Microdialisi degli aminoacidi eccitanti durante le registrazioni di EEG in liberi di muoversi

Qui, descriviamo un metodo per microdialisi in vivo analizzare il rilascio del glutammato e aspartato nell'ippocampo ventrale dei ratti epilettici e non-epilettici, in combinazione con le registrazioni di EEG. Concentrazioni extracellulari di aspartato e glutammato possono essere correlate con le diverse fasi della malattia.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nelle neuroscienze come le alterazioni della neurochimica durante la storia naturale delle malattie neurologiche. Il principale vantaggio della tecnica EEG di microdialisi proposta è che tale approccio combinato consente l'accoppiamento dei cambiamenti nel rilascio del neurotrasmettitore all'interno di fasi specifiche dello sviluppo e della progressione della malattia. Inizia accendendo l'amplificatore posizionato al di fuori della gabbia di Faraday.

Aprire il software EEG e avviare l'acquisizione EEG e osservare il segnale EEG prodotto da cavi non collegati. Successivamente, collegare l'animale al sistema di registrazione EEG collegato tenendo la testa dell'animale tra due dita allungate di una mano e avvitando i connettori al piedistallo dell'elettrodo utilizzando l'altra mano libera. Impostare un fattore di amplificazione su ogni canale dell'amplificatore in base al segnale dell'elettrodo di un singolo animale in modo che il segnale EEG sia in scala.

Quindi lascia che l'animale esplori la nuova gabbia per almeno un'ora sotto l'osservazione diretta del ricercatore. Regolare il cavo in base alla merce dell'animale e assicurarsi che i cavi non interferiscano con i movimenti dell'animale e la postura sdraiata. Infine, verificare la corretta inquadratura delle immagini sulle videocamere e quindi avviare la registrazione EEG video.

Iniziare preparando le sonde di microdialisi per il primo utilizzo secondo la guida dell'utente del produttore e riempirle con la soluzione di Ringer. Quindi, tagliare pezzi di tubi FEP lunghi 10 centimetri e collegarli alle cannule di ingresso e uscita della sonda utilizzando gli adattatori di tubi di diversi colori. Assicurarsi che i tubi tocchino gli adattatori senza spazio morto in tutte le connessioni.

Rimuovere la cannula fittizia dalla sua guida usando le pinzette tenendo saldamente la testa dell'animale. Inserire la sonda di microdialisi nella cannula guida e utilizzare l'argilla modellante per rassodare ulteriormente la cannula. Quindi, collegare l'animale al sistema di registrazione EEG collegato.

Quindi metti l'animale nel cilindro di plexiglass e lascialo esplorare il nuovo ambiente. Segui i movimenti dei topi svegli e che si muovono liberamente. Quindi, collegare l'ingresso della sonda alla siringa da 2,5 millilitri con un ago smussato calibro 22 contenente Ringer's Solution utilizzando gli adattatori per tubi.

Spingere un millilitro della soluzione di Ringer nella sonda in 10 secondi spingendo continuamente il pistone della siringa da 2,5 millilitri. Verificare la caduta del liquido che appare sull'uscita per indicare quando la sonda è pronta per l'uso. Infine, riempire le siringhe da 2,5 millilitri collegate ai tubi FEP da adattatori tubolari con Ringer's Solution e montarle sulla pompa per infusione.

Avviare la pompa a due microlitri al minuto e lasciarla funzionare durante la notte. Dopo aver verificato tramite video registrazioni EEG l'assenza di convulsioni nelle tre ore precedenti la raccolta del campione, arrestare la pompa che trasporta le siringhe cannulate del tubo FEP riempite con la soluzione di Ringer. Montare un altro set di siringhe da 2,5 millilitri collegate ai tubi FEP con adattatori per tubi riempiti con una soluzione ringer modificata contenente soluzione di potassio da 100 millimolare.

Avviare la pompa a due microlitri al minuto e lasciarla funzionare. Verificare l'assenza di bolle d'aria nel sistema e assicurarsi che il tubo tocchi gli adattatori senza spazio morto in tutte le connessioni. Quindi, verificare la caduta del liquido che appare sulla presa per indicare quando la sonda è pronta per l'uso.

Successivamente, collegare il tubo FEP delle siringhe riempito con la soluzione di Ringer alla cannula di ingresso della sonda in ogni animale e attendere la comparsa della goccia di liquido sulla punta dell'uscita. Collegare l'uscita della sonda al tubo FEP che porta alla raccolta nella provetta. Inserire il tubo FEP nella provetta chiusa da 0,2 millilitri con un tappo perforato e assicurarsi che il tubo rimanga in posizione fissarlo con un pezzo di argilla modellante.

Dopo aver esistito la pompa a due microlitri al minuto per 60 minuti senza raccogliere campioni per equilibrare il sistema, raccogliere cinque campioni di dialisati consecutivi di 30 minuti in condizioni di base e conservare i campioni sul ghiaccio. Dopo 10 minuti, passare dalle siringhe contenenti 100 millimolare soluzione di ringer di potassio alla normale soluzione di suoneria e lasciare funzionare la pompa. Dopo la raccolta del quinto dialisato post-equilibrazione, raccogliere 20 frazioni di dialisato a microlitero ogni 10 minuti per un'ora.

Quindi raccogliere altri tre campioni di dialisati di 30 minuti e arrestare la pompa. Infine, conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius dopo l'esperimento fino all'analisi HPLC. Al termine dell'esperimento, sciacquare le sonde di microdialisi usate con acqua distillata e conservarle in una fiala piena di acqua distillata pulita fino al prossimo utilizzo.

Infine, sciacquare l'intera configurazione della microdialisi con acqua distillata seguita dal 70% di etanolo. Sostituire l'etanolo con l'aria e conservare la configurazione in un ambiente sterile. Queste sono le tracce rappresentative dell'EEG registrate dall'ippocampo del controllo e dai ratti epilettici durante la fase cronica della malattia.

Non è stata osservata alcuna alterazione EEG nei ratti di controllo, mentre un'attività epilettica parossismica sincronizzata è stata osservata circa 500 millisecondi prima e durante le convulsioni comportamentali nei ratti epilettici. La concentrazione di glutammato basale riscontrata nei ratti epilettici cronici era significativamente più alta che negli animali di controllo. L'alto potassio ha evocato un ulteriore rilascio di glutammato per circa 30 minuti nei ratti di controllo e per circa 60 minuti nei ratti epilettici cronici.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che gli animali impiantati con il dispositivo sono inclini a perderlo nel corso di un esperimento prolungato, quindi usa un set di testine leggere e cavi sufficientemente lunghi per evitare di interferire con la mobilità animale. A seconda della disponibilità di un saggio analitico appropriato, il metodo può essere ulteriormente utilizzato per testare diverse molecole solubili nel cervello quando si utilizza la registrazione EEG allo stesso tempo. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha permesso ai ricercatori nel campo dell'epilessia di fornire una visione delle alterazioni della neurotrasmissione eccitatoria nel caso di un'epilessia del lobo temporale.

Dopo aver visto questo video, confidiamo che avrai una migliore comprensione di come eseguire la microdialisi in vivo insieme alla registrazione EEG dell'elettrodo di profondità in un ratto epilettico liberamente in movimento.