Analisi di basati su reazione a catena della polimerasi quantitativa del Microbiota intestinale murina dopo il trattamento antibiotico orale

Questo protocollo fornisce un metodo affidabile per quantificare i cambiamenti è il microbiota intestinale dei topi dopo somministrazione orale di antibiotici. Questo può aiutare la ricerca sulle interazioni cross microbiota fornendo informazioni sulle patologie associate alla disbiosi microbica come la malattia infiammatoria intestinale. Il principale vantaggio di questi regimi di trattamento antibiotico è che prevengono la caratteristica perdita di peso normalmente associata alla somministrazione di antibiotici orali ai topi.

Per preformare il trattamento antibiotico attraverso il gavage orale preparare un cocktail di antibiotici mescolando soluzioni stock che sono state preparate come descritto nel protocollo tecnologico. Per un volume di millilitro mescolare 50 microlitri di ampicillina, 50 microlitri di gentamicina, 50 microlitri di neomicina, 500 microlitri di metronidazolo, 25 microlitri di vancomicina e 325 microlitri di acqua. Caricare la miscela antibiotica su una siringa da un millilitro eliminando eventuali bolle e attaccare un ago di gavage gage appropriato.

Afferrare saldamente la pelle sopra la spalla del mouse e allungare la testa e il collo per raddrizzare l'esofago. Dirigere la punta della palla dell'ago di alimentazione lungo il tetto della bocca e verso la parte posteriore della faringe. Quindi passarlo delicatamente nell'esofago e iniettare i 200 microlitri della soluzione.

Somministrare il cocktail antibiotico una volta al giorno per tutta la durata dell'esperimento. In alternativa, per somministrare antibiotici attraverso l'acqua potabile, preparare un cocktail di antibiotici come descritto nel protocollo tecnologico. È importante includere il dolcificante nella miscela antibiotica in quanto questo è un fattore cruciale per prevenire la disidratazione dei topi.

Riempire il cocktail antibiotico in una bottiglia d'acqua a circa 100 millilitri per bottiglia. Proteggere la bottiglia dalla luce e posizionarsi in una gabbia per topi. Sostituire il cocktail antibiotico con scorte fresche due volte a settimana per tutta la durata dell'esperimento.

Un attento monitoraggio del peso dei topi e dello stato di salute generale deve essere preformato quotidianamente durante la somministrazione di antibiotici. Pesare ed etichettare due tubi autoclave millilitro per la raccolta dei campioni. Per la raccolta di campioni di feci fresche posizionare ogni mouse in un trattino.

Quindi raccogliere pellet fecali direttamente dall'ano in un tubo di raccolta. Dopo aver eseguito l'eutanasia come descritto nel protocollo tecnologico, giaceva una carcassa di topo con l'addome completamente esposto e spruzzava l'area addominale con il 70% di etanolo. L'uso di forcelle sterilizzate e forbici crea un'incisione trasversale nell'addome per esporre il peratenio senza danneggiare alcun tessuto interno.

Sollevare il peratenio e fare un'incisione per esporre l'intestino. Rimuovere l'intestino con le forcep e le forbici e posizionare in una piastra di Petri steril. Utilizzare con cura le fasci per stuzzicare l'intestino tenue lontano dalle arterie mesenteriche e dal grasso.

Estendere l'intestino e posizionarlo su una salvietta da laboratorio pulita. Con un righello misurare e tagliare quattro centimetri dell'ileo distale dell'intestino tenue. Tagliare e scartare il centimetro dell'intestino prossimale al cieco.

Rimarrà una porzione di tre centimetri di ileo che verrà utilizzata per raccogliere i batteri intestinali. Tenere la porzione di ileo su un tubo sterile da due millilitri. Raccogliere il contenuto intestinale estrudendo direttamente l'intestino e raccogliendo il campione nel tubo.

Questo campione avrà batteri dal contenuto di ileo. Preparare una siringa da 20 millilitri con soluzione salina tamponata con fosfato freddo e sciacquare la porzione di ileo che scarta il flusso. Posizionare la porzione di ileo su una piastra di Petri sterile e aprirla longitudinalmente con le forbici.

Raschiare l'interno della parete dell'ileo con un bisturi. Raccogliere eventuali batteri sul bisturi lavarlo con un millilitro di PBS su un tubo di centrifuga pulito. Girare a ottomila volte G per cinque minuti per pellettare i batteri.

Dopo la centrifugazione scartare il supernatante. Questo campione conterrà batteri della parete dell'ileo. Pesare i tubi contenenti i campioni dalle feci e dall'ileo.

Sottrarre il peso dai tubi vuoti per ottenere il peso fecale in ogni campione. Estrarre DNA batterico da feci, contenuto di ileo e campioni di parete dell'ileo utilizzando kit disponibili in commercio. Conservare i campioni di DNA a meno 20 gradi Celsius fino all'uso.

Scongelare lo standard qPCR, il DNA del campione fecale e i reagenti qPCR da un kit disponibile in commercio sul ghiaccio. Diluire lo standard in acqua sterile priva di DNA in un intervallo da 10 a sette a 10 alle due copie per microlitro. Diluire il DNA del campione fecale a una metà, un quinto e un decimo di concentrazione.

Quindi fai una reazione di mixaggio principale per il numero totale delle reazioni più una. Mescolare 30 microlitri del master mix e 5 microlitri del modello, che è lo standard, il campione o l'acqua per il controllo negativo. Quindi aggiungere 10 microlitri di questo mix ad ogni pozzo in una piastra qPCR ottica a 384 po '.

Eseguire ogni reazione in triplice copia. Sigillare brevemente la piastra qPCR e la centrifuga. Quindi caricare la piastra sulla macchina qPCR programmata come elencato nel protocollo tecnologico.

Infine ottenere i valori soglia del ciclo per lo standard e i campioni prima di calcolare i numeri di copia 16S rDNA per i campioni fecali. Risultati rappresentativi mostrano una perdita di peso nei topi dopo la somministrazione di antibiotici per gavage orale o attraverso l'acqua potabile. Nessuna perdita di peso evidente viene rilevata nei topi che ricevono antibiotici per gavage orale.

Quando i topi vengono trattati con antibiotici nell'acqua potabile, liberano circa il 10% del loro peso corporeo entro i primi giorni dal trattamento, ma recuperano il normale aumento di peso in seguito. La quantificazione dei batteri nei campioni fecali richiede l'uso di una curva standard ottenuta tracciando il logaritmo del numero di copia per lo standard rispetto ai valori C-T ottenuti nel qPCR. All'interno dell'intervallo lineare l'equazione di analisi di regressione consente la quantificazione dell'abbondanza di rDNA 16S all'interno dei campioni fecali.

Come mostrato qui per feci, contenuto di intestino tenue e campioni di parete dell'intestino tenue. Dopo cinque o 10 giorni di somministrazione orale di antibiotici c'è una forte diminuzione della densità dei batteri nei campioni di feci da topi trattati con antibiotici. Tuttavia, la densità dei batteri nelle feci recuperata a livelli normali una settimana dopo l'arresto della somministrazione di antibiotici.

Sia il gavage orale che la somministrazione di antibiotici nell'acqua potabile riducono brevemente la carica batterica fecale nei topi trattati. Ricercatori che selezionano il metodo individuale che meglio si adatta alle esigenze sperimentali considerando fattori come la durata del trattamento. Il metodo qPCR per la quantificazione dei batteri può essere modificato per quantificare i singoli taxa batterici utilizzando primer specifici.

Ciò fornirà informazioni sia quantitative che qualitive sulle dimensioni e sulla composizione del microbioma.