Tecnologia di Microarray di proteina extracellulare per il rilevamento di Throughput elevato di interazioni recettore-ligando bassa affinità

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle interazioni proteiche proteiche consentendo il rilevamento di nuovi partner leganti per proteine extracellulari, sia ad alta produttività che ad alta sensibilità. Il vantaggio principale di questo metodo è che, con pochi microgrammi di proteine, è possibile generare centinaia di diapositive utilizzando la stampante micro array. Utilizzare un micro arrayer standard per la stampa di diapositive.

Questo strumento ha una capacità di 57 diapositive per corsa, utilizza una testina di stampa con 48 perni di avvistamento e può ospitare fino a 8.000 punti per diapositiva. Generare piastre di lavoro utilizzando 384 piastre di pozzo a 10 microlitri di campione per pozzo dalle piastre di serie. Eseguire questo passaggio manualmente, prima della stampa a scorrimento utilizzando il micro arrayer.

Quindi individuare le proteine con perni di avvistamento di tipo quill su scivoli di silani epossidici al 60% di umidità per prevenire la disidratazione delle macchie proteiche. L'albumina del siero bovino etichettata Cy3 può essere individuata in duplice copia tra ogni campione proteico per visualizzare l'array per il montaggio della maschera. Dopo la stampa, rimuovere le diapositive di micro array proteico dall'ambiente umidificato.

Quindi, utilizzare un fogger ad ultrasuoni per generare una nebbia fine di soluzione di blocco che si deposita sulla superficie di scorrimento. Quindi, bloccare le diapositive durante la notte con il 5% di latte in PBST per emanare la superficie. Conservare le diapositive a meno 20 gradi Celsius nel 50%glicerolo per evitare il congelamento.

Le interazioni tra proteine extracellulari sono spesso caratterizzate dalle loro basse affinità. Per consentire il rilevamento di queste interazioni, aumentando l'avidità di legame, abbiamo sviluppato un approccio multivalente basato sulla cattura della proteina interrogata espressa come domini extracellulari taggati FC sulle micro perline rivestite di proteina A. Ruota l'IgG portante, che è stato etichettato con il colorante mono reattivo Cy5 come descritto nel protocollo di testo.

Per calcolare il rapporto molare della proteina query e del Cy5 IgG, dividere il peso molecolare della proteina di query per il peso molecolare dell'IgG e moltiplicare per 40 microgrammi per millilitro per determinare la concentrazione di Cy5 IgG necessaria. Una volta determinati tutti i rapporti, formare il complesso proteico delle micro perline combinando la query taggata FC e il Cy5 IgG con la proteina A micro perline. Mescolare le sospensioni in PBS su un rotatore a tubo per 30 minuti a temperatura ambiente, protetto dalla luce.

Per iniziare lo screening, riscaldare gli scivoli preparati a temperatura ambiente prima di caricarsi sulla stazione di ibridazione. Per eseguire lo screening, lavare prima il micro array con PBST per un minuto per rimuovere il glicerolo residuo. Caricare 200 microlitri di un milligrammo per millilitro proteina A nel latte PBS al 5% e incubare per 30 minuti per evitare che le micro perline proteiche non complesse A si attacchino alle proteine etichettate FC che possono essere presenti nel micro array.

Dopo che la stazione di ibridazione lava le diapositive con PBST, caricare 200 microlitri del complesso di micro perline query, in presenza di un milligrammo per proteina millilitro A e incubare per 30 minuti. Dopo l'ibridazione e il lavaggio delle diapositive da parte della stazione di ibridazione, sciacquare gli scivoli con acqua e metterli in singoli tubi conici da 50 millilitri. Asciugare i tubi girando a 900 volte G per cinque minuti.

Infine, scansiona le diapositive con uno scanner micro array appropriato per rilevare la fluorescenza Cy3 e Cy5, rispettivamente a 532 e 635 nanometri. Ecco un'immagine rappresentativa di una diapositiva stampata. Le macchie di albumina del siero bovino etichettate Cy3 sono in verde.

I punti sono stati stampati in duplice copia come controllo di qualità del processo di stampa. I risultati rappresentativi di una proteina orfana, vengono visualizzati qui per l'identificazione di partner leganti utilizzando la tecnologia micro array proteica extracellulare. Le macchie rosse duplicate sono identificate come un successo per la proteina di query schermata.

Questo metodo descritto è altamente versatile e può essere utilizzato per la stampa di una gamma di librerie proteiche, siano esse specifiche famiglie proteiche o grandi raccolte di proteine come la nostra. Qualsiasi proteina di interesse può essere valutata. Durante il tentativo di questa procedura è importante gestire le diapositive con cura e assicurarsi che non si asciughino in modo da prevenire la perdita di attività delle proteine stampate.

Seguendo lo schermo di una proteina di interesse, si consiglia vivamente di convalidare ulteriormente eventuali colpi osservati utilizzando tecnologie ortogonali, come la risonanza plasmonica di superficie. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori per studiare le interazioni proteiche extracellulari nell'uomo.