Preparazione delle fette Acute del midollo spinale per la registrazione di cellule intere Patch-clamp in neuroni di sostanza Gelatinosa
18 gennaio 2019
Qui, descriviamo i passi essenziali per le registrazioni di cellule intere patch-clamp fatta da neuroni di sostanza gelatinosa (SG) nella fetta di midollo spinale in vitro . Questo metodo consente la proprietà intrinseca della membrana, la trasmissione sinaptica e la caratterizzazione morfologica dei neuroni di SG per essere studiato.
Questo metodo può aiutare a chiarire i meccanismi spinali alla base della trasmissione sensoriale, della regolazione nocicettiva e dello sviluppo cronico del dolore o del dolore Il principale vantaggio di questa tecnica è che può consentire la conservazione neuronale ideale e può imitare le condizioni in vivo in una certa misura. Iniziare tirando elettrodi di registrazione da microcapillari di vetro borosilicato utilizzando un estrattore capillare. Quindi, riempire uno stampo con agar fuso per preparare un blocco di agar di 1,2 centimetri per 1,5 centimetri per 2,0 centimetri.
Tagliare il blocco per avere un canale centrale se si pianificano sezioni trasversali. O una carne di canale con il bordo del blocco per le sezioni parasagittali. Prima della profusione trascardica e dell'estrazione del midollo spinale, preparare 500 millilitri di ACSF a base di saccarosio.
Raffreddare la soluzione per raffreddare il ghiaccio ed equilibrare con il 95%O2 e il 5%CO2. Raffreddare tutti gli strumenti di dissezione sul ghiaccio. Fai un'incisione longitudinale di cinque centimetri sulla pelle posteriore dal caudale al rostrale.
Quindi, tagliare la gabbia toracica tra la colonna vertebrale e le costole su entrambi i lati. Usa le forbici per fare un taglio all'estremità caudale della colonna vertebrale. Quindi tagliare i tessuti circostanti e isolare rapidamente il segmento lumbosacrale della colonna vertebrale.
Trasferire il segmento lumbosacrale in un piatto di vetro contenente saccarosio freddo ghiacciato a base di ACSF. Con il lato ventrale verso l'alto, utilizzare forbici fini per tagliare bilateralmente il pedicolo vertebrale ed esporre attentamente il midollo spinale. Isolare una sezione del midollo spinale lunga due centimetri con l'ingrandimento lumbosacrale e trasferire la sezione spinale in un altro piatto di vetro riempito con saccarosio freddo ACSF.
Lavorare al microscopio a dissezione per rimuovere le meningi e la membrana pia aracnoide. Tagliare tutte le radici ventrali e dorsali il più rapidamente possibile. Fare attenzione ad evitare il lesionee al midollo spinale, in particolare il corno dorsale quando si rimuovono le meningi e le radici spinali.
Posizionare il midollo spinale sul blocco di agar tagliato in precedenza. Per preparare fette trasversali, attaccare il lato ventrale del midollo spinale all'agar con il lato dorsale verso la lama. Per preparare fette parasagittali, attaccare il lato ventrale con supercolla all'agar in direzione verticale.
Quindi, montare il blocco di agar su una piattaforma di un vibratomo con supercolla. E preparare fette trasversali o parasagittali da 300 a 500 micron con una velocità avanzata di 0,025 millimetri al secondo e una frequenza di vibrazione di 80 Hertz. Il midollo spinale deve essere tagliato dorso-ventrally.
Per ottenere i migliori risultati, la fetta deve essere preparata entro 15-20 minuti. Lo spessore della fetta spinale non deve essere superiore a 600 micron per soddisfare la visibilità cellulare. Utilizzare una pipetta rifilata in plastica per trasferire le fette su rete di nylon in una camera di stoccaggio contenente ACSF ossigenato continuamente a 32 gradi Celsius.
Per condurre registrazioni di patch patch a cellule intere da neuroni substantia gelatinosa o SG, utilizzare soluzioni intracellulari a base di ioni di potassio per la registrazione durante l'applicazione di soluzione a base di cesio solo per la registrazione di correnti post-sinaptiche inibitorie. Spostare delicatamente la fetta del midollo spinale nella camera di registrazione. E poi stabilizzarlo saldamente con un filo di platino a forma di U con fili di nylon per una stabilità ottimale delle fette.
Abbondantemente la fetta con ACSF bolleto a temperatura ambiente e impostare la velocità di profusione a due o quattro millilitri al minuto per ottenere una sufficiente ossigenazione. Quindi, usando una lente al microscopio a bassa risoluzione, identificare la regione dei neuroni SG come una banda traslucida. Scegli un neurone sano, caratterizzato da una forma tridimensionale con una membrana luminosa e liscia come cellula bersaglio utilizzando l'obiettivo ad alta risoluzione e regolalo al centro dello schermo del monitor video.
Riempire una micro pipetta con un volume appropriato di soluzione intracellulare a base di ioni di potassio o di cesio. Quindi inserire la micro-pipetta nel supporto dell'elettrodo e assicurarsi che la soluzione intracellulare contatti il filo d'argento all'interno del supporto. Mettere a fuoco la micro pipetta e utilizzare il micromanipolatore per immergerla nell'ACSF.
Applicare una leggera pressione positiva per forzare lo sporco e i detriti. Spostare gradualmente la micro pipetta verso il neurone mirato. Una volta che la pipetta si avvicina al neurone e si forma una fossetta molto piccola sulla membrana neuronale, rilasciare la pressione positiva per formare un gigaseale.
Alterare il potenziale di detenzione a meno 70 millivolt, che è vicino al fisiologico potenziale di membrana a riposo di una cellula. Quindi, applicare un'aspirazione transitoria e delicata alla micro pipetta per rompono la membrana e creare una buona configurazione a celle intere. Registra le proprietà di cottura testando il modello di attivazione di ogni neurone nel morsetto di corrente con una serie di un secondo di impulsi di corrente depolarizzante da 25 a 150 picoamp con incrementi di 25 picoamp al potenziale della membrana a riposo.
Per registrare le correnti subreshold somatiche, mantenere il potenziale della membrana a meno 50 millivolt in modalità morsetto di tensione, quindi applicare una serie di impulsi di tensione iperpolarizzanti di una seconda durata da meno 60 millivolt a meno 120 millivolt con un decremento di 10 millivolt. Registrare le correnti post-sinaptiche eccitatorie con la soluzione intracellulare a base di ioni di potassio in modalità morsetto di tensione ad un potenziale di tenuta di meno 70 millivolt. Registrare IPSC utilizzando una soluzione intracellulare basata sugli ioni di cesio per la registrazione di IPSC.
Dopo aver tenuto il potenziale della membrana a meno 70 millivolt per circa cinque minuti, cambiare gradualmente il potenziale di tenuta a zero millivolt. Attendere alcuni minuti per la stabilizzazione, quindi iniziare a registrare gli eventi IPSC. I modelli di cottura determinati iniettando una serie di impulsi di corrente depolarizzanti di un secondo in un neurone SG a potenziale di membrana a riposo possono essere classificati come tonico-firing, ritardato-firing, gap-firing, initial-burst, phasic-bursting, single-spike e reluctant-firing.
Questa immagine mostra il protocollo evocante per le correnti di sottosoglie nel morsetto di tensione. Queste tracce rappresentative mostrano la risposta all'iniezione di corrente iperpolarizzante classificata come IH, IA e IT. Questa è una traccia rappresentativa di SEPSC registrata dai neuroni SG a meno 70 millivolt in assenza e presenza di 50 micromolari APV e 20 micromolare CNQX. Questa traccia mostra i SEPC registrati prima dell'aggiunta di APV e CNQX su una scala cronologica espansa.
Seguendo questa procedura sono i metodi come le registrazioni di patch clamp accoppiate o l'optogenetica può essere eseguita per rispondere a domande aggiuntive come caratterizzare specifici microcircuiti neuronali in substantia gelatinosa.
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Panoramica
Questo studio descrive le procedure per effettuare registrazioni con tecnica patch-clamp su cellule intere dai neuroni della sostanza gelatinosa (SG) all'interno di fettine di midollo spinale in vitro. Utilizzando questo metodo, i ricercatori possono analizzare le proprietà intrinseche della membrana, la trasmissione sinaptica e le caratteristiche morfologiche dei neuroni della SG.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Elettrofisiologia
- Biologia cellulare
Sfondo
- La sostanza gelatinosa è fondamentale per comprendere l'elaborazione sensoriale e la regolazione del dolore.
- La tecnica del patch-clamp in configurazione whole-cell può chiarire le proprietà elettrofisiologiche di questi neuroni.
- Questo metodo migliora la conservazione neuronale e simula le condizioni in vivo.
- La comprensione dei neuroni della sostanza gelatinosa può fornire informazioni sui meccanismi del dolore cronico.
Scopo dello studio
- Descrivere la metodologia per le registrazioni con tecnica del patch-clamp in fettine di midollo spinale.
- Studiare le proprietà intrinseche dei neuroni della sostanza gelatinosa.
- Esplorare la trasmissione sinaptica in relazione ai meccanismi del dolore.
Metodi Utilizzati
- Registrazioni con tecnica patch-clamp su cellule intere eseguite su sezioni di midollo spinale in vitro.
- Il modello biologico si concentra sui neuroni della sostanza gelatinosa.
- Nel testo non è menzionato alcun workflow di multiomica.
- I passaggi critici includono la preparazione di un ACSF a base di saccarosio, l'isolamento del segmento midollare e il taglio del tessuto entro specifici limiti temporali.
- Le tecniche di registrazione includono la regolazione dei potenziali di holding e l'identificazione delle proprietà neuronali al microscopio.
Risultati principali
- Lo studio presenta un protocollo per l'identificazione e la registrazione dai neuroni del ganglio spinale, consentendo una caratterizzazione dettagliata delle loro proprietà elettrofisiologiche.
- Le variazioni elettrofisiologiche e i modelli di scarica possono essere analizzati per ottenere informazioni sull'eccitabilità neuronale e sulla dinamica sinaptica.
- I principali risposte biologiche includono la caratterizzazione di modelli di scarica tonica e di altri modelli di scarica in base alle condizioni sperimentali.
- Il metodo facilita l'esplorazione dei meccanismi di modulazione del dolore basati sull'attività sinaptica.
Conclusioni
- La metodologia descritta consente l'indagine della funzionalità dei neuroni del ganglio spinale ed è fondamentale per comprendere i percorsi del dolore.
- La precisione del metodo e la conservazione dei neuroni ne migliorano l'applicabilità nella ricerca neuroscientifica.
- I risultati contribuiscono a una migliore comprensione dei meccanismi alla base del dolore cronico e della trasmissione sensoriale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente una caratterizzazione elettrofisiologica dettagliata dei neuroni della sostanza gelatinosa, supportando la validazione degli bersagli nella ricerca sulle vie del dolore. Preservando l'integrità neuronale e riproducendo condizioni in vivo, aumenta l'affidabilità predittiva negli studi meccanicistici della trasmissione nocicettiva e dello sviluppo del dolore cronico. Il metodo facilita la verifica di ipotesi e la chiarificazione delle vie, elementi fondamentali nelle fasi iniziali della scoperta di farmaci nel campo delle neuroscienze.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche relative ai meccanismi di trasmissione sensoriale e di regolazione del dolore.
- Valore scientifico: Supporta la validazione funzionale delle target caratterizzando l'eccitabilità neuronale e le proprietà sinaptiche in circuiti rilevanti per la malattia.
- Valore scientifico: Contribuisce alla riduzione del rischio meccanicistico attraverso la valutazione quantitativa delle proprietà intrinseche della membrana e dei modelli di scarica.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce un metodo riproducibile per la preparazione di sezioni del midollo spinale, consentendo sistemi saggio standardizzati per lo screening di composti.
- Valore operativo: Garantisce la vitalità e stabilità delle sezioni entro limiti definiti di tempo e temperatura, supportando letture elettrofisiologiche costanti.
- Valore operativo: Permette la misurazione quantitativa di correnti postsinaptiche e modelli di scarica neuronale come punti finali del saggio.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Offre un modello di sistema rilevante per lo studio dei meccanismi spinali alla base dello sviluppo del dolore cronico e del prurito.
- Valore scientifico: Favorisce l'allineamento traslazionale dei biomarcatori collegando i fenotipi elettrofisiologici ai percorsi di regolazione nocicettiva.
- Valore operativo: Permette la continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica mediante registrazioni stabili in regime di clampaggio di corrente e di tensione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione del composto promettente, fornendo dati elettrofisiologici che informano la valutazione precoce dei composti nella ricerca sul dolore.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi nei circuiti nocicettivi del midollo spinale mediante registrazione diretta dei neuroni.
- Screening: Fornisce output quantitativi come correnti postsinaptiche eccitatorie e inibitorie per la valutazione dell'effetto dei composti.
- Analisi: Permette l'analisi statistica dei modelli di scarica e delle correnti subliminali per confrontare diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica modellando l'elaborazione spinale dei segnali del dolore rilevanti per l'uomo.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per lo studio di multipli bersagli all'interno del percorso del dolore, utilizzando una preparazione costante di fette di tessuto.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Previsione affidabile dell'interazione con il bersaglio grazie alla caratterizzazione dettagliata delle proprietà neuronali e della trasmissione sinaptica.
- Valore operativo: Standardizzazione e riproducibilità mediante parametri di sezionamento definiti, protocolli di ossigenazione e controlli di temperatura.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo riducendo l'ambiguità meccanicistica nella modulazione delle vie del dolore.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei composti in base agli effetti sulla funzionalità neuronale della sostanza gelatinosa, adeguandola al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in elettrofisiologia, dissezione dei tessuti e visualizzazione microscopica per una preparazione e registrazione efficaci delle fette.
- Dipende da strumentazioni quali vibratomo, micromanipolatore, amplificatore per patch-clamp e sistemi di ossigenazione per l'ACSF.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo all'orientamento del taglio, alla composizione delle soluzioni e ai tempi operativi tra diversi laboratori.
- Comporta considerazioni adattative quando si applica il metodo a diversi segmenti del midollo spinale o a specie diverse dai modelli rodentici.
- Comprende limitazioni pratiche, come la finestra temporale di 15–20 minuti per la preparazione delle fette e il vincolo di uno spessore di 600 micron per una visibilità ottimale delle cellule.
