Imaging in tempo reale e quantificazione dello sviluppo di Biofilm fungine utilizza un sistema bifase di flusso a ricircolo
18 ottobre 2018
Descriviamo l'assembly, operazione, e la pulizia di un apparato di flusso progettato per formazione di biofilm fungine di immagine in tempo reale mentre sotto flusso. Inoltre forniamo e discutere algoritmi quantitativi da utilizzare sulle immagini acquisite.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della microbiologia, come il modo in cui il flusso di fluido altera la crescita e lo sviluppo del biofilm fungino. Il principale vantaggio di questa tecnica è che ci permette di valutare quantitativamente gli effetti del flusso sulla crescita e lo sviluppo del biofilm in tempo reale. Iniziate questo esperimento con l'assemblaggio dell'apparato di flusso, come descritto nel protocollo di testo.
Il giorno dell'esperimento, attaccare la trappola a bolle, la sonda di temperatura e tutti i componenti a uso singolo. Per assemblare il filtro, rimuovere lo stantuffo da una siringa da un millilitro per renderlo un adattatore. Forzare il tubo dal flacone filtrante a questa estremità e attaccare un filtro da 2 micron al tubo che porta al pallone di crescita.
Applicare grasso sottovuoto in silicone intorno alla spina dell'adattatore di scorrimento prima di collegarlo, in quanto ciò aiuta a prevenire perdite d'aria nel sistema. Riempire il pallone di fissaggio con 100 millilitri di YPD e riempire il pallone in crescita con 200 millilitri di YPD. Assicurarsi che il tubo laterale verde raggiunga il supporto in ogni pallone.
Assicurarsi che tutte le valvole siano aperte. Attaccare la trappola a bolle a un vuoto e collegare la pompa al tubo laterale verde a valle della trappola a bolle. Pompare il fluido a una portata di 3,3 millilitri al minuto per riempire completamente il lato verde.
Quindi, erogare e scartare circa uno o due millilitri del supporto, perché i primi due millilitri spesso contengono cellule morte o detriti casuali. Assicurarsi che il lato verde del tubo sia riempito di supporti e non abbia bolle a valle della trappola a bolle prima di procedere. Riempire lo scivolo del canale e il serbatoio con YPD, facendo attenzione a non introdurre bolle.
Collegare la diapositiva all'apparato di flusso. Quindi pompare più fluido per creare un tampone di circa 5 metri sul lato arancione. Questo per evitare di intrappolare accidentalmente l'aria nello scivolo in caso di riflusso.
Ora, preparare l'apparato di flusso per il trasporto al microscopio piantando prima l'ingresso e l'uscita della trappola a bolle chiusa. Quindi bloccare le valvole del pallone di fissaggio laterali verdi e arancioni chiuse. Assicurarsi che i tappi a vite per lo smorzatore di pulsazione e il flacone del filtro siano stretti, in quanto possono allentare durante la placcatura automatica.
Scollegare la pompa dal tubo per facilitare il trasporto. Quindi spostare tutti i componenti, incluso l'agitatore a piastra calda, in un contenitore secondario vicino al microscopio. Attaccare la sonda di temperatura all'agitatore a piastra calda e iniziare a riscaldare il pallone di fissaggio a 37 gradi Celsius.
Mescolare il supporto a 300 giri/min e mantenerlo per l'intero esperimento. Montare la diapositiva al microscopio e, se necessario, utilizzare il nastro adesivo per fissarla saldamente. Quindi attaccare la trappola a bolle a un vuoto.
Ora, collegare la pompa all'apparato di flusso. Avviare la pompa a una portata di 3,3 millilitri al minuto e consentirgli di funzionare per circa cinque-10 secondi. Quindi, rimuovi la trappola per bolle nel clan dei coperchi let-out.
Lasciare che la pompa continui a funzionare mentre il pallone di fissaggio si riscalda. Una volta che il pallone di fissaggio e la camera di incubazione sono entrambi a 37 gradi Celsius, aggiungere abbastanza coltura notturna delle cellule fungine al pallone di fissaggio per raggiungere un milione di cellule per millilitro. Attendere 15 minuti per consentire alle celle di acclimatarsi.
Aprire le valvole del pallone di fissaggio laterali sia verdi che arancioni chiudendo entrambe le valvole del pallone di crescita per avviare il flusso delle celle. Attendere circa cinque minuti per consentire alle celle di raggiungere la diapositiva. Durante questo periodo, focalizzare il microscopio e regolarlo agli stessi parametri di imaging utilizzati negli esperimenti precedenti.
Iniziare l'acquisizione dell'immagine per la fase di attacco. Controllare dopo circa cinque e 10 minuti per assicurarsi che la messa a fuoco sia stata mantenuta. In caso meno, prova a regolare lo stato attivo immediatamente dopo l'acquisizione dell'immagine successiva.
Immediatamente dopo il termine della fase di attacco, salvare il file. Quindi aprire le valvole del pallone di crescita lato verde e arancione chiudendo entrambe le valvole del pallone di fissaggio. Fare attenzione a non urtare il palco se alcune valvole si trovano all'interno della camera di incubazione.
Scollegare la sonda termometrica e sostituire il pallone di fissaggio con il pallone di crescita. Ora, configura il software per acquisire un'immagine ogni 15 minuti in 22 ore e inizia l'acquisizione di immagini per la fase di crescita. Una volta terminata l'acquisizione della fase di crescita e salvato il file, aprire le valvole di fissaggio laterali verdi e arancioni, che possono fare rumore quando la pressione si rilascia sul lato arancione.
Tirare su sui tubi laterali verdi provenienti da entrambi i contenitori multimediali, fino a quando non sono almeno diversi centimetri sopra il supporto. Quindi, far funzionare la pompa ad alta velocità per rimuovere tutti i supporti dal tubo, il che rende la pulizia molto più semplice. Infine, quantifica i video come descritto nel protocollo di testo.
Questo video di microscopia a campo scuro time lapse mostra l'attaccamento di cellule albican di tipo selvaggio Candida al sottoflusso del substrato durante la fase di attacco, seguito dalla successiva crescita e sviluppo durante la fase di crescita che porta alla formazione di biofilm. I dati di questi video possono essere analizzati per i tassi di attacco cellulare e distacco e biomassa nel tempo, mostrati qui è la biomassa totale all'interno della regione di imaging come determinato dall'analisi densitometrica. Vengono mostrati anche il tasso cumulativo di attacco cellulare e la percentuale di distacco della biomassa nel tempo.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare le stesse condizioni di imaging in tutti gli esperimenti, in quanto ciò consente di effettuare confronti quantitativi tra di essi.
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Panoramica
Questo articolo descrive un apparato a flusso progettato per l'acquisizione in tempo reale di immagini della formazione di biofilm fungini in condizioni di flusso. Vengono inoltre discussi algoritmi quantitativi per l'analisi delle immagini acquisite.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microbiologia
- Ricerca sui biofilm
- Dinamica dei fluidi
Sfondo
- I biofilm fungini sono importanti in vari contesti ecologici e clinici.
- Comprendere come il flusso del fluido influisce sullo sviluppo del biofilm è fondamentale per la microbiologia.
- Le tecniche di imaging in tempo reale possono fornire informazioni sulle dinamiche del biofilm.
- L'analisi quantitativa delle immagini può migliorare la comprensione dei modelli di crescita del biofilm.
Scopo dello studio
- Valutare gli effetti del flusso del fluido sulla crescita del biofilm fungino.
- Fornire un metodo per l'osservazione in tempo reale della formazione del biofilm.
- Sviluppare algoritmi per l'analisi quantitativa dei dati di imaging.
Metodi Utilizzati
- Assemblaggio di un apparato a flusso per l'acquisizione di immagini.
- Collegamento di componenti come un trappola per bolle e una sonda di temperatura.
- Utilizzo di un sistema di filtrazione per gestire il flusso del fluido.
- Applicazione di algoritmi quantitativi sulle immagini acquisite.
Risultati principali
- L'apparato a flusso ha consentito con successo l'acquisizione di immagini della formazione di biofilm fungini.
- Dati in tempo reale hanno fornito informazioni sulla crescita del biofilm in condizioni di flusso variabili.
- Algoritmi quantitativi hanno permesso un'analisi dettagliata dello sviluppo del biofilm.
- Il metodo ha dimostrato vantaggi rispetto alle tecniche di imaging tradizionali.
Conclusioni
- L'apparato a flusso è efficace per lo studio dei biofilm fungini.
- L'analisi in tempo reale può avanzare significativamente la ricerca microbiologica.
- L'analisi quantitativa è essenziale per comprendere la dinamica dei biofilm.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Direttiva
Questo sistema consente una valutazione quantitativa in tempo reale della dinamica dei biofilm fungini in condizioni di flusso controllato, colmando una lacuna fondamentale nella modellizzazione delle interazioni ospite-patogeno sotto stress fisiologico da taglio. Fornendo dati cinetici sull'adesione e sul distacco, nonché misurazioni della biomassa, supporta un approccio meccanicistico per ridurre i rischi nella validazione di bersagli antifungini durante la fase scoperta preclinica. La progettazione economica e compatibile con il microscopio ne permette un'ampia adozione nei laboratori di scoperta per fenotipizzazione riproducibile dei biofilm.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo nel Settore Biofarmaceutico
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di come il flusso del fluido moduli l'adesione fungina e la formazione di biofilm, fornendo indicazioni sulla rilevanza degli bersagli nei modelli di infezione mucosale.
- Valore operativo: Fornisce letture quantitative in tempo reale dei tassi di adesione e distacco cellulare sotto sforzo di taglio, supportando lo screening ipotetico dei bersagli.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera dati temporali sulla biomassa e sul distacco mediante densitometria, consentendo il confronto quantitativo tra ceppi selvatici e mutanti in condizioni di flusso.
- Valore operativo: Compatibile con microscopi ottici standard, permettendo un'implementazione scalabile e a basso costo per campagne di screening di composti antifungini.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Simula le condizioni di flusso rilevanti per la candidiasi orofaringea, collegando i risultati ottenuti in vitro al comportamento clinico del biofilm sotto stress di taglio salivare.
- Valore operativo: Consente l'acquisizione longitudinale di immagini del biofilm (fino a 22 ore), permettendo l'analisi temporale dell'efficacia antifungina e dello sviluppo della resistenza.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
L'apparato si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione della proteina bersaglio all'ottimizzazione del composto leader, fornendo dati fenotipici adattati al flusso per ridurre i rischi associati alle proteine bersaglio prima dello screening dei composti.
- Biologia della scoperta: Supporta l'analisi meccanicistica dei percorsi di adesione e dei regolatori della formazione del biofilm in condizioni di flusso fisiologicamente rilevanti, chiarificando la funzione del bersaglio in contesti infettivi.
- Screening: Fornisce metriche quantitative standardizzate del biofilm (tasso di adesione, percentuale di distacco, biomassa nel tempo) per lo screening riproducibile di composti in condizioni dinamiche.
- Analisi: Permette la quantificazione della biomassa basata su densitometria e l'analisi cinetica di adesione/distacco, supportando la selezione dei candidati promettenti basata sui dati.
- Ricerca traslazionale: Riproduce stress di taglio rilevanti per l'ambiente umano nella mucosa orale, migliorando l'affidabilità predittiva dei modelli preclinici di biofilm nello sviluppo di antifungini.
- Riutilizzo aziendale: Progettato per un uso ripetuto grazie a componenti modulari, consentendo la standardizzazione tra laboratori e progetti che studiano l'adesione microbica in condizioni di flusso.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli bersagli antifungini collegando perturbazioni genetiche o farmacologiche a fenotipi di biofilm dipendenti dal flusso.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso portate standardizzate, condizioni di imaging e protocolli di analisi quantitativa uniformi tra esperimenti.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o abbandono fornendo precocemente dati sull'efficacia nei biofilm aggiustati per il flusso, riducendo i fallimenti tardivi dovuti a una scarsa rilevanza del bersaglio in ambienti ospite dinamici.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei candidati antifungini in base al rischio, sulla base delle prestazioni sotto stress di taglio, allineandosi alle nicchie cliniche di infezione.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze specifiche nell'allestimento microfluidico, nella tecnica asettica e nella microscopia a tempo-lapse per un funzionamento costante.
- Necessita di un microscopio ottico dotato di stabilizzazione del palchetto, controllo della temperatura (37°C) e pompa peristaltica in grado di garantire un flusso di 3,3 mL/min.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro dei parametri di acquisizione (messa a fuoco, illuminazione, intervallo di acquisizione) per permettere confronti quantitativi tra diverse prove.
- L'adattamento a specie diverse da Candida o a mezzi alternativi potrebbe richiedere un'ottimizzazione delle velocità di flusso e della chimica superficiale per prevenire occlusioni o bioincrostazioni.
- I limiti pratici includono una bassa produttività a causa della preparazione manuale dei vetrini e delle limitazioni nella zona di osservazione, rendendo la tecnica poco adatta allo screening primario ad alto rendimento, ma ideale per indagini meccanicistiche successive.
