Name: In Vivo Formazione immagine di specie reattive dellossigeno in un murino ferita modello (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Impara a misurare le specie reattive dell'ossigeno in tempo reale in ferite cutanee murine con imaging chemiluminescente L-012. Questo metodo non invasivo aiuta a studiare la rigenerazione tissutale.

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Siamo grati al nucleo Imaging preclinico presso la NYU School of Medicine, con un ringraziamento speciale Aristizabal Orlando e Youssef Zaim Wadghiri. Il nucleo è una risorsa condivisa parzialmente supportata da Laura e Isaac Perlmutter Cancer Center Support Grant NIH/NCI 5P30CA016087 e NIBIB Biomedical Technology Resource Center Grant NIH P41 EB017183. Questo lavoro è stato sostenuto dall'associazione americana del diabete "Pathway per fermare il diabete" D.C. [concessione numero 1-16-ACE-08] e al NYU applicato ricerca supporto fondo di P.R.

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Comitato della New York University School of Medicine. Tutti i topi sono alloggiati dietro una barriera e tutto il personale indossano adeguati dispositivi di protezione personale.
1. giorno 0: Preparazione del modello murino di Excisional cicatrizzazione
<ol><li>Anestetizzare topi diabetici (Leprdb/db), età compresa tra 8 – 12 settimane, con inhalational 2% isoflurane. Confermare che ogni mouse ha stato adeguatamente anestetizzato usando il piede pad pinch test. Applicare il lubrificante oculare sterile per ogni occhio per prevenire l'irritazione, secchezza. I ricercatori dovrebbero seguire linee guida del loro personale veterinario istituzionale quando anestetizzare gli animali utilizzando isoflurano.</li>
	<li>Pesare i topi e registrare il peso corporeo di ogni mouse. Confermare lo stato diabetico di animali registrando il glucosio di anima di ogni animale usando un glucometer.</li>
	<li>Disinfettare procedurali workspace e anestesia attrezzature. Rimuovere i peli dorsali dei topi utilizzando un tagliacapelli, seguita dall'applicazione di lozione per capelli rimozione per spazzare via i capelli in eccesso. Utilizzare salviettine imbevute di alcool per pulire la pelle esposta, due volte e lasciare per asciugare.</li>
	<li>Creare due ferite di pieno-spessore 10 mm che si estende attraverso il carnosus del pannicolo usando pugni biopsia sterile 10 mm secondo una consolidata di excisional cicatrizzazione tecnica7,8. Utilizzare guanti sterili per tutti gli interventi chirurgici di sopravvivenza. Autoclave tutti gli strumenti chirurgici in sacchetti prima di chirurgia e aperto solo in campo chirurgico.</li>
	<li>Stecca le ferite aprono con un foglio di silicone spessa 0,5 mm con ritagli circolari di 10 mm e fissare gli stents in luogo utilizzando interrotti suture seta 4-0.</li>
	<li>Dopo chirurgia, rimuovere gli animali dall'anestesia e posizionare il cuscinetto per facilitare il corretto recupero di riscaldamento. Di nota, se la temperatura corporea degli animali diminuisce durante la procedura, l'animale deve essere manovrata al termocuscino all'inizio per minimizzare perdita di calore del corpo nell'ambito dell'anestesia. Monitorare gli animali fino a quando sono sveglio e mobile.</li>
	<li>Una volta completamente recuperato, tornare animali gabbie individuali, forniti di cibo e acqua (garantire che qualche cibo è il pavimento della gabbia per arricchimento post-operatorio). Forniscono gli asciugamani di carta tagliuzzata come ulteriore materiale di nidificazione per 2 settimane. Non casa animali che hanno subito la chirurgia con altri animali, per evitare interazioni avverse e modifiche a ferire lo stato di guarigione.</li>
	<li>Per alleviare il dolore post-operatorio, iniettare topi per via sottocutanea con buprenorfina a 0,1 mg/kg di peso corporeo due volte al giorno, a partire immediatamente dopo la procedura, per 3 giorni.</li>
</ol>2. giorno 1: Preparazione di Keap1 siRNA
Nota: Preparare tutti i trattamenti all'interno di una cappa di biosicurezza.
<ol><li>Preparare la diluizione di siRNA combinando 37,5 µ l di siero riduttore terreno con 12,5 µ l di 20 µM Keap1 siRNA (siKeap1) (250 pmol) in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL sul ghiaccio.</li>
	<li>Preparare la diluizione di liposomi combinando 25 µ l di siero riduttore terreno con 25 µ l di miscela di liposomi in una microcentrifuga da 1,5 mL.</li>
	<li>Aggiungere 50 µ l della diluizione di siRNA 50 µ l liposoma della diluizione goccia a goccia (1:1 in volume) e mescolare delicatamente.</li>
	<li>Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aggiungere 50 µ l di gel 2% metilcellulosa in acqua e miscelare delicatamente pipettando su e giù.</li>
	<li>Trattare ogni animale con entrambi un si di assurditàNS (controllo) o siKeap1 (sperimentale). Applicare il gel sulla parte superiore della ferita. Avvolgere il tronco dell'animale con condimento di pellicola trasparente per mantenere il gel sul posto, mantenendo gli arti liberi di mantenere la mobilità.</li>
</ol>3. giorno 3: Preparazione della soluzione L-012
Nota: Preparare tutti i reagenti in una cappa di biosicurezza.
<ol><li>In una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL, preparare L-012 in 1X PBS a una concentrazione di 0,5 mg/100 mL.</li>
	<li>Vortice manualmente il tubo del microcentrifuge. Il L-012 non si scioglie completamente in PBS, tuttavia esso dovrebbe essere uniformemente sospeso nel liquido. Di nota, non tentare di sciogliere L-012 in acqua per evitare inquietante equilibrio fisiologico dell'elettrolito dopo l'iniezione.</li>
	<li>Trasferire la soluzione in una siringa da 1 mL, utilizzando un ago da 27 G. Nota: Assicurarsi di proteggere la soluzione L-012 dalla luce.</li>
</ol>4. 3 ° giorno: In Vivo Imaging delle ferite diabetiche
<ol><li>Anestetizzare topi con inhalational 2% isoflurane. I ricercatori dovrebbero seguire linee guida del loro personale veterinario istituzionale quando anestetizzare gli animali utilizzando isoflurano. Confermare che ogni mouse ha stato adeguatamente anestetizzato usando il piede pad pinch test. Applicare il lubrificante oculare sterile per ogni occhio per prevenire l'irritazione, secchezza.</li>
	<li>Rimuovere delicatamente la medicazione di pellicola trasparente dai topi senza disturbare le ferite.</li>
	<li>Porre i topi nella camera imaging nei loro rispettivi ordini. Per mantenere livelli adeguati di2 O nella camera, impostare l'afflusso di sistema imaging e i livelli di2 camera O induzione a 1,0 L/min.</li>
	<li>I topi per bioluminescenza e fotografia alla linea di base prima dell'iniezione di L-012 composto di immagine.</li>
	<li>Pulire l'addome con salviettine imbevute di alcool e lasciare per asciugare. Eseguire un'iniezione intraperitoneale della soluzione L-012 a 5 mg per peso corporeo 200g utilizzando un ago calibro 27. Ad esempio, un mouse peso 20 grammi dovrebbe ricevere 0,5 mg di L-012.</li>
	<li>Immediatamente dopo l'iniezione di L-012, rimettere i topi nelle rispettive posizioni nella camera di imaging. Immagine i topi nell'arco di 60 minuti, per 1 minuto a intervalli di 4 minuti. Definire la ferita di 10 mm come la regione di interesse per determinare il livello di ROS.</li>
	<li>Dopo chirurgia, rimuovere gli animali dall'anestesia e posizionare il cuscinetto per facilitare il corretto recupero di riscaldamento. Monitorare gli animali fino a quando sono sveglio e mobile.</li>
	<li>Una volta completamente recuperato, tornare animali gabbie individuali, mantenendo lo stesso ambiente di post-operatorio arricchimento precedentemente descritto nel punto 1.6. Non casa animali che hanno subito la chirurgia con altri animali, per evitare interazioni avverse e modifiche a ferire lo stato di guarigione.</li>
</ol>

<ol><li>Nishinaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+sensitive+chemiluminescence+probe%2C+L-012%2C+for+measuring+the+production+of+superoxide+anion+by+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).</li>
<li>Daiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+NAD%28P%29H+oxidase-derived+superoxide+with+the+luminol+analogue+L-012%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Measurement of NAD(P)H oxidase-derived superoxide with the luminol analogue L-012.</a> Free Radical Biology and Medicine. 36 (1), 101-111 (2004).</li>
<li>Imada, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+reactive+oxygen+species+generated+by+neutrophils+using+a+chemiluminescence+probe+L-012%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of reactive oxygen species generated by neutrophils using a chemiluminescence probe L-012.</a> Analytical Biochemistry. 271 (1), 53-58 (1999).</li>
<li>Sohn, H. Y., Gloe, T., Keller, M., Schoenafinger, K., Pohl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+superoxide+detection+in+vascular+cells+by+the+new+chemiluminescence+dye+L-012%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Research%22%5BJournal%5D)">Sensitive superoxide detection in vascular cells by the new chemiluminescence dye L-012.</a> Journal of Vascular Research. 36 (6), 456-464 (1999).</li>
<li>Fuchs, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Hypoxia+PET+Imaging+Quantifies+the+Severity+of+Arthritic+Joint+Inflammation+in+Line+with+Overexpression+of+Hypoxia-Inducible+Factor+and+Enhanced+Reactive+Oxygen+Species+Generation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo Hypoxia PET Imaging Quantifies the Severity of Arthritic Joint Inflammation in Line with Overexpression of Hypoxia-Inducible Factor and Enhanced Reactive Oxygen Species Generation.</a> The Journal of Nuclear Medicine. 58 (5), 853-860 (2017).</li>
<li>Asghar, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+in+murine+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in murine colitis.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 20 (8), 1435-1447 (2014).</li>
<li>Galiano, R. D., Michaels, J. t, Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+reproducible+murine+model+of+excisional+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing.</a> Wound Repair and Regeneration. 12 (4), 485-492 (2004).</li>
<li>Soares, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+Nrf2+Signaling+Normalizes+the+Regenerative+Niche%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Restoration of Nrf2 Signaling Normalizes the Regenerative Niche.</a> Diabetes. 65 (3), 633-646 (2016).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+ROS+signaling+in+cells+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Imaging ROS signaling in cells and animals.</a> Journal of Molecular Medicine. 91 (8), 917-927 (2013).</li>
<li>Kielland, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+in+inflammation+using+the+luminescent+probe+L-012%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012.</a> Free Radical Biology and Medicine. 47 (6), 760-766 (2009).</li>
<li>Balke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+Oxidative+Cellular+Stress+Induced+by+Nanoparticles+in+the+Subcytotoxic+Range+Using+Fluorescence+Lifetime+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Visualizing Oxidative Cellular Stress Induced by Nanoparticles in the Subcytotoxic Range Using Fluorescence Lifetime Imaging.</a> Small. , (2018).</li>
<li>Zielonka, J., Lambeth, J. D., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+use+of+L-012%2C+a+luminol-based+chemiluminescent+probe%2C+for+detecting+superoxide+and+identifying+inhibitors+of+NADPH+oxidase%3A+a+reevaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">On the use of L-012, a luminol-based chemiluminescent probe, for detecting superoxide and identifying inhibitors of NADPH oxidase: a reevaluation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 65, 1310-1314 (2013).</li>
<li>Dikalov, S. I., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+detection+of+mitochondrial+and+cellular+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signalling%22%5BJournal%5D)">Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species.</a> Antioxidants & Redox Signalling. 20 (2), 372-382 (2014).</li>
<li>Rabbani, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Nrf2+activation+therapy+with+RTA+408+enhances+regenerative+capacity+of+diabetic+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Research+and+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Targeted Nrf2 activation therapy with RTA 408 enhances regenerative capacity of diabetic wounds.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 139, 11-23 (2018).</li>
<li>Rabbani, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+lipoproteoplex+delivers+Keap1+siRNA+based+gene+therapy+to+accelerate+diabetic+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Novel lipoproteoplex delivers Keap1 siRNA based gene therapy to accelerate diabetic wound healing.</a> Biomaterials. 132, 1-15 (2017).</li>
</ol>

Non abbiamo alcuna informativa al rapporto.

Tecniche comuni per la misurazione di ROS sono state limitate tramite protocolli complessi che richiedono l'estrazione di tessuto o allo stesso modo le tecniche invasive. Negli ultimi anni, le misure dello sforzo ossidativo sono state segnalate sulla base di modalità di imaging innovative, consentendo in tal modo per valutazioni spatiotemporal9,10,11. L-012 ha diversi vantaggi come una sonda chemiluminescente rispetto al luminol...

I metaboliti dell'ossigeno generati attraverso processi infiammatori contribuiscono a diverse cascate di segnalazione così come alterazione distruttiva delle componenti cellulari1. Utilizzando tecniche sensibili e specifiche per misurare il ROS è fondamentale per lo studio dei processi infiammatori e caratterizzare gli effetti dello stress ossidativo. In vivo imaging è prezioso a causa della sua capacità di fornire dati dinamici spaziali e temporali nel tessuto vivente. L-012 è una sonda chemiluminescente sintetica che è altamente sensibile per gli anioni superossido e produce un'intensità luminosa rispetto altre sonde fluorescenti in cellule, tessuti e sangue intero1,2,3, 4. è stato impiegato con successo per l'imaging in vivo in modelli murini per lo studio di parecchie malattie infiammatorie, tra cui l'artrite e colite5,6. Deve ancora essere impiegato in un modello di cicatrizzazione cutanea stabilita. Misura del ROS generati sono altrettanto rilevante per valutare la progressione della guarigione della ferita in condizioni diverse. La sensibilità e la natura non invadente di questo metodo rende una tecnica promettente per lo studio della guarigione delle ferite attraverso modelli murini.
Nrf2 è delle principali cause della risposta antiossidante e un fattore trascrizionale con specificità per l'elemento di risposta antiossidante (ARE) comune per le regioni promotrici di diversi antiossidanti enzimi8. In assenza di stress ossidativo, Nrf2 è sequestrato nel citoplasma di Keap1, che successivamente causa sua ubiquitinazione e degradazione. Squilibrio del pathway Nrf2/Keap1 è stato implicato nella omeostasi redox inappropriati e ritardata guarigione delle ferite nella regolazione di sforzo ossidativo aumentato9. Precedentemente abbiamo indicato che la soppressione di Keap1 stimola l'attività aumentata di Nrf2 e promuove il salvataggio di guarigione arrotolata cutanea patologica nei diabetici ferite9.
Qui descriviamo un protocollo che utilizza L-012-assistita bioluminescenza imaging per misurare i livelli di ROS in un modello di guarigione della ferita cutanea escissionale, che è fondamentale per evidenziare l'associazione tra ROS e la guarigione della ferita. Questa tecnica viene illustrato le modifiche in tempo reale in carico ossidativo all'interno di ferite e immediata periferia. Inoltre, questo metodo consente rapida valutazione degli interventi e meccanismi che influenzano la gestione delle redox. Qui usiamo un modello di atterramento Keap1 per il ripristino dell'omeostasi redox per valutare l'applicabilità della nostra strategia. Perché la nostra tecnica è non invasiva e ferite sono indisturbate, lo stesso animale può essere utilizzato per ulteriori analisi di conferma sulla base di istologia o cella lisati.

<table><tbody><tr><td>Bks. Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mouse</td><td>Jackson Laboratories</td><td>000642</td><td></td></tr><tr><td>13 cm x 18 cm Foglio di silicone (0,6 mm)</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>665581</tr><tr><td>Medicazioni in film trasparente 3M Tegaderm</td><td>3M</td><td>88-1626W</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Reagente di trasfezione</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td></td><td></td>11668027</tr><tr><td>Keap1 Stealth siRNA</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>1299001</td><td></td></tr><tr><td>Silenziatore controllo negativo&nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific&nbsp;</td><td>AM4635</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Siero Ridotto</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>Metilcellulosa&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9004-67-5</td><td></td></tr><tr><td>L-012</td><td>Wako Chemicals</td><td>120-04891</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina III XR Sistema di imaging in vivo&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo formazione immagine di specie reattive dell'ossigeno in un murino ferita modello

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

La generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) è una caratteristica dei processi infiammatori, ma in eccesso, lo sforzo ossidativo è ampiamente implicato in varie patologie come il cancro, aterosclerosi e diabete. Precedentemente abbiamo indicato che la disfunzione del fattore nucleare (derivato degli eritrociti 2)-come 2 (Nrf2) / degli eritrociti Kelch-come cellula-derivato proteina 1 (Keap1) segnalazione sentiero conduce ad estremo squilibrio ROS durante cutanea delle ferite in diabete. Poiché i livelli di ROS sono un importante indicatore di progressione della guarigione delle ferite, tecniche specifiche e accurata quantificazione sono preziosi. Sono stati descritti diversi saggi in vitro per misurare il ROS in cellule e tessuti; Tuttavia, essi forniscono solo una singola misurazione cumulativa per campione. Più recentemente, hanno consentito lo sviluppo di indicatori basati su proteine e modalità di imaging uniche analisi spazio-temporale. L-012 (C13H8ClN4NaO2) è un derivato di luminol che può essere utilizzato per sia in vivo che in vitro chemiluminescente rilevamento di ROS generati dall'ossidasi di NAPDH. L-012 emette un segnale più forte rispetto altre sonde fluorescenti e ha dimostrato di essere sensibile e affidabile per la rilevazione di ROS. L'applicabilità del lasso di tempo del L-012-facilitato imaging fornisce informazioni preziose sui processi infiammatori, riducendo la necessità del sacrificio e nel complesso riducendo il numero di animali di studio. Qui, descriviamo un protocollo che utilizza L-012-facilitato in vivo imaging per quantificare lo sforzo ossidativo in un modello di excisional cicatrizzazione utilizzando topi diabetici con localmente disfunzionale Nrf2/Keap1.

Tre giorni dopo la creazione di ferite bilaterale secondo un modello stabilito ferita excisional (Figura 1A), topi diabetici sono posizionati nella camera di imaging. Una fotografia iniziale e una misura della bioluminescenza sono tenuti prima dell'iniezione di L-012 al segnale di fondo (Figura 1B). A seguito di iniezione intraperitoneale con la soluzione di L-012, i topi vengono riposizionati nella camera e bioluminescenza è vis...

Descriviamo un non-invasiva in vivo imaging protocol che è semplice e conveniente, utilizzando L-012, un a chemiluminescenza luminol-analogico, per visualizzare e quantificare le specie reattive dell'ossigeno (ROS) generate in un modello murino di excisional ferita.

In Vivo Formazione immagine di specie reattive dell'ossigeno in un murino ferita modello

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della riparazione e rigenerazione dei tessuti sulle associazioni tra le vie citoprotettive, lo stress ossidativo e la risposta di guarigione delle ferite. Il vantaggio principale di questa potente tecnica è che è possibile misurare le specie reattive dell'ossigeno in una ferita, in tempo reale, per determinare il loro impatto sulla rigenerazione dei tessuti. A dimostrare la procedura con me sarà Jennifer Kwong, un'assistente di ricerca nel mio laboratorio.Utilizzare un glucometro per misurare la glicemia di ogni topo diabetico anestetizzato di otto-12 settimane. E usa un trimmer per capelli e una crema depilatoria per rimuovere i capelli dorsali dal primo animale. Utilizzare salviette alcoliche due volte per pulire la pelle esposta e drappeggiare l'animale in modo che sia esposta solo l'area chirurgica.Quando l'alcol si è asciugato, utilizzare punzoni sterili da 10 millimetri di biopsia per creare due ferite a pieno spessore di 10 millimetri che si estendono attraverso il panniculus carnosus secondo una ben consolidata tecnica di guarigione della ferita adcisionale. Utilizzare un foglio di silicone spesso 0,5 millime

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

NADPH ossidasi è la principale fonte di specie reattive dell'ossigeno (ROS) in fagociti. A causa della natura effimera dei ROS, è difficile misurare e monitorare i livelli di ROS negli animali viventi. Un metodo minimamente invasivo per la quantificazione seriale di ROS in topi viventi è descritto.

Imaging bioluminescenza di attività NADPH ossidasi in diversi modelli animali

Source: Hunt, A. M. A., et al. Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model. J. Vis. Exp.(2017).This video demonstrates the procedure for assessing infection clearance and healing progression in a wounded diabetic mouse using bioluminescent and microscopic images.

Bioluminescence Imaging to Track Bacterial Infection and Wound Healing in a Mouse Model

Questo video mostra l'imaging in vivo per studiare le dinamiche di reclutamento dei neutrofili in un sito di infezione in un topo transgenico immunocompromesso con neutrofili che esprimono GFP. Comporta l'iniezione di batteri luminescenti per causare un'infezione. Ciò porta al reclutamento di neutrofili nel sito di infezione, il cui tracciamento viene effettuato mediante imaging.

Monitoraggio delle dinamiche di reclutamento dei neutrofili e della carica batterica nel sito di infezione in un modello murino

Questo video mostra una tecnica per generare un modello murino di infezione della ferita cutanea. Dopo aver infettato i topi, ingegnerizzati per esprimere una proteina fluorescente nei neutrofili, con uno Staphylococcus aureus bioluminescente geneticamente modificato, un batterio patogeno. La carica batterica nel sito di infezione e le dinamiche di reclutamento dei neutrofili possono essere studiate utilizzando l'imaging dell'intero animale.

Un modello di infezione da ferita cutanea murina per studiare la risposta immunitaria contro un patogeno batterico

Un modello murino di guarigione della ferita cutanea che può essere utilizzato per valutare composti terapeutici in contesti fisiologici e fisiopatologici.

Modello murino di guarigione delle ferite

Questo protocollo descrive l'induzione di un modello di ischemia-riperfusione (IR) sulla pelle orecchio mouse utilizzando magnete di bloccaggio. Utilizzando un modello di imaging intravitale custom-built, studiamo in vivo risposte infiammatorie post-riperfusione. La logica alla base dello sviluppo di questa tecnica è quello di estendere la comprensione di come leucociti rispondono al danno IR pelle.

Inducendo ischemia-riperfusione lesioni in Ear pelle mouse per intravitale Multiphoton Imaging delle risposte immunitarie

Qui descriviamo un nuovo modello murino diabetico utilizzando topi glabri per il monitoraggio in tempo reale, non invasiva, di infezioni di ferita di biofilm di bioluminescenti Pseudomonas aeruginosa. Questo metodo può essere adattato ad infezione di altre specie di batteri e microrganismi geneticamente modificati, inclusi i biofilm multi-specie, di valutare e testare l'efficacia delle strategie di antibiofilm.

Vieni nel lato di luce: In Vivo monitoraggio di Pseudomonas aeruginosa Biofilm infezioni nelle ferite croniche in un modello murino Hairless diabetico

Un approccio è descritto per la rilevazione in tempo reale della risposta immunitaria innata di ferite cutanee e Staphylococcus aureus infezione dei topi. Di confronto LysM-EGFP topi (che possiedono i neutrofili fluorescenti) con un LysM-EGFP incrociate topo immunodeficiente, abbiamo anticipato la nostra comprensione dell'infezione e lo sviluppo di approcci per combattere l'infezione.

Un modello di topo per valutare risposta immunitaria innata per infezione da Staphylococcus aureus

Lo scopo di questo protocollo è quello di indurre la produzione transitoria in vivo di livelli non letali di specie reattive dell'ossigeno (ROS) nella pelle del topo, promuovendo ulteriormente le risposte fisiologiche nel tessuto.

Stimolazione di nicchie di cellule staminali e rigenerazione tissutale nella pelle di topo mediante fotogenerazione commutabile protoporfirina IX-dipendente di specie reattive dell'ossigeno in situ

Lo scopo di questo studio era quello di sviluppare un modello murino di guarigione delle ferite da ustione. Un'ustione termica è stata indotta sulla pelle dorsale dei topi utilizzando un modello di ottone preriscaldato. Il tessuto bruciato è stato disretto e sovrapposto con un innesto cutaneo raccolto dalla coda di un topo donatore geneticamente simile.

Un modello Murine di una ferita da ustione ricostruita con un innesto di pelle allogenica

Il presente protocollo descrive un metodo per rilevare le specie reattive dell'ossigeno (ROS) negli organoidi murini intestinali utilizzando l'imaging qualitativo e i saggi quantitativi di citometria. Questo lavoro può essere potenzialmente esteso ad altre sonde fluorescenti per testare l'effetto di composti selezionati sui ROS.

Analisi dello stress ossidativo negli organoidi intestinali murini utilizzando la sonda fluorogenica sensibile alle specie reattive dell'ossigeno

Impara a misurare le specie reattive dell'ossigeno in tempo reale in ferite cutanee murine con imaging chemiluminescente L-012. Questo metodo non invasivo aiuta a studiare la rigenerazione tissutale.

In Vivo Formazione immagine di specie reattive dell'ossigeno in un murino ferita modello

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