Visualizzazione in tempo reale e analisi di condrociti lesioni dovute a carichi meccanici in espianti di cartilagine murina completamente intatta

Questo metodo consente di investigare gli effetti dei diversi regimi di carico meccanico, delle condizioni ambientali o delle fasi della degenerazione cartilaginea sulla vulnerabilità dei condrociti articolari in situ. Le forze fisiche. A differenza di altre tecniche, queste misurazioni vengono eseguite in tempo reale e in cartilagine completamente intatta senza compromettere le condizioni limite native.

Un altro vantaggio di questa tecnica è che utilizza un modello di topo, consentendo di testare come geni specifici influenzano la suscettibilità dei condrociti in situ in lesioni meccaniche. Per la dissezione del femore distale, posizionare il topo in posizione supina e fare un'incisione cutanea di cinque millimetri sulla porzione anteriore del ginocchio. Estendere l'incisione intorno al ginocchio.

E tirare indietro la pelle per esporre l'articolazione del ginocchio e i muscoli delle gambe. Partendo dall'estremità prossimale del femore, utilizzare una lama bisturi numero undici per tagliare lungo l'osso nella direzione distatale. Posizionamento della lama tra l'unità tendine muscolare del quadricipite e il lato anteriore dell'albero femorale.

Estendere l'incisione oltre la rotula. Taglio attraverso il centro del tendine patellare per rimuovere l'unità tendine muscolare del quadricipite. Successivamente, partendo dall'estremità prossimale del femore, posizionare la lama bisturi tra l'unità tendine muscolare del tendine del tendine del ginocchio e il lato posteriore dell'albero femorale e tagliare lungo l'osso nella direzione distale.

Quando l'incisione si avvicina all'articolazione del ginocchio, tagliare il tessuto molle e finire il taglio oltre l'articolazione del ginocchio. Tira indietro il quadricipite e i muscoli del tendine del ginocchio per esporre il femore. E tagliare via ogni muscolo in eccesso sui lati laterali e mediali dell'osso.

Tagliare il muscolo del polpaccio sul lato posteriore della tibia prossimale. E capovolgere la gamba per visualizzare il lato posteriore del femore. Rimuovere il tessuto in eccesso intorno all'articolazione del ginocchio per esporre i condili distali del femore e la superficie posteriore della tibia prossimale.

Tagliare i legamenti crociati anteriori e posteriori lontano dai condili femorali. E allontanare la tibia dal femore, tagliando tutti i legamenti per separare la parte inferiore della gamba dal femore. Utilizzando forbici a dissezione standard, tagliare il femore all'estremità prossimale dell'osso circa otto millimetri sopra l'articolazione tibiofemorale dal lato laterale.

E usa le forcep del gioielliere per rimuovere i tessuti molli circostanti dal femore. Quindi esporre la cartilagine su entrambi i condili all'estremità distale del femore. Idratare periodicamente la superficie articolare con HBSS.

Per la dissezione dell'omero, posizionare il mouse in posizione supina. E usa micro forbici per fare un'incisione di cinque millimetri sul lato posteriore del gomito. Estendere l'incisione intorno al gomito e tirare indietro la pelle per esporre i muscoli sul braccio e sulla spalla.

Partendo dall'estremità prossimale dell'omero, posizionare la lama di un bisturi numero undici tra l'unità tendine muscolare del tricipite e il lato posteriore dell'omero. E tagliare lungo l'osso in direzione distale. Estendere l'incisione verso l'estremità distale dell'omero, attraverso il tendine tricipite e tirare indietro i tricipiti verso l'estremità prossimale dell'omero fino a quando la testa omerale non viene esposta.

Tagliare il tessuto connettivo intorno alla testa omerale senza toccare la superficie articolare. E rimuovere l'arto dal corpo. Idratare la superficie articolare della testa omerale con HBSS.

Per scollegare l'omero dal braccio, utilizzare le forcelle per rompere l'estremità prossimale dell'ulna sul lato posteriore del braccio. E tagliare il tessuto connettivo intorno all'estremità distale dell'omero, rimuovendo qualsiasi tessuto in eccesso sull'osso. Quindi utilizzare forbici di sezionatura standard per rimuovere la tuberosità deltoide sul lato posteriore dell'omero.

E posizionare il campione sezionato in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri contenente HBSS. Per la colorazione Calcein AM dei campioni, trasferire le ossa in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri contenente 500 microlitri di Calcein micromolare da 10,05 micromolare in HBSS. E posizionare il tubo in un termo miscelatore a 37 gradi Celsius a 800 giri/min, protetto dalla luce.

Dopo trenta minuti, lavare il campione in HBSS fresco per dieci minuti. E trasferire il campione sullo scivolo di vetro di un dispositivo di prova meccanico personalizzato montato al microscopio, in modo che la superficie articolare dei condili femorali posteriori o della testa omerale sia seduta sul vetro. Idratare il campione con HBSS e posizionare il dispositivo con il campione su uno stadio di microscopio a fluorescenza.

Immagine dei condrociti articolari macchiati con Calcein AM prima dell'applicazione di carico con un ingrandimento 4x. Regolare le impostazioni di acquisizione per ottimizzare la qualità dell'immagine. Per applicare il carico meccanico statico, tenere un carico statico prescritto sopra il campione in modo che la cartilagine articolare sia compressa contro il vetro di copertura per cinque minuti prima di rimuovere il carico.

Per applicare un carico meccanico a impatto, far cadere un dispositivo di impatto cilindrico di peso noto sul campione da un'altezza prescritta, rilasciando il carico cinque secondi dopo l'impatto. Subito dopo che uno dei due carichi è stato rimosso, incubare il campione in ioduro di propridio molare appena preparato in un millilitro di HBSS. Per cinque minuti a temperatura ambiente, quindi ri-immagine dei condrociti articolari mediante microscopia a fluorescenza come appena dimostrato.

Per quantificare l'area delle cellule ferite e morte a causa del regime di carico meccanico applicato, aprire prima le micrografie della superficie articolare acquisite prima e dopo l'applicazione del carico meccanico in ImageJ. Combina le immagini in una pila. Impostare la scala delle immagini in base alla risoluzione dell'immagine.

Successivamente, definire l'area in cui le cellule sono diventate calcein negative e PI positive. Queste cellule sono considerate ferite o morte. Quindi determinare l'area delle cellule morte ferite utilizzando lo strumento di misurazione.

Almeno sei test hanno applicato i protocolli di carico aree localizzate quantificabili riproducibilmente indotte di lesioni cellulari nelle cartilagine femorali e omerali ottenute da topi C della valvola di otto o dieci settimane. In tutti i protocolli di carico testati, magnitudini di carico più elevate e intensità di impatto più elevate hanno esacerbato significativamente l'estensione uciale della lesione cellulare sia nei femore che negli humeri. Durante l'esecuzione delle dissezioni è importante ricordare di non contattare la cartilagine articolare con gli strumenti chirurgici, in quanto ciò può compromettere la linea di base per capacità dei campioni.

L'uso di questo modello di mirroring può facilitare la ricerca sull'osteoartrite, poiché la malattia è facilmente indotta nei topi attraverso manipolazioni genetiche, dietetiche o chirurgiche. La nostra piattaforma fornisce anche uno strumento per interrogare le domande scientifiche di base e per lo screening degli interventi terapeutici mirati alla vulnerabilità meccanica dei condrociti.