Analisi delle anomalie indotta da β-amiloide sulla struttura di coagulo di fibrina di spettroscopia e microscopia elettronica a scansione
30 novembre 2018
Presentato qui sono due metodi che possono essere utilizzati singolarmente o in combinazione per analizzare l'effetto di beta-amiloide sulla struttura del coagulo di fibrina. È incluso un protocollo per creazione di coagulo di fibrina in vitro , seguita da coagulo torbidità e microscopia elettronica di esame metodi.
Il vantaggio principale di questo saggio di torbidità a base di piastre è che è veloce e consente di modificare diversi inibitori dell'interazione amiloide-beta fibrinogeno contemporaneamente senza una configurazione o requisiti sofisticati. I composti della testa che si trovano nel test di torbidità della fibrina possono essere ulteriormente valutati per la loro capacità di ripristinare l'anomalia strutturale indotta da A-beta nei coaguli di fibrina analizzati mediante microscopia elettronica a scansione. La dimostrazione visiva della preparazione del coagulo per l'analisi della microscopia elettronica a scansione è fondamentale in quanto qualsiasi variazione nella preparazione può contribuire a variazioni all'interno dei risultati sperimentali.
Il focus di questa dimostrazione qui è sulle interazioni fibrinogene A-beta. Questo protocollo può essere facilmente modificato per analizzare altre interazioni con altre proteine e i composti con il coagulo di fibrina. Iniziare aggiungendo 1,5 micromolari di fibrinogeno appena preparato in 200 microlitri di tampone di formazione di coaguli a ciascun A-beta negativo 42 contenente e controllare i pozzi e incubare la piastra su una piattaforma rotante a temperatura ambiente.
Dopo 30 minuti aggiungere contemporaneamente 30 microlitri di soluzione di trombina appena preparata direttamente al centro del pozzo contenente fibrinogeni per avviare la formazione di coaguli e leggere immediatamente l'assorbanza dei coaguli in vitro a 350 nanometri, ripetendo la misurazione ogni 30-60 secondi nel corso di 10 minuti. Per valutare l'effetto degli inibitori dell'interazione del fibrinogeno A-beta sulla struttura del coagulo di fibrina, utilizzare prima le forcep per posizionare una copertura del cerchio di vetro siliconizzata pulita da 12 millimetri scivola sui singoli pozzi di una piastra di 12 pozzi e aggiungere 80 microlitri di fibrinogeno su ogni slittamento di copertura, diffondendo delicatamente la soluzione in modo che siano distribuiti uniformemente. Aggiungere 20 microlitri di soluzione di trombina ad ogni pozzo per iniziare la formazione di coaguli.
Coprire la piastra per un'incubazione da 30 a 60 minuti a temperatura ambiente, quindi immergere delicatamente ogni coagulo in due millilitri di tampone di cacodilato di sodio ghiacciato per due minuti, coperto, a temperatura ambiente due volte, utilizzando una pipetta millilitro per rimuovere con cura il tampone dopo ogni lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, controllare lo stato della formazione di coaguli sullo scivolo di copertura e fissare i coaguli in due o tre millilitri di glutaraldeide ghiacciata al 2% sul ghiaccio per 30 minuti. Alla fine dell'incubazione, rimuovere delicatamente la glutaraldeide da ogni pozzo e lavare i coaguli con tampone di cacodilato di sodio fresco come dimostrato sul ghiaccio.
Idratare i coaguli fissi in una serie graduata di lavaggi di etanolo ghiacciato di cinque minuti sul ghiaccio senza rimuovere completamente l'etanolo tra i lavaggi per mantenere i coaguli protetti dall'esposizione all'aria. Durante l'ultimo lavaggio al 100% di etanolo, trasferire il coperchio scivola in un supporto critico per campioni di essiccatore a punti, posizionando almeno 1 rondella tra ogni slittamento del coperchio e posizionare il supporto in una camera di essiccazione a punti critici riempita di etanolo. Dopo un ciclo di asciugatura di 30 minuti, utilizzare il nastro di carbonio per montare i coperchi sui singoli stub di microscopia elettronica a scansione e trasferire i campioni nella camera di rivestimento dello sputter di un rivestimento dello sputter sottovuoto.
Quindi lo sputter rivestire meno di 20 nanometri di palladio d'oro o altri materiali conduttivi sui campioni per 25 secondi a quattro angstrom al secondo e immaginiamo i campioni su un microscopio elettronico a scansione dotato di un rivelatore di elettroni secondari di tipo due a quattro kilovolt. La formazione di coaguli di fibrina provoca la dispersione della luce che passa attraverso la soluzione, con conseguente aumento della torbidità che si altiva alla fine del periodo di lettura. Quando il fibrinogeno viene incubato in presenza di A-beta 42 la torbidità della soluzione diminuisce con la curva che raggiunge un'altezza massima di circa la metà di quella del solo fibrinogeno.
In presenza di un blocco di interazione A-beta 42 l'effetto della beta-amiloide viene migliorato e la torbidità è superiore a quella con solo A-beta. L'effetto del bloccante non appare a causa della torbidità dello sfondo in quanto il composto non cambia la torbidità del coagulo di fibrina quando A-beta è assente. Inoltre, la formazione di coaguli in presenza di GPRP, un peptide noto per interferire con la polimerizzazione della fibrina, dimostra una torbidità significativamente ridotta rispetto alla formazione di coaguli di fibrina in assenza dell'inibitore.
Il fibrinogeno generato in presenza di trombina e cloruro di calcio forma solo una rete di fibrina con fili allungati e intercalati di fibrina e fasci più grandi. Quando è presente L'A-beta, i fili di fibrina sono diventati più sottili con diversi grumi appiccicosi negli aggregati, indicando anomalie strutturali indotte da A-beta. Coerentemente con i risultati del test di torbidità, la formazione di coaguli in presenza di un bloccante di interazione fibrinogeno A-beta ripristina parzialmente la struttura del coagulo di fibrina dai cambiamenti indotti da A-beta man mano che si osservano meno grumi con questo trattamento.
Il test di torbidità del coagulo e i protocolli di analisi del microscopio elettronico a scansione sono stati ottimizzati per valutare diversi inibitori dell'interazione fibrinogeno A-beta in modo rapido e riproducibile. E presto i dati forniranno preziose informazioni sulla formazione di coaguli di fibrina che possono essere applicati a ulteriori studi sia in vitro che in vivo.
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Panoramica
In questo articolo vengono presentati metodi per analizzare l'effetto del beta-amiloide sulla struttura del coagulo di fibrina, inclusi un protocollo in vitro per la formazione del coagulo di fibrina e metodi per la torbidimetria del coagulo e la microscopia elettronica a scansione.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Chimica biochimica
- Biologia cellulare
Sfondo
- Il beta-amiloide è implicato nelle malattie neurodegenerative.
- I coaguli di fibrina svolgono un ruolo in diversi processi biologici.
- Comprendere la struttura dei coaguli di fibrina può fornire informazioni sui meccanismi delle malattie.
- Studi precedenti hanno mostrato anomalie strutturali nei coaguli di fibrina indotte dall'A-beta.
Scopo dello studio
- Valutare l'effetto del beta-amiloide sulla struttura del coagulo di fibrina.
- Esaminare inibitori delle interazioni tra amiloide-beta e fibrinogeno.
- Illustrare la preparazione dei coaguli per l'analisi mediante microscopia elettronica a scansione.
Metodi Utilizzati
- Saggio di turbidità basato su piastra per lo screening rapido.
- Preparazione di coaguli di fibrina in vitro utilizzando fibrinogeno.
- Microscopia elettronica a scansione per analizzare la struttura del coagulo.
- Modifica dei protocolli per lo studio di altre interazioni proteiche.
Risultati principali
- Identificazione di composti principali che ripristinano l'integrità strutturale.
- La dimostrazione visiva della preparazione del coagulo è fondamentale per garantire coerenza.
- Le variazioni nella preparazione possono influenzare i risultati sperimentali.
- Potenziale per applicazioni più ampie nello studio delle interazioni proteiche.
Conclusioni
- I metodi presentati sono efficaci per analizzare la struttura del coagulo di fibrina.
- Lo screening degli inibitori può portare a nuove intuizioni sulle strategie terapeutiche.
- Ulteriori ricerche possono approfondire le interazioni con altre proteine.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente uno screening rapido e riproducibile di inibitori dell'interazione tra amiloide-beta e fibrinogeno mediante un saggio di torbidità basato su piastre, supportando la validazione precoce del bersaglio nello sviluppo di terapie per la malattia di Alzheimer. Il metodo fornisce dati quantitativi sulla formazione del coagulo e una conferma strutturale tramite microscopia elettronica a scansione, facilitando il passaggio da "hit" a "lead" per composti in grado di migliorare le anomalie del coagulo di fibrina indotte dall'A-beta. Integrando letture di torbidità con immagini al SEM, l'approccio offre una riduzione del rischio meccanicistica e una maggiore affidabilità predittiva per programmi di scoperta mirati al sistema neurovascolare.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica l'ipotesi terapeutica secondo cui l'interazione tra A-beta e fibrinogeno induce la formazione patologica di coaguli nell'Alzheimer.
- Valore operativo: Permette la validazione funzionale dell'obiettivo misurando la torbidità del coagulo come indicatore diretto dell'inibizione del legame tra A-beta e fibrinogeno.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio identificando composti in grado di ripristinare una struttura normale del coagulo di fibrina, indicando il legame all'obiettivo e la riduzione del rischio biologico.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Il saggio di torbidità ottimizzato è rapido, altamente riproducibile e compatibile con formati a piastre multipozzetto per lo screening di ampie librerie di composti.
- Output quantitativo: Misura l'assorbanza a 350 nm nel tempo, fornendo dati cinetici sulla formazione del coagulo che distinguono l'efficacia dell'inibitore dagli effetti di fondo.
- Conferma strutturale: I composti attivi identificati mediante lo screening della torbidità vengono convalidati utilizzando la SEM per visualizzare il ripristino dell'architettura del coagulo di fibrina, assicurando che i risultati positivi non siano artefatti del saggio.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la Malattia: Modella un meccanismo cerebrovascolare della patologia di Alzheimer, collegando l'A-beta ad anomalie dei coaguli di fibrina associate a microinfarti e angiopatia amiloide cerebrale.
- Continuità Traducibile: Collega l'interazione con il bersaglio in vitro (turbidità) alla struttura fenotipica del coagulo (SEM), supportando una riduzione del rischio meccanicistica prima della validazione in vivo.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Permette decisioni di avanzamento o interruzione basate su due criteri: inibizione del ritardo nella formazione del coagulo e correzione delle anomalie strutturali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso iniziale della scoperta, consentendo la verifica dell'ipotesi sull'interazione tra A-beta e fibrinogeno come bersaglio farmacologico, con risultati che alimentano i flussi di lavoro di identificazione del capostazione e di validazione preclinica.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi quantificando come l'A-beta alteri la torbidità e la struttura del coagulo di fibrina, chiarificando il coinvolgimento delle vie nella disfunzione neurovascolare.
- Screening: Garantisce prontezza e riproducibilità del saggio per la valutazione ad alto rendimento di inibitori dell'interazione A-beta-fibrinogeno in formato piastra a 96 pozzetti.
- Analisi: Fornisce parametri cinetici della torbidità e metriche strutturali basate su SEM che consentono l'analisi comparativa degli effetti dei composti sulla formazione e sull'architettura del coagulo.
- Ricerca traslazionale: Collega l'inibizione del bersaglio al ripristino fenotipico del coagulo, in linea con la continuità preclinica nei modelli di Alzheimer neurovascolari.
- Riutilizzo aziendale: Il flusso di lavoro basato su torbidità e SEM è una piattaforma riutilizzabile applicabile ad altre interazioni proteina-fibrinogeno oltre all'A-beta, sostenendo ampi sforzi di validazione dei bersagli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce un livello predittivo di affidabilità collegando l'inibizione biochimica al recupero strutturale del coagulo, riducendo l'ambiguità meccanicistica nella validazione del bersaglio.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità attraverso protocolli ottimizzati di preparazione, lavaggio, fissazione e acquisizione delle immagini del coagulo.
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento o interruzione del progetto richiedendo una validazione sia funzionale (turbidimetria) che strutturale (SEM), riducendo il rischio biologico nelle fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio di inibitori che dimostrano una correzione duplice del ritardo nella formazione del coagulo e della patologia strutturale.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze nella preparazione delle proteine, nei saggi di formazione del coagulo e nella preparazione dei campioni per microscopia elettronica a scansione.
- Richiede l'accesso a un lettore di piastre in grado di effettuare misurazioni cinetiche dell'assorbanza a 350 nm e a un apparecchio per la deposizione in vuoto con capacità di imaging al SEM.
- Necessita della standardizzazione dei passaggi di fissazione, disidratazione e essiccazione del coagulo per evitare artefatti strutturali che potrebbero compromettere l'interpretazione al microscopio elettronico a scansione.
- Comporta la necessità di adattamenti qualora il protocollo venga esteso ad altre interazioni proteina-fibrinogeno, in particolare per quanto riguarda la composizione del buffer e i tempi di incubazione.
- Presenta limitazioni pratiche, come la necessità di preparare i reagenti freschi e di manipolarli con attenzione per prevenire variabilità del coagulo dovuta all'esposizione all'aria o a lavaggi non uniformi.
