Uso di risonanza paramagnetica elettronica in campioni biologici a temperatura ambiente e 77 K
11 gennaio 2019
Spettroscopia di risonanza paramagnetica elettronica (EPR) è un metodo univoco per misurare i radicali liberi. L'utilizzo di sonde di spin selettiva permette per la rilevazione dei radicali liberi in diversi compartimenti cellulari. Presentiamo un metodo pratico, efficiente per raccogliere campioni biologici che facilitano il trattamento, l'archiviazione e trasferire campioni per misure di EPR.
La segnalazione redox disregolata è implicata nella patogenesi di diverse malattie. Lo studio della biologia redox richiede il rilevamento accurato di specie reattive dell'ossigeno in diversi compartimenti cellulari e tissutali. La spettroscopia EPR è l'unico metodo che misura i radicali liberi in modo inequivocabile.
Questo protocollo dimostra un metodo pratico per la gestione e la conservazione di campioni biologici per la spettroscopia EPR. Questi protocolli illustrano l'uso di EPR e sonde di spin in due modelli rappresentativi. Anche se possono essere adattati per valutare le specie attive in altri contesti biologici.
La progettazione dell'esperimento e la manipolazione del campione sono fondamentali per la sua riproducibilità. Si consiglia di considerare la densità cellulare e garantire controlli adeguati e adeguati. Iniziare lavando delicatamente le cellule crude 264.7 con un millilitro di Krebs-Henseleit Buffer o KHB, per pozzo.
E trattare le cellule con 500 microlitri di KHB, integrati con 100 micromil di DTPA per pozzo. Per pretrattare con superossido dismutasi, aggiungere 15 microlitri di materiale superossido dismutasi, o veicolo, a ciascun pozzo e posizionare la piastra a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Al termine del pretrattamento della superossido dismutasi, aggiungere 12,5 microlitri di CMH millimolare e 40 microlitri di soluzione di lavoro PMA micromolare 125 ai pozzi appropriati e incubare a 37 gradi Celsius per 50 minuti.
Posizionare immediatamente le piastre sul ghiaccio e raccogliere il tampone da ogni pozzo in singoli tubi da 1,5 millilitri sul ghiaccio. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di KHB fresco più DTPA a ciascun pozzo e raschiare delicatamente le cellule dal fondo di ogni pozzo. Quindi rimospendare le sospensioni cellulari con pipettazione e trasferire le celle in singoli tubi da 1,5 millilitri sul ghiaccio.
Per il rilevamento del superossido a temperatura ambiente, caricare prima 50 microlitri di un tampone o di un campione cellulare in un tubo capillare e sigillare il tubo. Posizionare immediatamente il tubo nella risonanza paramagnetica elettronica, o EPR, spettrometro e impostare i parametri di acquisizione EPR per le misurazioni della temperatura ambiente. Testare sempre un campione vuoto di tampone contenente la stessa concentrazione di sonda trattata nelle stesse condizioni sperimentali di un controllo.
Per il rilevamento del superossido a 77 gradi Kelvin, caricare 150 microlitri di un campione in un pezzo da uno a due pollici di politetrafluoroetilene dritto, o PTFE, tubi, con un tappo di gomma ad un'estremità. Sigillare l'altra estremità del tubo con un secondo tappo e lampeggiare congelare il campione in azoto liquido. Quindi rimuovere rapidamente i tappi e posizionare il tubo PTFE in un criotubo etichettato per lo stoccaggio dell'azoto liquido.
Per le misurazioni dell'EPR, riempire il dewar delle dita dello spettrometro EPR con azoto liquido e posizionare i tubi PTFE contenenti il campione nell'azoto liquido. Posizionare il dewar delle dita nello spettrometro EPR e impostare i parametri di acquisizione EPR per le misurazioni a 77 gradi Kelvin. Per il rilevamento del ROS nel tessuto polmonare congelato, posizionare il tessuto sul ghiaccio secco e utilizzare una pinzetta per stabilizzare il tessuto congelato dal flash sul ghiaccio secco.
Tagliare il campione in cinque pezzi da 15 milligrammi e pesare i pezzi in un tubo tarato da 1,5 millilitri. Aggiungere 196 microlitri di KHB più DTPA e quattro microlitri di CMH al campione e incubare il campione polmonare per un'ora in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius prima di pellettare i frammenti di tessuto con una breve centrifugazione. Quindi posizionare il campione sul ghiaccio prima di trasferire 150 microlitri del supernatante in un pezzo di tubi PTFE per il congelamento flash in preparazione della misurazione EPR come appena dimostrato.
La valutazione della produzione totale di superossido in 264,7 cellule grezze stimolate con PMA come dimostrato, rivela che la concentrazione di nitroxide sia nella sospensione cellulare che nel tampone delle cellule trattate con PMA è simile, a causa della natura permeabile e del rapido equilibrio della sonda di spin. Il segnale dei radicali nitroxide aumenta nelle cellule grezze 264,7 stimolate con PMA, rispetto alle cellule di controllo, ma non nelle cellule pretrattate con superossido impermeabile cellulare dismutasi. Anche la concentrazione di nitroxide ottenuta a basse temperature in cellule grezze 264,7 dopo stimolazione con PMA è attenuata in presenza di superossido dismutasi coerente con i dati sulla temperatura ambiente.
La concentrazione di nitroxide è aumentata nel sangue e nel liquido di lavanda broncoalveolare dei topi bleo e dei topi trattati, nonché all'interno dei supernanti dei pezzi di tessuto polmonare raccolti da topi bleo e animali feriti, rispetto ai controlli trattati con PBS. Inoltre, dopo l'iniezione retro-orbitale della sonda di spin, i topi bleo e gli animali trattati dimostrano un segnale della sonda di spin più elevato rispetto ai controlli. Questi protocolli pratici consentiranno ai ricercatori di testare la produzione di radicali liberi in diversi compartimenti cellulari e campioni biologici da parte dell'EPR, comprese le misurazioni a bassa temperatura.
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Panoramica
Questo articolo presenta un metodo pratico per la raccolta e la manipolazione di campioni biologici per la spettroscopia di risonanza paramagnetica elettronica (EPR). L'EPR è una tecnica unica per la misurazione inequivocabile dei radicali liberi, che sono cruciali nella biologia redox.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia redox
- Spettroscopia di risonanza paramagnetica elettronica (EPR)
- Rilevamento di radicali liberi
Sfondo
- Un segnale redox disregolato è associato a varie malattie.
- La rilevazione accurata delle specie reattive dell'ossigeno è essenziale nella ricerca biologica.
- La spettroscopia EPR è l'unico metodo che fornisce misurazioni inequivocabili dei radicali liberi.
- Questo studio si concentra sui protocolli di manipolazione e conservazione dei campioni biologici.
Scopo dello studio
- Dimostrare un metodo pratico per la raccolta di campioni per la spettroscopia EPR.
- Illustrare l'uso di sonde a spin selettive in contesti biologici.
- Fornire protocolli adattabili a diversi modelli biologici.
Metodi Utilizzati
- Prelievo di campioni biologici per misurazioni di RPE.
- Uso di sonde di spin selettive per la rilevazione di radicali liberi.
- Protocolli per il trattamento e la conservazione dei campioni.
- Applicazione dei metodi in modelli biologici rappresentativi.
Risultati principali
- I protocolli facilitano in modo efficace la manipolazione e la conservazione dei campioni.
- La spettroscopia EPR fornisce misurazioni affidabili dei radicali liberi.
- I probe di spin possono essere adattati a diversi contesti biologici.
- Lo studio dimostra la versatilità dell'EPR nella biologia redox.
Conclusioni
- La spettroscopia EPR è uno strumento prezioso per lo studio dei radicali liberi.
- Una corretta manipolazione del campione è fondamentale per misurazioni accurate.
- I metodi presentati possono migliorare la ricerca in biologia redox.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il rilevamento accurato delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) è fondamentale per comprendere la segnalazione redox nei meccanismi delle malattie e nella validazione degli obiettivi. La spettroscopia di risonanza paramagnetica elettronica (EPR) fornisce una misurazione inequivocabile e diretta dei radicali liberi, consentendo la riduzione del rischio meccanicistico nelle fasi iniziali della scoperta. Questo metodo supporta la previsione affidabile permettendo la quantificazione delle ROS specifica per compartimento in modelli cellulari e tessutali, fornendo indicazioni per decisioni di avanzamento o interruzione nei programmi preclinici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche rilevando livelli fisiologici di specie specifiche di ROS con elevata specificità.
- Valore operativo: Distingue il superossido extracellulare da quello citosolico mediante sonde permeabili alle cellule e controlli con SOD, chiarificando il coinvolgimento delle vie metaboliche.
- Valore predittivo: Supporta la riduzione del rischio biologico attraverso misurazioni quantitative del superossido risolte per compartimento in modelli pertinenti per la malattia.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi mediante etichettatura standardizzata con sonde a spin e stabilizzazione del campione.
- Riproducibilità: Consente lo stoccaggio dei campioni a -80°C e l'analisi a 77 K, garantendo misurazioni EPR consistenti tra diversi lotti e siti.
- Scalabilità: Facilita la valutazione affidabile di composti permettendo il trasferimento e il riutilizzo di campioni congelati per schermate ad alto rendimento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Rileva il superossido in tessuto polmonare, sangue e fluido di lavaggio broncoalveolare provenienti da modelli di lesione, sostenendo l'allineamento del biomarcatore traslazionale.
- Continuità preclinica: Collega i risultati ottenuti in vitro a modelli in vivo attraverso identiche strategie di rilevamento del sonda spin (ad esempio, CPH, mito-TEMPO-H).
- Avanzamento basato sul rischio: Guida le decisioni di progressione confermando l'interazione con il bersaglio mediante modulazione delle ROS in contesti fisiopatologici rilevanti.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
La spettroscopia EPR si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio fino alla validazione preclinica, fornendo una conferma ortogonale degli effetti meccanicistici sul segnale redox.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi quantificando il superossido in compartimenti cellulari specifici mediante sonde spin selettive e controlli enzimatici.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio attraverso una preparazione riproducibile dei campioni e la criostoccaggio, consentendo letture costanti dei radicali liberi su librerie di composti.
- Analisi: Genera segnali nitroxidici quantitativi proporzionali alla concentrazione di superossido, permettendo il confronto tra condizioni e la valutazione della risposta dose-dipendente.
- Ricerca traslazionale: Collega la scoperta alla validazione preclinica rilevando le specie reattive dell'ossigeno (ROS) nei supernatanti dei tessuti prelevati e nei fluidi biologici provenienti da modelli di malattia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per il profilo redox in diversi ambiti terapeutici, riducendo lo sviluppo metodologico ridondante.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce una rilevazione inequivocabile dei radicali liberi, riducendo l'ambiguità meccanicistica nella validazione dei percorsi redox.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso la cinetica standardizzata dei sonde di spin, la gestione controllata dei campioni e la possibilità di effettuare misurazioni a basse temperature.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione progettuale fornendo evidenze dirette della modulazione dei ROS mediata dal bersaglio, riducendo l'insuccesso biologico in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione basata sul rischio confermando la fedeltà meccanicistica dei composti in sistemi pertinenti alla malattia.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in spettroscopia EPR e chimica dei sonde paramagnetiche per una corretta selezione delle sonde e interpretazione dei dati.
- Presuppone l'accesso a uno spettrometro EPR dotato di capacità per misurazioni sia a temperatura ambiente che a 77 K.
- Necessita di protocolli standardizzati per densità cellulare, tempi di incubazione e controlli abbinati al fine di garantire la comparabilità dei dati.
- Richiede considerazioni di adattamento per diversi sistemi modello (ad esempio, cellule in coltura vs. tessuto polmonare) riguardo al rilascio delle sonde e alla preparazione del tessuto.
- Comporta limitazioni pratiche, tra cui la necessità di tubazioni specializzate stabili a temperature criogeniche e un'attenta manipolazione per prevenire il degrado della sonda paramagnetica.
