo somministrazione di farmaci, quali nanotubi di carbonio, punti quantici e liposomi, quest'ultimo è stati studiati più di15,16. I liposomi sono vescicole costituito da un doppio strato di lipidi10. Sono anfifiliche con un idrofobo e una sezione idrofila, e attraverso l'auto-organizzazione di queste molecole, un doppio strato sferico è formata17. All'interno di liposomi, agenti terapeutici o farmaci possono essere incapsulati e, così, protetti dalla degradazione enzimatica18. Liposomi contenenti N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium cloruro (DOTMA)19, [1,2-bis (oleoyloxy) -3-(trimethylammonio) propano] (DOTAP)20e dioctadecylamidoglycylspermine (cani)21, o DC-colesterolo22, sono ben caratterizzati e frequentemente utilizzati per la transfezione cellulare con DNA o RNA.
Liposomi cationici comprendono un caricato positiva del lipido e un fosfolipide uncharged23. Transfezione tramite liposomi cationici è uno dei metodi più comuni per il trasporto di acidi nucleici in cellule24,25. Le particelle di lipide cationico formano complessi con i gruppi fosfato negativamente caricato nella spina dorsale di molecole di acido nucleico26. Questi cosiddetti lipoplessi attaccare alla superficie della membrana cellulare ed entrano nella cellula tramite endocitosi o meccanismi di endocitosi-come27.
Nel 1989, Malone et al. descritto con successo mediata dei lipidi cationici mRNA transfezione28. Tuttavia, utilizzando una miscela di DOTMA e 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE), il gruppo ha trovato che DOTMA manifestato effetti citotossici28. Inoltre, Zohra et al hanno dimostrato che DOTAP (cloruro di 1,2-dioleoyloxy-3-trimetilammonio-propano) può essere utilizzato come un reagente di transfezione mRNA29. Tuttavia, per l'efficiente transfezione delle celle, DOTAP dovrebbe essere usato in combinazione con altri reagenti, come fibronectina29 o DOPE30. Finora, DOTMA era il primo lipide cationico sul mercato utilizzato per la consegna di gene31. Altri lipidi sono usate come supporto terapeutico o vengono testati in diverse fasi della sperimentazione clinica, (ad es., EndoTAG-I, contenente DOTAP come un elemento portante del lipido), è attualmente oggetto di indagine in un trial clinico di fase-II32.
Questo lavoro descrive un protocollo per la generazione di NLps contenente DC-colesterolo e DOPE. Questo metodo è facile da eseguire e permette la generazione di NLps di diverse dimensioni. L'obiettivo generale di generazione di NLp utilizzando il metodo a secco-pellicola è quello di creare liposomi per complessazione di mRNA, consentendo così efficiente e biocompatibile cellula trasfezione in vitro14,33.

<table><tbody><tr><td>(3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT)</td><td>AppliChem, Darmstadt, Germania</td><td>A2231</td><td></td></tr><tr><td>(3&beta;-[N-(N&prime;,N&prime;-dimetilamminoetano)-carbamoil]colesterolo cloridrato (DC-Colesterolo)</td><td>Avanti, Alabama, USA</td><td>700001</td><td></td></tr><tr><td>4&nbsp; &prime;,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germania</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>BD FACScan system</td><td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Fix (10x)</td><td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td><td>340181</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxid (DMSO)</td><td>Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germania</td><td>20385.02</td><td></td></tr><tr><td>Dioleoil fosfatidiletanolammina (DOPE)</td><td>Avanti, Alabama, USA</td><td>850725</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza</td><td>Zeiss Axio, Oberkochen, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germania</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Mini estrusore</td><td>Avanti, Alabama, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi</td><td>Qiagen, Hilden, Germania</td><td>129114</td><td></td></tr><tr><td>Opti-Mem</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germania</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>tampone PBS (senza Ca2+/Mg2+)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germania</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Kit di reagenti Quant-iT Ribo Green RNA</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germania</td><td>Q33140</td><td></td></tr><tr><td>RPMI (senza rosso fenolo)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germania</td><td>11835030</td><td></td></tr><tr><td>Gel di silice</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germania</td><td>P077</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA (0,05%)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germania</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Kit polimerasi HotStar HiFidelity</td><td>Qiagen, Hilden, Germania</td><td>202602</td><td></td></tr><tr><td>Kit di purificazione QIAquick PCR</td><td>Qiagen, Hilden, Germania</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td> Pseudouridina-5'-Trifosfato (&psi;-UTP)</td><td>TriLink Biotechnologies, San Diego, USA</td><td>N-1019</td><td></td></tr><tr><td>5-metilcitidina-5'-trifosfato (metil-CTP)</td><td>TriLink Biotechnologies, San Diego, USA</td><td>N-1014</td><td></td></tr><tr><td>Cianina 3-CTP</td><td>PerkinElmer, Baesweiler, Germania</td><td></td><td></td>NEL580001EA</tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen, Hilden, Germania</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Kit di trascrizione MEGAscript T7</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germania</td><td>AM1333</td><td></td></tr><tr><td>3&acute;-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Struttura analogica</td><td>New England Biolabs, Ipswich, USA</td><td>S1411L</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatasi antartica</td><td>Nuovo Inghilterra Biolabs, Ipswich, USA</td><td>M0289S</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germania</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biotium, Fremont, USA</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>peqGOLD DNA ladder mix</td><td>VWR, Pennsylvania, USA</td><td>25-2040</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder</td><td>Fisher Scientific, G&ouml; teborg, Svezia</td><td>11528766</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di nanoliposomi cationici per la consegna efficiente in vitro di trascritti di rna messaggero

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Lo sviluppo di RNA messaggero (mRNA)-base terapeutica per il trattamento di varie malattie diventa sempre più importante a causa del positivo proprietà in vitro di trascritti di mRNA (IVT). Con l'aiuto di IVT mRNA, la sintesi de novo di una proteina desiderata può essere indotta senza modificare lo stato fisiologico della cellula bersaglio. Inoltre, biosintesi della proteina può essere controllato proprio a causa dell'effetto transitorio di IVT mRNA.
Per l'efficiente transfezione delle celle, nanoliposomi (NLps) possono rappresentare un veicolo di consegna sicura ed efficiente per mRNA terapeutico. Questo studio descrive un protocollo per generare sicura ed efficiente cationici NLps costituito da DC-colesterolo e 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) come un vettore di consegna di IVT mRNA. NLps avendo una definita dimensione, una distribuzione omogenea e una capacità di complessazione alta e può essere prodotto utilizzando il metodo di film secco. Inoltre, presentiamo sistemi di prova differenti per analizzare loro complessazione ed efficacies di transfezione utilizzando sintetico enhanced proteina fluorescente verde (eGFP) mRNA, come pure il loro effetto sulla vitalità cellulare. Nel complesso, il protocollo presentato fornisce un approccio efficace e sicuro per complessazione di mRNA, che può progredire e migliorare l'amministrazione di mRNA terapeutico.

Utilizzando il protocollo come descritto, NLps consistente dei lipidi DC-colesterolo e DOPE sono state preparate utilizzando il metodo di film secco (Figura 1). Durante la preparazione, la soluzione di nanoliposome Mostra diverse fasi di torbidità (Figura 2).
L'efficacia di incapsulamento del NLps può quindi essere analizzato dopo l'incapsulamento di 1 µ g di mRNA codif...

Qui descriviamo un protocollo per la generazione di nanoliposomi cationici, che si basa sul metodo a secco-pellicola e possono essere utilizzato per la cassaforte e consegna efficiente in vitro di trascritti di RNA messaggero.

Generazione di nanoliposomi cationici per la consegna efficiente In Vitro di trascritti di RNA messaggero

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...

Questo protocollo consente la produzione di nanoliposomi sicuri ed efficienti che possono essere utilizzati come veicoli di trasfezione per l'RNA messaggero terapeutico. Questi nanoliposomi facilitano l'assorbimento di mRNA nelle cellule con conseguente aumento dei livelli di espressione proteica senza influire sulla vitalità cellulare. Il principale vantaggio di questa tecnica è la generazione rapida e facile di nanoliposomi stabili con dimensioni definite e distribuzione omogenea.Inoltre, proteggono l'mRNA incapsulato dalla degradazione e portano a una traduzione prolungata. A dimostrare la procedura sarà Antonia Link, dottoranda del nostro laboratorio. Per iniziare questa procedura, preparare soluzioni stock per lipidi, colesterolo DC e DOPE sciogliendo ciascuno in cloroformio ad una concentrazione finale di 25 milligrammi per millilitro.Mescolare 40 microlitri del colesterolo DC disciolto con 80 microlitri della DROGA disciolta in un pallone di vetro. Vaporizzare il cloroformio sotto un flusso di gas argon per 15 minuti. Quindi, riempire un essiccatore con gel di silice.Posizionare il pallone di vetro aperto all'interno e applicare un vuoto durante la notte per assicurarsi che il cloroformio rimanente sia evaporato. Il film lipidico risultante si formerà all'interno del pallone di vetro. Il giorno dopo, aggiungere un millilitro di acqua priva di nucleasi per reidratare il film lipidico.E vortice la sospensione per 15 minuti. Posizionare la sospensione in un bagno di sonicazione per un'ora. Successivamente, assemblare il mini estrusore secondo le istruzioni dei produttori.Riempire una siringa con la sospensione liquida e posizionarla su un lato dell'estrusore. Posizionare una siringa vuota sull'altro lato. Premere la sospensione lipidica attraverso la membrana da una siringa all'altra, circa 20-25 volte per estrudere la sospensione.Quindi, conservare i nanoliposomi in un pallone di vetro a quattro gradi Celsius fino a quando non sono pronti per l'uso. In primo luogo, scongelare l'mRNA sintetico sul ghiaccio. Vortice l'mRNA congelato e poi centrifugarlo poco prima di aprire il tubo.Quindi, mescolare un microgrammo dell'mRNA sintetico con varie quantità di sospensione nanoliposoma. Centrifugare brevemente e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti per la formazione di nanolipoplex. Quindi, aggiungere millilitro di mezzo cellulare regolare al nanolipoplex e mescolare pipettando su e giù.Preparare le cellule un giorno prima della trasfezione. Pertanto, placcare 150.000 celle A549 in ogni pozzo di una piastra di 12 po 'un giorno prima della trasfezione. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% e mezzo cellulare regolare per 24 ore.Quindi il giorno dopo, lavare ogni pozzo di cellule preparate una volta con un millilitro di PBS. Aggiungere un millilitro di una miscela di nanolipoplex preparata a uno dei pozzi contenenti le cellule A549. Incubare a condizioni regolari per 24 ore per analizzare l'efficienza di trasfezione o per 24-72 ore per analizzare la vitalità cellulare dopo la trasfezione.Rimuovere il supernatante e lavare ogni bene con un millilitro di PBS per rimuovere i restanti nanoliposomi. Per preparare le cellule per la citometria, aggiungere prima 500 microlitri di EDTA di tripina ad ogni pozzo e incubare a 37 gradi Celsius per tre minuti per tripinare le cellule. Quindi, aggiungere 500 microlitri di mezzo normale contenente FBS per interrompere il processo e inattivare la tripina.Centrifugare le cellule a 400 volte G per cinque minuti. E rimuovere con cura il supernatante senza disturbare il pellet cellulare. Lavare le cellule con un millilitro di PBS.Quindi sospendere di nuovo le celle in 300 microlitri di soluzione di fissaggio cellulare e trasferirle in tubi di citometria a flusso. Usa un citometro a flusso per analizzare le cellule a 488 nanometri. Per preparare le cellule per la microscopia a fluorescenza, aggiungere un millilitro di metanolo refrigerato ad ogni pozzo per fissare le cellule.Aggiungere 500 microlitri di una soluzione di 300 nanomolare di DAPI disciolta in PBS ad ogni pozzo. Incubare al buio per cinque minuti. Successivamente, rimuovere la soluzione DAPI e lavare nuovamente le celle con metanolo al 100% precedentemente conservato a meno 20 gradi Celsius.Utilizzare un microscopio a fluorescenza per analizzare le cellule utilizzando le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione mostrate qui. In questo studio, i nanoliposomi sono generati con un'elevata efficacia di incapsulamento per mRNA modificato sinteticamente. Utilizzando il kit di quantificazione dell'RNA, l'efficacia di incapsulamento dei nanoliposomi può essere analizzata dopo l'incapsulamento di un microgrammo di mRNA codificante eGFP analizzando la quantità libera di mRNA che non è incapsulata.Dopo l'incapsulamento dell'mRNA EGFP in diverse quantità di nanoliposomi, i nanolipoplex formati possono essere incubati con cellule in vitro e la percentuale di cellule che esprimono eGFP può essere analizzata usando citometria a flusso 24 ore dopo la trasfezione. Come si vede qui, anche solo un microlitro della soluzione di nanoliposomi è sufficiente per ottenere un'elevata trasfezione delle cellule invitro. Quando le cellule vengono trasfette con nanoliposomi contenenti mRNA eGFP etichettato Cy3, è possibile visualizzare la presenza dell'mRNA eGFP nel citoplasma, così come la proteina eGFP già prodotta.Poiché la trasfezione di cellule che utilizzano nanolipoplex può avere effetti avversi sulle cellule, la vitalità delle cellule è stata testata dopo 24 ore e 72 ore dopo la trasfezione. Non è stato possibile rilevare alcun effetto sulla vitalità cellulare quando le cellule sono state trattate con 2,5 o cinque microlitri di nanolipoplex. Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare di lavorare continuamente in un ambiente privo di etanolo perché ciò potrebbe danneggiare la stabilità dei nanoliposomi.Durante la preparazione e la miscelazione del colesterolo DC con DOPE, è necessario utilizzare una pipetta di vetro per evitare la contaminazione dei lipidi disciolti con componenti solubili di punte di pipetta di plastica. Seguendo questo protocollo, i nanoliposomi generati possono essere facilmente manipolati durante o dopo la preparazione. Ad esempio, l'incorporazione di molecole PEG o anticorpi specifici porterebbe a una maggiore stabilità o avvierebbe il targeting attivo dei tessuti.I nanoliposomi generati soddisfano gli aspetti di sicurezza necessari e facilitano l'assorbimento dell'mRNA nelle cellule bersaglio. I nanoliposomi complessi con uno specifico nRNA terapeutico possono dare un contributo essenziale allo sviluppo di nuove terapie a base di mRNA nel campo dell'ingegneria tissutale o della terapia sostitutiva, ad esempio.

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Ripetute iniezioni retro-orbitali di liposomes/siRNA/ITSN-1s cationici complessi nei topi, ogni 72 ore per 24 giorni, fornire in modo efficiente il duplex siRNA per il mouse microcircolo polmonare riducendo mRNA ITSN-1s e di espressione proteica del 75%. Questa tecnica è altamente riproducibile in un modello animale, non ha effetti collaterali ed evita infortuni mortali.

Silencing a lungo termine di Intersectin-1s in Polmoni mouse consegna ripetuta di un siRNA specifico tramite liposomi cationici. Valutazione degli effetti Knockdown al microscopio elettronico

L'obiettivo di questo protocollo è utilizzare liposomi cationici/anionici con un peptide neuro-mirato come sistema di rilascio del SNC per consentire al siRNA di attraversare la BEE.  L'ottimizzazione di un sistema di somministrazione per trattamenti, come il siRNA, consentirebbe più opzioni di trattamento per i prioni e altre malattie neurodegenerative.

La consegna dei terapeutica siRNA al SNC Utilizzando cationici e anionici liposomi

Descriviamo un metodo di utilizzo polyethyleneimine (PEI)-rivestito di nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetico per macrofagi trasfezione con siRNA. Queste nanoparticelle è in grado di fornire in modo efficiente siRNA di espressione del gene bersaglio macrofagi in vitro e in vivo e silenzio.

Nanoparticelle di ossido di ferro rivestite con Polyethyleneimine come un veicolo per la consegna di piccolo RNA interferente ai macrofagi In Vitro e In Vivo

Sono presentati metodi per preparare e caratterizzare le proprietà fisico-chimiche e la bioattività delle nanoparticelle siRNA reattive al pH neutralmente caricate. Sono discussi i criteri per le nanomedicine siRNA di successo come le dimensioni, la morfologia, la carica superficiale, il carico di siRNA e il silenziamento genico.

Preparazione di nanoparticelle polimeriche neutralmente cariche e sensibili al pH per la consegna del siRNA citosolico

Le nanoparticelle lipidiche sono sviluppate utilizzando un approccio di piattaforma di miscelazione microfluidica per l'incapsulamento di mRNA e DNA.

Formulazione e caratterizzazione di nanoparticelle lipidiche per la somministrazione genica utilizzando una piattaforma di miscelazione microfluidica

I metodi di produzione di nanoparticelle lipidiche (LNP) a base microfluidica hanno attirato l'attenzione nei sistemi di somministrazione dei farmaci (DDS), compresa la somministrazione di RNA. Questo protocollo descrive la fabbricazione, la produzione di LNP (LNP caricato con siRNA) e i processi di valutazione LNP utilizzando il nostro dispositivo microfluidico originale denominato iLiNP.

Produzione di nanoparticelle lipidiche caricate con siRNA utilizzando un dispositivo microfluidico

Utilizzando il polimero cationico a basso costo polietilenimina (PEI), abbiamo prodotto particelle lentivirali per l'espressione stabile di shRNA in cellule staminali embrionali umane H9 (hESC) e cellule progenitrici neurali derivate da H9 trasdotte transitoriamente (NPC) ad alta efficienza.

Consegna mediata lentivirale di shRNA a hESC e NPC utilizzando polietilenimina polimerica cationica a basso costo (PEI)

Una nanoparticella peptide-poloxamina autoassemblata (PP-sNp) viene sviluppata utilizzando un dispositivo di miscelazione microfluidica per incapsulare e fornire RNA messaggero trascritto in vitro . L'mRNA/PP-sNp descritto potrebbe trasfettare efficacemente le cellule in coltura in vitro.

Trasfezione efficiente di mRNA trascritto in vitro in cellule in coltura utilizzando nanoparticelle peptide-poloxamina

Qui viene presentato un protocollo per la formulazione di nanoparticelle lipidiche (LNP) che incapsulano l'mRNA che codifica per la luciferasi delle lucciole. Questi LNP sono stati testati per la loro potenza in vitro in cellule HepG2 e in vivo in topi C57BL/6.

Test dell'efficienza in vitro e in vivo di nanoparticelle mRNA-lipidi formulate mediante miscelazione microfluidica

Viene dimostrato un protocollo dettagliato per la sintesi di nanoparticelle lipidiche (LNP) utilizzando tecnologie di miscelazione a getto a impatto confinato (CIJ), tra cui un CIJ a due getti e un miscelatore a vortice multi-ingresso a quattro getti (μMIVM). I miscelatori CIJ generano ambienti di micromiscelazione riproducibili e turbolenti, con conseguente produzione di LNP monodispersi.

Sintesi di nanoparticelle lipidiche mediante flusso turbolento in miscelatori a getto a impatto confinato

Scopri come generare nanoliposomi cationici con il metodo del film secco per la consegna efficiente di mRNA terapeutico. Questa tecnica aumenta l'espressione proteica senza compromettere la vitalità cellulare.

Generazione di nanoliposomi cationici per la consegna efficiente In Vitro di trascritti di RNA messaggero

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