Name: Un modello In Vitro di un sistema di perfusione di piatti paralleli per studiare laderenza batterica per linnesto di tessuti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Scopri un modello in vitro di camera a flusso per studiare l'aderenza batterica ai tessuti di innesto. Questo metodo aiuta a comprendere la patogenesi dell'endocardite infettiva e le interazioni molecolari coinvolte.

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Questo studio è stato sponsorizzato da un grant di ricerca fondo KU Leuven (OT/14/097) dato a RH. TRV è stato borsista della Fondazione di ricerca FWO - Flanders (Belgio; Concedere il numero - 12K0916N) e RH è supportato dalla clinica ricerca fondo di UZ Lovanio.

1. preparazione dell'innesto tessuti per studi In Vitro
Nota: Sono stati utilizzati tre tipi di tessuti: innesti crioconservati omotrapianto (CH) e la vena giugulare bovina (BJV), patch di pericardio bovino (BP). In caso di BJV conduit e CH (tessuto trattati da Banca europea di omotrapianto (EHB) e conservati in azoto liquido prima dell'uso), sono stati utilizzati valvolari sia a parete. Patch di BP e BJV condotto sono stati acquistati dai produttori. Prima dell'uso, scongelare il CH seguendo le istruzioni di EHB12.
<ol><li>Lavare tutti i tessuti con NaCl 0,9% prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare le biopsie del tessuto utilizzando una biopsia della pelle monouso pugno per tagliare pezzi di tessuto circolare (diametro 10 mm).</li>
	<li>Tagliare tutte le patch di tessuto alla stessa altezza utilizzando il bisturi sterile monouso.</li>
	<li>Per i tessuti fissati con glutaraldeide (ad esempio conduit BJV), incubare innesto pezzi durante la notte a 4 ° C a 200 g/L di albumina umana per neutralizzare il fissativo.</li>
	<li>Lavare residui di glutaraldeide con 0,9% NaCl in micropiastra.  Ripetere 3 volte per 1 minuto.</li>
</ol>2. preparare i batteri per esperimenti di perfusione
Nota: Tre isolati batterici sono stati utilizzati: S. aureus Cowan (ATCC 12598), s. epidermidis ATCC 149900 e S. sanguinis NCTC 7864. S. aureus e S. epidermidis sono state coltivate a 37 ° C in brodo di soia triptico (TSB) e S. sanguinis era cresciuta a 37 ° C con 5% CO2 in brodo di cervello cuore infusione (BHI).
<ol><li>Preparare una notte cultura di batteri su una piastra di agar sangue solido.<ol>
<li>Utilizzare un'ansa sterile per raschiare i batteri congelati e inoculare su una piastra di agar sangue di Mueller-Hinton per cultura durante la notte a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzare un ciclo di inoculazione sterile per prendere una singola Colonia dalla coltura agar-sangue durante la notte e inoculare in 10 mL di TSB o BHI in un tubo da 14 mL e cultura durante la notte a 37 ° C.</li>
	<li>Centrifugare il pernottamento culture (3000 x g, 4 ° C, 10 min) e risospendere il pellet in 10 mL di tampone fosfato salino (PBS). Inserire le provette mL 14 sul ghiaccio.</li>
	<li>Un'aliquota di 3,7 mg/mL di soluzione di 5 (6) - carbossi - fluorescina N-idrossi-succinimidyl ester (CF) in etanolo di preparare e conservare a-20 ° C. Diluire ulteriormente il brodo del CF a 150 µ g/mL utilizzando 'ultrapura' acqua. Nota: Proteggere tubi dalla luce utilizzando il foglio di alluminio e conservare a-20 ° C.</li>
	<li>Centrifugare i batteri (3000 x g, 4 ° C, 10 min) e risospendere il pellet in 800 µ l di PBS e aggiungere 200 µ l della soluzione CF 150 µ g/mL (concentrazione finale di 30 µ g/mL, usato per esperimenti di perfusione). Proteggere i tubi dalla luce con carta stagnola e incubare per 30 minuti, utilizzando un agitatore orbitale.</li>
	<li>Dopo l'etichettatura, bloccare con 2% di soluzione di albumina di siero bovino (BSA) in PBS e spin (3000 x g, 4 ° C, 10 min). Seguire con un passaggio di lavaggio utilizzando 10 mL di PBS e pellet batteri mediante centrifugazione (3000 x g, 4 ° C, 10 min).</li>
	<li>Diluire i batteri con PBS per ottenere 107 unità formanti colonie (CFU) /mL (verificato CFU contando su piastre di agar sangue di Mueller-Hinton), che corrisponde ad un OD600 (densità ottica) pari a 0,65. Mantenere le provette nel buio sul ghiaccio prima di esperimenti di perfusione. Nota. Tenete a mente che misure600 OD riflettono il numero approssimativo dei batteri. Per contare la dose efficace inoculazione, il metodo di diluizione seriale è un ulteriore passaggio necessario per verificare il diametro esterno basato su numeri come descritto nella sezione 3.8.</li>
</ol>3. in vitro gli esperimenti di perfusione utilizzando una camera di flusso parallelo-piastra
<ol><li>Montare le biopsie del tessuto di 10 mm di diametro e lo stesso spessore (preparato nei passaggi 1.1-1.5) in un sistema di flusso dell'alloggiamento con la superficie interna rivolta verso l'alto per entrare in contatto con la sospensione batterica. Nota: Lo stesso spessore del tessuto attraverso vari innesti assicura che la stessa altezza del tessuto è raggiunto nel canale permettendo a flusso laminare in tutte le condizioni. Tutti gli elementi della camera del flusso sono presentati e descritti nella Figura 1.<ol>
<li>Per iniziare il protocollo, posizionare il pezzo di tessuto rotondo tra un vetrino da microscopio con una perforazione circolare di 8 mm e una guarnizione in gomma. Nota: Il vetrino da microscopio possiede il film ultra-sottile inferiore per consentire la generazione del foro 8 mm. Insieme con il foglio di gomma, si corregge il tessuto per consentire il contatto diretto tra il campione e mezzo fluente e impedisce anche la dislocazione della biopsia durante l'esperimento. La superficie del tessuto oggetto dell'inchiesta, che è esposto al flusso (diametro inferiore) non può essere manipolata dal forcipe.</li>
		<li>Inserire il supporto con il tessuto il foglio di guarnizione che è incorporato nel frame inferiore in metallo della camera.</li>
		<li>Fissare il telaio di metallo superiore con il corrispondente foglio di guarnizione sulla parte inferiore della camera con il portarotolo inserite in precedenza. Successivamente montare l'intera camera con otto viti ed avvitare i dadi. Assicurarsi che l'altezza della camera è sempre lo stesso da altra parte gli innesti. Nota: L'altezza della camera dovrebbe essere determinato sempre al momento di serraggio delle viti. Utilizzare una pinza o un righello.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Collegare la camera di flusso con una pompa peristaltica e il serbatoio del liquido con i tubi.</li>
	<li>Irrorare i tessuti con sospensioni di 107 CFU/mL (verificato CFU contando e legate alla OD600 misurazioni) fluorescente-identificati batteri in PBS con una sollecitazione di taglio di 3 dyne/cm2 (dyne per centimetro quadrato unità di pressione) da mezzi della pompa peristaltica (portata: 4 mL/min) per 1h facendo uso di un serbatoio batterica 400 mL (in-House design, Figura 1) condizionato a 37 ° C, utilizzando un termostato piastra (Tabella materiali).</li>
	<li>Continuamente ricircolare la sospensione batterica 100ml utilizzando il serbatoio di raccolta stesso.</li>
	<li>Dopo aspersione, smontare la camera per rilasciare la protesi e lavare il pezzo di tessuto due volte con 4 mL di PBS in un piatto di 12-pozzetti utilizzando l'agitatore orbitale di laboratorio per 3 minuti ciascuno. Successivamente tagliare la parte interna dell'innesto usando una biopsia della pelle punzone di un diametro inferiore.</li>
	<li>Posizionare ogni biopsia del tessuto in un tubo separato 14 mL contenente 1 mL di sterile 0,9% NaCl. Etichettare la provetta come #1.</li>
	<li>Staccare i batteri dal tessuto usando un bagno di sonicazione per 10 min (ampiezza = 100% e frequenza = 45 kHz). Nota: Completo distacco dei batteri dal tessuto innesti dovrebbero essere valutati sopra incubazione di patch durante la notte a 37 ° C in mezzo liquido TSB, seguita da misure600 OD rispetto per controllare le patch trattate con una soluzione gratuita di batteri.</li>
	<li>Utilizzare un metodo di diluizione seriale su piastre di agar sangue di Mueller-Hinton per contare CFUs.<ol>
<li>Preparare una provetta singola 14 mL con 10 mL di soluzione fisiologica sterile per effettuare diluizioni seriali della sospensione batterica ottenuta dopo sonicazione. Etichettare questo tubo come #2. Nota: Per ogni un provetta esperimento di tessuto con 10 mL di 0,9% NaCl è necessaria.</li>
		<li>Preparare tre provette di 14 mL con 10 mL di sterile 0,9% NaCl per diluizioni seriali di sospensione batterica iniziale dal punto 2.7. Etichettare le provette come segue #3, #4, #5. Nota: Questo passaggio è necessario conoscere il reale numero CFU in sospensione batterica utilizzato per l'esperimento di aspersione.</li>
		<li>Vortice mescolare ogni tubo per 15 s. Vortex le provette con la biopsia del tessuto, nonché la sospensione batterica iniziale per effettuare diluizioni seriali.</li>
		<li>Preparare tre piastre di agar, due per l'esperimento di tessuto (aspersione di batteri e aspersione di controllo di PBS) e la terza per la sospensione batterica iniziale utilizzata per le aspersioni.</li>
		<li>Etichetta tre settori per piastra per l'esperimento di tessuto nel seguente modo 10-1, 10-3 e 10-4. Per contare il numero di CFU nella perfusati batterica, la targhetta di etichettatura come segue: 10-1, 10-3, 10-5 e 10-7. Nota: Tutte le indicazioni sull'agar piastre come 10-1, 10-3 e così via si riferiscono al numero finale di CFU/mL calcolato il giorno successivo. Piastra di controllo non richiede tutti i settori. Prima dell'uso, piastre di agar sangue dovrebbero essere posto sotto la cappa laminare e aperto per rimuovere l'umidità in eccesso.</li>
		<li>Per continuare la preparazione delle diluizioni seriali, trasferire 100 µ l di filmato #1 filmato #2 e mescolare energicamente con vortice.</li>
		<li>Sviluppa 100 µ l del contenuto del filmato #1 e #2 sui corrispondenti settori 10-1 e 10-3 della piastra di agar. Allo stesso modo, diffondere 10 µ l di filmato #2 sul settore 10-4, ripetere questo passaggio 4 volte per ottenere 4 crescite separate da ogni volume di 10 µ l. Nota: A causa del piccolo volume usato per la placcatura sul settore 10-4, si consiglia di avere più numero di goccioline di effettuare un numero medio di CFUs coltivati.</li>
		<li>Per preparare le diluizioni seriali della cultura iniziale, trasferire 100 µ l di sospensione batterica da passo 2.7 in provetta #3 e mescolare energicamente con vortice. Aggiungere 100 µ l del tubo #3 al tubo #4 e mescolare bene, ripetere la procedura per successiva tubo #5.</li>
		<li>Stendere 100 µ l del contenuto delle provette #3, #4, #5 e la sospensione batterica regolata (punto 2.7), rispettivamente, su settori 10-3, 10-5, 10-7 e 10-1 della piastra di agar sangue.</li>
		<li>Lasciare le piastre di agar sangue nella cappa laminare di aria secca gli spread batterici, in genere per 10 minuti. In seguito, è possibile posizionare le piastre a 37 ° C per l'incubazione durante la notte.</li>
		<li>Dopo una notte di incubazione, contare le colonie batteriche per ottenere il numero di CFU derivanti dall'adesione per le biopsie del tessuto così come CFU/mL della sospensione batterica iniziale usato per l'aspersione. Esprimere i risultati come CFU/cm2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. fluorescenza microscopia di batteri aderiti all'innesto di tessuti all'aspersione
<ol><li>Dopo aspersione, lavare i pezzi di tessuto con PBS (Vedi punto 3.5) e tagliare la parte interna di un innesto usando un punzone di un diametro inferiore.</li>
	<li>Preparare una piastra a 6 pozzetti e posizionare le gocce di mezzo di montaggio (Tabella materiali).</li>
	<li>Posizionare ogni pezzo di tessuto irrorato dalla superficie verso il basso su una sola goccia di mezzo di montaggio.</li>
	<li>Leggere una piastra utilizzando uno scanner di fluorescenza (Tabella materiali). Impostare i parametri delle lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione secondo un fluoroforo utilizzato per etichettare batterica.</li>
</ol>

<ol><li>Que, Y. A., Moreillon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infective+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Infective endocarditis.</a> Nature Reviews Cardiology. 8 (6), 322-336 (2011).</li>
<li>Werdan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+infective+endocarditis%3A+pathogen-host+interaction+and+risk+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of infective endocarditis: pathogen-host interaction and risk states.</a> Nature Reviews Cardiology. 11 (1), 35-50 (2014).</li>
<li>Moreillon, P., Que, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infective+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Infective endocarditis.</a> The Lancet. 363 (9403), 139-149 (2004).</li>
<li>Jalal, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+propensity+of+bovine+jugular+vein+material+to+bacterial+adhesions%3A+An+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Selective propensity of bovine jugular vein material to bacterial adhesions: An in vitro study.</a> International Journal of Cardiology. 198, 201-205 (2015).</li>
<li>Sharma, A., Cote, A. T., Hosking, M. C. K., Harris, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Systematic+Review+of+Infective+Endocarditis+in+Patients+With+Bovine+Jugular+Vein+Valves+Compared+With+Other+Valve+Types%5BTitle%5D)+AND+%22JACC+Cardiovascular+Interventions%22%5BJournal%5D)">A Systematic Review of Infective Endocarditis in Patients With Bovine Jugular Vein Valves Compared With Other Valve Types.</a> JACC Cardiovascular Interventions. 10 (14), 1449-1458 (2017).</li>
<li>Malekzadeh-Milani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+and+predictors+of+Melody%28R%29+valve+endocarditis%3A+a+prospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Cardiovascular+Diseases%22%5BJournal%5D)">Incidence and predictors of Melody(R) valve endocarditis: a prospective study.</a> Archives of Cardiovascular Diseases. 108 (2), 97-106 (2015).</li>
<li>Hill, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+prosthetic+valve+infective+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Management of prosthetic valve infective endocarditis.</a> American Journal of Cardiology. 101 (8), 1174-1178 (2008).</li>
<li>Claes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clumping+factor+A%2C+von+Willebrand+factor-binding+protein+and+von+Willebrand+factor+anchor+Staphylococcus+aureus+to+the+vessel+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Clumping factor A, von Willebrand factor-binding protein and von Willebrand factor anchor Staphylococcus aureus to the vessel wall.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (5), 1009-1019 (2017).</li>
<li>Fowler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+invasion+by+Staphylococcus+aureus+involves+a+fibronectin+bridge+between+the+bacterial+fibronectin-binding+MSCRAMMs+and+host+cell+beta1+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins.</a> European Journal of Cell Biology. 79 (10), 672-679 (2000).</li>
<li>Patti, J. M., Hook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+adhesins+recognizing+extracellular+matrix+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microbial adhesins recognizing extracellular matrix macromolecules.</a> Current Opinion in Cell Biology. 6 (5), 752-758 (1994).</li>
<li>Massey, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin-binding+protein+A+of+Staphylococcus+aureus+has+multiple%2C+substituting%2C+binding+regions+that+mediate+adherence+to+fibronectin+and+invasion+of+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fibronectin-binding protein A of Staphylococcus aureus has multiple, substituting, binding regions that mediate adherence to fibronectin and invasion of endothelial cells.</a> Cellular Microbiology. 3 (12), 839-851 (2001).</li>
<li>Jashari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Belgian+and+European+experience+with+the+European+Homograft+Bank+%28EHB%29+cryopreserved+allograft+valves--assessment+of+a+20+year+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Chirurgica+Belgica%22%5BJournal%5D)">Belgian and European experience with the European Homograft Bank (EHB) cryopreserved allograft valves--assessment of a 20 year activity.</a> Acta Chirurgica Belgica. 110 (3), 280-290 (2010).</li>
<li>Cheatham, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+hemodynamic+outcomes+up+to+7+years+after+transcatheter+pulmonary+valve+replacement+in+the+US+melody+valve+investigational+device+exemption+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Clinical and hemodynamic outcomes up to 7 years after transcatheter pulmonary valve replacement in the US melody valve investigational device exemption trial.</a> Circulation. 131 (22), 1960-1970 (2015).</li>
<li>Que, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinogen+and+fibronectin+binding+cooperate+for+valve+infection+and+invasion+in+Staphylococcus+aureus+experimental+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fibrinogen and fibronectin binding cooperate for valve infection and invasion in Staphylococcus aureus experimental endocarditis.</a> The Journal of Experimental Medicine. 201 (10), 1627-1635 (2005).</li>
<li>Veloso, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+adherence+to+graft+tissues+in+static+and+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Bacterial adherence to graft tissues in static and flow conditions.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (1), 325-332 (2018).</li>
<li>Liesenborghs, L., Verhamme, P., Vanassche, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus%2C+master+manipulator+of+the+human+hemostatic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus, master manipulator of the human hemostatic system.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (3), 441-454 (2018).</li>
<li>Chiu, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+increases+ICAM-1+and+decreases+VCAM-1+and+E-selectin+expressions+induced+by+tumor+necrosis+factor-%5Balpha%5D+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Artheriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Shear stress increases ICAM-1 and decreases VCAM-1 and E-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells.</a> Artheriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (1), 73-79 (2004).</li>
<li>Jockenhoevel, S., Zund, G., Hoerstrup, S. P., Schnell, A., Turina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+tissue+engineering%3A+a+new+laminar+flow+chamber+for+in+vitro+improvement+of+mechanical+tissue+properties%5BTitle%5D)+AND+%22ASAIO+Journal%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular tissue engineering: a new laminar flow chamber for in vitro improvement of mechanical tissue properties.</a> ASAIO Journal. 48 (1), 8-11 (2002).</li>
<li>Veltrop, M. H. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Species-+and+Strain-Dependent+Induction+of+Tissue+Factor+in+Human+Vascular+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Bacterial Species- and Strain-Dependent Induction of Tissue Factor in Human Vascular Endothelial Cells.</a> Infection and Immunity. 67 (11), 6130-6138 (1999).</li>
</ol>

Le osservazioni cliniche recenti dare consapevolezza speciale a IE come complicazione in pazienti sottoposti a sostituzione della valvola del RVOT6,13. Disfunzione della valvola impiantata in IE è il risultato dell'interazione batterica con l'innesto di endovascular che conduce al vasto infiammatorio e procoagulante reazioni1,14. Il modello presentato romanzo in vitro ci ha permesso di indagare s...

Staphylococcus aureus (S. aureus) impiega una varietà di strategie di virulenza di aggirare il sistema di difesa immunitaria ospite colonizzando superfici biologiche o non biologici impiantate nella circolazione umana, che porta a gravi infezioni intravascolari come sepsi e IE1,2,3,4,5. Resti di IE un importante trattamento complicanze nei pazienti dopo l'impianto di valvole cardiache protesiche mentre singoli fattori che contribuiscono all'insorgenza di IEare non ancora pienamente compreso6,7. In condizioni di flusso, batteri ritrovarvi con le forze di taglio, di cui hanno bisogno per superare allo scopo di rispettare il vaso muro8. Modelli, che consentono di studiare l'interazione tra batteri e tessuto della valvola prostetica o endotelio sotto flusso, sono di interesse in quanto riflettono la situazione in vivo più.
Parecchi meccanismi specifici facilitano l'aderenza batterica alle cellule endoteliali (ECs) e alla matrice subendothelial esposta (ECM) che porta alla colonizzazione dei tessuti e alla maturazione delle vegetazioni, essendo essenziali punti iniziali in IE9. Varie proteine di superficie stafilococciche o MSCRAMMs (microbiche superficiale componenti riconoscere molecole matrice adesiva) sono stati descritti come mediatori di adesione di cellule dell'ospite e di proteine ECM interagendo con le molecole come fibronectina, fattore di fibrinogeno, collagene e von Willebrand (VWF)8,10,11. Tuttavia, in considerazione di pieghevole intra-molecolari di alcuni fattori di virulenza, per lo più studiati in condizioni statiche, molte di queste interazioni possono avere rilevanza diversa nelle infezioni endovascolari nel sangue circolante.
Pertanto, vi presentiamo un interno progettato in vitro flusso parallelo-piastra camera modello, che permette di valutare l'aderenza batterica ai diversi componenti della ECM ed ECs nel contesto degli innesti del tessuto impiantato in posizione RVOT. L'obiettivo generale del metodo descritto in questo lavoro è quello di studiare i meccanismi di interazione tra batteri e tessuti sottostanti endovascular in condizioni di flusso, che sono strettamente legate all'ambiente in vivo degli agenti patogeni di circolazione sanguigna come S. aureus. Questo nuovo approccio si concentra sulla suscettibilità delle superfici di tessuto di innesto di aderenza batterica per identificare potenziali fattori di rischio per lo sviluppo di Internet Explorer.

<table><tbody><tr><td>Cerotto pericardio bovino (BP), Pericardium Supple</td><td>Synovis Surgical Innovations, USA</td><td>PC-0404SN</td><td></td></tr><tr><td>Condotti per vene giugulari bovine (BJV)</td><td>Condotto Contegra; Medtronic Inc, USA</td><td>M333105D001</td><td></td></tr><tr><td>CH omotrapianto crioconservato</td> European <td>Homograft Bank (EHB)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Acu-Punch</td><td>Acuderm Inc, USA</td><td>P850 (8 mm); P1050 (10 mm)</td><td></td></tr><tr><td>albumina umana</td><td>Flexbumin; Baxter, Belgio</td><td>BE171464 LOTTO:16G12C</td><td></td></tr><tr><td>Brodo di soia triptico (TSB)</td><td>Fluka, Steinheim, Germania</td><td>22092-500G</td><td></td></tr><tr><td>Brodo per infusione di cuore (BHI)</td><td>Fluka</td><td>53286-500G</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>5(6)-Carbossifluoresceina N-idrossisuccinimide estere (CF)</td><td>Sigma-Aldrich, Germania</td><td>21878-100MG-F</td><td></td></tr><tr><td>Pompa peristaltica (MODELLO ISM444B)</td><td>Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Germania</td><td>631942-2</td><td></td></tr><tr><td>Bagno di sonicazione</td><td>Pulitore ad ultrasuoni VWR; VWR, Radnor, Pa</td><td>142-6044</td><td>230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Invitrogen di ThermoFisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>InCell Analyzer 2000 (scanner a fluorescenza)</td><td>GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa</td><td>29027886</td><td></td></tr><tr><td>Arium Pro VF - acqua ultrapura - H2O</td><td>MilliQ Millipore</td><td>87206462</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini microscopici - Camere di coltura tissutale (1 pozzetto)</td><td>Sarstedt</td><td>94.6140.102</td><td></td></tr><tr><td>1 pozzetto su Lumox staccabile</td><td>Sarstedt</td><td>94.6150.101</td><td></td></tr><tr><td>Acciaio inossidabile - lame chirurgiche</td><td>Swann-Morton</td><td>311</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Silicone Tubing, 1/8"ID x 1/4"OD</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-95702-06</td><td>Intervallo di temperatura: &ndash; Da 80 a 200 gradi C Sterilizzare: Con ossido di etilene, irradiazione gamma o autoclave per 30 minuti, 15 psi di pressione</td></tr><tr><td>PharMed BPT Tubing</td><td>Saint-Gobain</td><td>AY242012</td><td>Autoclavabile 30 minuti a 121 gradi; C</td></tr><tr><td>Tygon LMT-55 Tubi</td><td>Saint Gobain Performance Plastics&commercio;</td><td></td><td>Termostato 15312022</td></tr><tr><td></td><td>BMG BIOMEDIZINTECHNIK</td><td>300-0042</td><td>230V, 90VA, 50Hz</td></tr></tbody></table>

un modello in vitro di un sistema di perfusione di piatti paralleli per studiare l'aderenza batterica per l'innesto di tessuti

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

Vari Tubi valvolati e stent-montate valvole sono utilizzati per sostituzione della valvola di efflusso del ventricolo destro (RVOT) del tratto in pazienti con cardiopatia congenita. Quando si utilizza materiali protesici tuttavia, questi innesti sono suscettibili di infezioni batteriche e varie risposte dell'ospite.
Identificazione dei fattori batterici e host che svolgono un ruolo vitale in endovascular aderenza dei microrganismi è di importanza per comprendere meglio la fisiopatologia di insorgenza di infezioni come l'endocardite infettiva (IE) e di sviluppare misure preventive strategie. Pertanto, lo sviluppo di modelli competenti a indagare adesione batterica in condizioni fisiologiche taglio è necessario. Qui, descriviamo l'uso di una nuova concezione in vitro aspersione camera basato su piastre parallele che permette che lo studio di aderenza batterica ai diversi componenti dei tessuti dell'innesto esposto come matrice extracellulare, cellule endoteliali e zone inerti . Questo metodo combinato con formazione di colonie (CFU) contando unitàè adeguato per valutare la propensione di materiali d'innesto all'adesione batterica sotto flusso. Ulteriormente, il sistema dell'alloggiamento di flusso potrebbe essere utilizzato per studiare il ruolo di emocomponenti in adesione batterica in condizioni di taglio. Abbiamo dimostrato che l'origine del tessuto, loro morfologia superficiale e la specificità di specie batteriche non sono i principali fattori determinanti in aderenza batterica all'innesto di tessuti utilizzando il nostro modello di aspersione in-House progettata in vitro .

Per comprendere meglio i meccanismi dietro IE sviluppo, questo modello consente la valutazione di batterico e tessuto connesso fattori presenti nella situazione in vivo dell'inizio di infezione.
In dettaglio, l'approccio di romanzo in vitro permette di quantificare adesione batterica in condizioni di flusso ai tessuti diversi innesto irrorando fluorescente identificati batteri sopra i tessuti esercitan...

Descriviamo un interno progettato in vitro camera modello di flusso, che permette l'indagine di aderenza batterica all'innesto di tessuti.

Un modello In Vitro di un sistema di perfusione di piatti paralleli per studiare l'aderenza batterica per l'innesto di tessuti

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella patogenesi dell'endocardite infettiva e dei pathobiogrammi attraverso campi come l'interazione tra batteri, cellule del sangue e cellule endoteliali che rivestono muscolatura. Il principale vantaggio di questa tecnica è che gli innesti tissutali potrebbero essere direttamente esposti a interazioni reciproche con vari bersagli, come batteri, piastrine e proteine in condizioni di flusso standardizzate. L'implicazione di questa tecnica si estende alla nostra terapia dell'endocardite infettiva, perché può svelare importanti interazioni molecolari e fattori che guidano un'elevata infettività di alcuni tessuti.Questo metodo fornisce informazioni sulla patogenesi della formazione della vegetazione. Può anche essere applicabile in studi che studiano la permeabilità vascolare, la mobilità cellulare e l'espressione delle cellule geniche. Per iniziare il protocollo, posizionare una biopsia tissutale precedentemente preparata di 10 millimetri di diametro e lo stesso spessore tra uno scivolo del microscopio e una perforazione circolare di otto millimetri e una guarnizione di gomma con la superficie interna rivolta verso l'alto, per contattare la sospensione batterica.Concentrarsi sull'orientamento dell'innesto tissutale mentre è posizionato nel supporto. Assicurarsi che la superficie interna del tessuto sia già esposta alle facce del flusso sanguigno fino a contattare il mezzo sperimentale. Quindi, inserire il supporto con il tessuto nella guarnizione incorporata nel telaio metallico inferiore della camera.Attaccare il telaio in metallo superiore con la relativa guarnizione sul fondo della camera con il porta tessuto inserito in precedenza. Quindi montare l'intera camera con otto viti e dadi a vite. Assicurarsi che l'altezza della camera sia sempre la stessa tra gli innesti utilizzando una pinza o un righello.Collegare quindi la camera di flusso con una pompa peristaltica. Quindi collegare il serbatoio del fluido da 400 millilitri con i tubi. Perfondi i tessuti con sospensioni da 100 millilitri da dieci alle sette unità di formazione della colonia etichettate fluorescentmente in salina tamponata con fosfato con lo stress pura di tre dines per centimetro quadrato e la corrispondente portata di quattro millilitri al minuto per un'ora utilizzando la pompa peristaltica e il serbatoio batterico.Ricircolare continuamente le sospensioni batteriche da 100 millilitri utilizzando lo stesso serbatoio di raccolta. Dopo la perfusione, smontare la camera per rilasciare l'innesto. Lavare il pezzo di tessuto due volte con quattro millilitri di PBS in una piastra da 12 pozzetti usando uno shaker orbitale per tre minuti.Quindi tagliare la parte interna dell'innesto usando un punzone di biopsia della pelle con un diametro inferiore. Mettere ogni biopsia tissutale in un tubo separato da 14 millilitri contenente un millilitro di cloruro di sodio sterile 0,9%. Staccare i batteri dal tessuto utilizzando un bagno di sonicazione per 10 minuti.Preparare un singolo tubo da 14 millilitri con 10 millilitri di cloruro di sodio sterile allo 0,9% per effettuare diluizioni seriali della sospensione batterica ottenuta dopo la sonicazione. Etichettare il tubo numero due. Preparare tre tubi da 14 millilitri con 10 millilitri di cloruro sterile allo 0,9% di sodio per le diluizioni seriali della sospensione batterica iniziale portata all'esperimento di profusione.Etichettare i tubi numero tre, numero quattro e numero cinque. Successivamente, fissare tre piastre di agar, una per la perfusione batterica, una per la perfusione di controllo del PBS e la terza per la sospensione batterica iniziale utilizzata per le perfusioni. Etichettare tre settori per piastra per l'esperimento tissutale nel modo seguente:10-1, 10-3 e 10-4.Per contare il numero di unità che formano colonie nella perfusazione batterica, etichettare la piastra come segue:10-1, 10-3, 10-5 e 10-7. Vortice i tubi contenenti la biopsia tissutale per 15 secondi ciascuno, per effettuare diluizioni seriali. Per preparare le diluizioni seriali, trasferire 100 microlitri del tubo numero uno nel tubo numero due e vortice del tubo per mescolare accuratamente la soluzione.Stendere 100 microlitri del contenuto del tubo numero uno e numero due nei settori corrispondenti, 10-1 e 10-3 della piastra di agar. Quindi distribuire 10 microlitri di tubo numero due sul settore 10 quattro. Ripetere questo passaggio quattro volte per ottenere quattro escrezioni separate da ogni volume di 10 microlitri.Per preparare le diluizioni seriali della coltura iniziale, prima vortice la diluizione per 15 secondi e trasferire 100 microlitri di sospensione batterica al tubo numero tre, e mescolare vigorosamente mediante vortice. Aggiungere 100 microlitri di tubo numero tre al tubo numero quattro e mescolare di nuovo. Ripetere la procedura per il tubo numero cinque dal tubo numero quattro.Distribuire 100 microlitri del contenuto dei tubi numero tre, numero quattro, numero cinque e la coltura iniziale etichettata rispettivamente sui settori 10-3, 10-5, 10-7 e 10-1 della piastra di agar del sangue. Lasciare le piastre di agar nel sangue sotto il cappuccio laminare per asciugare all'aria le diffondezioni batteriche, in genere per 10 minuti. Successivamente, posizionare le piastre a 37 gradi Celsius per l'incubazione notturna.Dopo l'incubazione notturna, conta le colonie batteriche per ottenere il numero di CFC. In condizioni di stress pura, è stato osservato un simile attaccamento batterico attraverso i vari tessuti di innesto sia per l'infezione da stafilococco aureo che per l'infezione da stafilococco epidermidis. Seguendo le procedure, lo streptococco sanguinis ha mostrato una significativa riduzione dell'aderenza alla parete spettrale giugulare bovina, rispetto alla macchia di pericardio bovino.Quando si confrontano le tre specie di batteri, lo streptococco sanguinis presenta un'adesione significativamente inferiore alla parete spettrale giugulare bovina in relazione allo stafilococco aureo e allo stafilococco epidermidis. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di aver preparato tessuti corretti della stessa testa. Garantirà condizioni simili in tutti i campioni di esperimento e ridurrà al minimo la variabilità dei dati tra diverse serie di esperimenti.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica consente ai ricercatori di esplorare i complessi sistemi di disturbo passo dopo passo arricchendo i loro approcci modello in vitro con diversi elementi per costruire una piena complessità vicino allo stato medico.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Un metodo per la cultura un monostrato di cellule endoteliali durante l'intera superficie interna 3D di un dispositivo a microfluidi con microvascolare canali di dimensioni (&lt;30 micron) è descritta.

Microfluidica Endothelialized per lo studio delle interazioni microvascolari nelle patologie ematologiche

Fonte: Ditkowski, B., et al. Un modello in vitro di un sistema di perfusione a placche parallele per studiare l'aderenza batterica ai tessuti dell'innesto. J. Vis. Esp. (2019).Questo video dimostra il metodo di utilizzo di una camera di flusso a piastre parallele per perfondere batteri marcati con fluorescenza su tessuti di innesto vascolare, consentendo un'analisi controllata dell'adesione batterica e della patogenesi precoce in condizioni di flusso di taglio.

Modello in vitro a flusso parallelo a placche per studiare l'adesione batterica in una biopsia tissutale

Fonte: Calatayud Arroyo, M., et al. Valutazione della vitalità di un consorzio batterico sintetico sull'interfaccia intestino-microbo ospite-microbo in vitro. J. Vis. Esp. (2018).Questo video dimostra un modello intestinale-microbio in vitro per studiare la vitalità batterica. Una co-coltura di cellule Caco-2 e HT29-MTX viene incubata con batteri pretrattati in condizioni digestive simulate. L'integrità della barriera epiteliale viene valutata utilizzando la resistenza elettrica...

Modello intestinale in vitro per valutare l'adesione batterica e l'internalizzazione

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates an in vivo method for analyzing shear-dependent bacterial adhesion in a live mouse model. Following surgical preparation and catheterization, the mesenteric vasculature is exposed for real-time imaging under a fluorescence microscope. Perfusion with an ionophore and fluorescently labeled bacteria reveals how shear stress triggers...

An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion

Neisseria meningitidis è un agente patogeno specifico umano che infetta i vasi sanguigni. In questo protocollo microvasi umani vengono introdotti in un topo da innesto di pelle umana su topi immunocompromessi. I batteri aderiscono ampiamente ai vasi umani, con conseguente danno vascolare e lo sviluppo del rash purpurica tipicamente osservato in casi umani.

Umanizzato mouse modello per studiare le infezioni batteriche Targeting il microcircolo

Per studiare l'interazione dei batteri con i vasi sanguigni sottoposti a stress di taglio, vengono descritti una camera di flusso e un modello di microscopia intravitale mesenterica in vivo che consentono di sezionare i fattori batterici e dell'ospite che contribuiscono all'adesione vascolare.

In vitro e in vivo modello per studiare l&#39;adesione batterica alla parete del serbatoio in condizioni di flusso

Leucociti avidamente interagiscono con le cellule vascolari e le piastrine dopo lesione di parete del vaso o durante l'infiammazione. Qui, descriviamo un semplice test a flusso laminare per caratterizzare i meccanismi molecolari che sono alla base delle interazioni tra leucociti ed i loro partner cellulari.

Analisi di flusso laminare-based per indagare il reclutamento leucocitario su cellule vascolari coltivate e piastrine aderenti

Questo protocollo illustra i metodi per consentire una coltura estesa in vitro di xenoinnesti derivati dal paziente (PDX). Un passo migliora la vitalità complessiva delle colture di cluster multicellulari negli idrogel 3D, attraverso la semplice rimozione di singole cellule non vitali. Un passaggio secondario illustra le procedure consigliate per le impostazioni cultura PDX in una piattaforma microfluidica perfusa.

Maggiore vitalità per le colture di idrogel 3D ex vivo di xenoinnesti derivati dal paziente in una piattaforma microfluidica perfusa

Questo protocollo presenta la configurazione e il funzionamento di un bioreattore di nuova concezione stampato in 3D per la coltura ex vivo di vasi sanguigni in perfusione. Il sistema è progettato per essere facilmente adottato da altri utenti, pratico, economico e adattabile a diverse applicazioni sperimentali, come la biologia di base e gli studi farmacologici.

Ex Vivo Coltura di perfusione di grandi vasi sanguigni in un bioreattore stampato in 3D

Scopri un modello in vitro di camera a flusso per studiare l'aderenza batterica ai tessuti di innesto. Questo metodo aiuta a comprendere la patogenesi dell'endocardite infettiva e le interazioni molecolari coinvolte.

Un modello In Vitro di un sistema di perfusione di piatti paralleli per studiare l'aderenza batterica per l'innesto di tessuti

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