Identificazione di eventi di ricombinazione omologa in cellule staminali embrionali del Mouse mediante Southern Blotting e reazione a catena della polimerasi
20 novembre 2018
Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per identificare gli eventi di ricombinazione omologa che si è verificato nelle cellule staminali embrionali del mouse usando macchiare del sud e/o PCR. Questo metodo è esemplificato dalla generazione di modelli di non muscolare miosina II sostituzione genetica del mouse utilizzando tradizionale embrionale basati su cellule staminali omologa ricombinazione mediata tecnologia di targeting.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia molecolare e cellulare, come l'identificazione di eventi di ricombinazione omologhi nelle cellule staminali embrionali del topo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è accurata, affidabile e ampiamente utilizzata. Quindi, questo metodo può fornire informazioni sull'identificazione di eventi di ricombinazione omologhi nelle cellule staminali embrionali del topo.
Può anche essere applicato ad altri sistemi, come le cellule o gli animali geneticamente modificati. In generale, l'individuo nuovo a questo metodo avrà difficoltà perché richiede molto tempo e comporta più passaggi. Per ogni gDNA, mescolare 30 microlitri di tampone 10 x per DRA uno, tre microlitri di DRA uno e 10 microgrammi di gDNA per campione.
Aggiungere acqua fino a quando il volume finale è di 30 microlitri e incubare a 37 gradi celsius durante la notte per digerire i gDNA. Preparare un gel di elettroforesi all'1%agarosio con bromuro di etidio. Caricare i campioni acquisiti in precedenza insieme a una scala da un KB sul gel e eseguirlo a 30-40 volt durante la notte.
Il giorno dopo, immergere il gel in un vassoio contenente una soluzione di acido cloridrico da 0,2 newton. Utilizzare uno shaker per scuotere delicatamente il vassoio per 20 minuti a temperatura ambiente. Trasferire il gel in un vassoio contenente una soluzione di denaturazione del DNA.
Agitare delicatamente per 20 minuti a temperatura ambiente. Quindi trasferire il gel in un vassoio contenente una soluzione neutralizzante del DNA. E agitare delicatamente per 20 minuti a temperatura ambiente.
Utilizzando un sistema di trasferimento rapido verso il basso, trasferire i DNA dal gel alla membrana. Quindi, assemblare il grondaio turble e la pila di gonfiore come indicato nelle istruzioni fornite dal produttore. Dopo questo, eseminare la membrana e lavarla con due x citrato di sodio salino per un minuto.
Assorbire il liquido con i tessuti, quindi utilizzare un crosslinker UV per collegare il DNA con la membrana. Per iniziare a etichettare le sonde del DNA con radioattività, aggiungere i DNA della sonda denaturati termicamente al tubo contenente le perline di etichettatura del DNA pronte all'ingannamento. Pipetta su e giù per mescolare.
E aggiungere cinque microlitri di trifosfato di deossicitodina etichettato radioattivamente. Incubare a 37 gradi celsius per 15 minuti. Purificare le sonde etichettate utilizzando colonne G 50 micro secondo le istruzioni fornite dal produttore.
Utilizzare un contatore di scintillazione per misurare la radioattività. Per iniziare ad ibridare le membrane con le sonde etichettate, posizionare la membrana nel tubo di ibridazione. Aggiungere la soluzione di pre ibridazione mista.
Posizionare il tubo nel forno di ibridazione e lasciare che la pre ibridazione proceda a 42 gradi celsius per 30 minuti. Quindi, rimuovere il tubo dal forno e versare la soluzione di pre ibridazione in un tubo da 50 millilitri. Aggiungere la sonda denaturata e mescolare delicatamente.
Per rimuovere le sonde non ibride, posizionare la membrana in un vassoio contenente un citrato di sodio salino X con 0,1%SDS e agitare delicatamente a 55-60 gradi celsius per 10 minuti. Successivamente, avvolgere la membrana con un involucro di plastica e fissarla nella cassetta di esposizione. In una stanza buia, esporre la membrana a due fogli di pellicola a raggi X.
Sviluppare il film per visualizzare i risultati. Determinare se un clone ES corrispondente è quello desiderato con il bersaglio della ricombinazione o meno, in base alle dimensioni delle bande di DNA rilevate dalle sonde. In questo studio, l'blotting meridionale e la PCR vengono utilizzati per identificare gli eventi HR che si verificano nelle cellule ES del mouse per la generazione di NM due modelli di topi sostitutivi genetici utilizzando la tecnologia di targeting mediato HR basata su cellule ES.
Poiché i DNA genomici sono tagliati in molti frammenti con lunghezze diverse, mostrano uno stato di striscio simile al gel del DNA. Questo suggerisce una digestione completa dei DNA genomici. Come fase finale dell'assorbimento meridionale, i segnali di una sonda etichettata radioattività ibridante con un frammento di DNA bersaglio sono mostrati sul film.
L'aspetto delle bande previste riflette l'occorrenza di eventi HR nei cloni ES. Secondo il predesign nello studio, i cloni ES con allele mutato hanno due bande di dimensioni distinte. Mentre i cloni ES di tipo selvaggio hanno una sola banda, suggerendo che i cloni ES desiderati siano eterozigoti.
A seguito della reazione PCR, i prodotti PCR possono essere analizzati sul gel del DNA. Se si osserva una specifica banda NPCR della dimensione corretta, ciò suggerisce il verificarsi di eventi HR che possono essere ulteriormente confermati sequenziando quella banda PCR. L'implicazione di questa tecnica si estese alla terapia di identificazione della mutazione puntino perché la fondazione è identica.
Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di essere pazienti e attenti. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la microiniezione della cellula ES in blastocsti al fine di rispondere a domande aggiuntive come la formazione di animali chimerici. A poppa del suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada al ricercatore nel loro campo della biologia molecolare e cellulare per esplorare la funzione di un gene specifico o la conseguenza di un gene mutato nei topi o oltre.
Non dimenticare che lavorare con l'etichettatore di radioattività P32 DCTB può essere estremamente pericoloso e precauzioni come la schermatura con scheda di protezione dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.
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Panoramica
In questo articolo viene presentato un protocollo dettagliato per l'identificazione di eventi di ricombinazione omologa in cellule staminali embrionali di topo mediante ibridazione Southern e PCR. Il metodo è illustrato attraverso la generazione di modelli murini con sostituzione genetica della miosina II non muscolare.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia Molecolare
- Biologia Cellulare
- Genetica
Sfondo
- La ricombinazione omologa è un processo fondamentale nell'ingegneria genetica.
- Le cellule staminali embrionali del topo sono ampiamente utilizzate negli studi genetici.
- Il Southern blotting e la PCR sono tecniche consolidate per l'analisi delle modifiche genetiche.
- Questo metodo può essere applicato a diversi sistemi geneticamente modificati.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo affidabile per l'identificazione di eventi di ricombinazione omologa.
- Dimostrare l'applicazione di questo metodo nella generazione di modelli genetici.
- Migliorare la comprensione delle tecniche di manipolazione genetica nelle cellule staminali.
Metodi Utilizzati
- Trasferimento Southern per la rilevazione di sequenze specifiche di DNA.
- PCR per l'amplificazione di regioni di DNA bersaglio.
- Preparazione dei campioni di DNA genomico per l'analisi.
- Protocollo passo dopo passo per l'esecuzione del metodo.
Risultati principali
- Identificazione con successo di eventi di ricombinazione omologa.
- Generazione di modelli murini di sostituzione genetica della miosina II non muscolare.
- Convalida dell'accuratezza e dell'affidabilità del metodo.
- Informazioni sull'applicazione di questa tecnica in altri sistemi.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce uno strumento prezioso per i ricercatori in biologia molecolare.
- Illustra l'efficacia delle tecniche tradizionali negli studi genetici moderni.
- Applicazioni future potrebbero estendersi a vari organismi geneticamente modificati.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
L'identificazione accurata degli eventi di ricombinazione omologa (HR) nelle cellule staminali embrionali murine è fondamentale per generare modelli genetici precisi e ridurre i rischi nei programmi di scoperta precoce. Il Southern blotting e la PCR offrono approcci complementari e validati per confermare le modifiche mirate del genoma, sostenendo una validazione del bersaglio ad alta affidabilità e ricerche traslazionali successive. Questi metodi permettono una selezione affidabile di cloni di cellule staminali embrionali per l'ingegneria genetica, influenzando direttamente l'efficienza e la prevedibilità della generazione di modelli preclinici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette una conferma precisa degli eventi di targeting genico, riducendo il rischio di effetti fuori bersaglio nei modelli ingegnerizzati.
- Supporta la validazione funzionale delle modifiche genetiche per una riduzione del rischio meccanicistica.
- Facilita la selezione sicura di cloni di cellule staminali embrionali per studi successivi, migliorando il valore predittivo.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce letture quantitative standardizzate per la verifica del genotipo in popolazioni di cellule staminali embrionali.
- Consente lo screening rapido basato sulla PCR per selezionare un elevato numero di cloni prima del conferma mediante Southern blotting.
- Supporta flussi di lavoro riproducibili per la generazione di sistemi biologici validati destinati allo sviluppo di saggi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Fornisce una conferma robusta del genotipo per modelli animali geneticamente modificati, sostenendo la continuità traslazionale.
- Si allinea a strategie basate su biomarcatori garantendo la fedeltà genetica nei sistemi preclinici.
- Riduce il rischio di variabili confondenti nello sviluppo di modelli pertinenti alle malattie.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
La rilevazione mediante Southern blotting e l'identificazione HR basata su PCR si collocano all'incrocio tra la fase iniziale della scoperta e la generazione di modelli preclinici, fungendo da ponte tra la validazione del bersaglio e la ricerca traslazionale.
- Biologia della scoperta: Conferma le modifiche genetiche mirate, sostenendo la ricerca basata su ipotesi e l'analisi dei percorsi biologici.
- Screening: Permette il triage PCR ad alto rendimento e la rigorosa conferma mediante Southern blot per una valutazione del genotipo riproducibile.
- Analisi: Fornisce schemi di bande quantitativi e discriminazione dimensionale per distinguere gli alleli wild-type, eterozigoti e modificati.
- Ricerca traslazionale: Garantisce l'accuratezza genetica nei modelli animali, supportando la verifica di ipotesi su biomarcatori e terapie.
- Riutilizzo aziendale: Offre un flusso di lavoro ampiamente applicabile e validato per l'identificazione del genotipo in diversi progetti di ingegneria genetica.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella fedeltà del modello genetico e nella validazione dell'obiettivo.
- Valore operativo: Standardizza l'identificazione del genotipo, consentendo la riproducibilità e la scalabilità tra i progetti.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o interruzione riducendo l'incertezza nella generazione del modello.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sul rischio delle iniziative di ingegneria genetica e l'allocazione delle risorse.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche di biologia molecolare e una progettazione accurata di sonde e primer.
- Richiede l'accesso a infrastrutture per elettroforesi, trasferimento su membrana e manipolazione di sostanze radioattive.
- Necessita di una rigorosa standardizzazione tra i gruppi di lavoro per ottenere risultati riproducibili.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diversi bersagli genici o sistemi modello.
- Il Southern blotting è un metodo laborioso e che richiede molto tempo, mentre la PCR può produrre falsi positivi che necessitano di analisi confermative.
