Name: Un modello di cultura Bursal-cellula primaria di pollo Ex Vivo per studiare la patogenesi Virus bursite infettiva (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Scopri la coltura di cellule bursali primarie di pollo per studiare la patogenesi del virus della bursite infettiva. Questo metodo supporta i tre R nella ricerca animale.

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Gli autori vorrei ringraziare il team di Animal Services presso l'Istituto di Pirbright per le loro competenze in cova, allevamento e l'abbattimento di uccelli e la competenza di Caroline Holt nel rimuovere asetticamente la borsa di Fabrizio. A.B. è finanziato attraverso la biotecnologia e Biological Sciences Research Council (BBSRC) via concede BBS/E/I/00001845, K.D. è finanziato attraverso il BBSRC via studentship BBS/E/I/00002115, e A.A. è finanziato attraverso il centro nazionale per la Sostituzione, affinamento e riduzione degli animali nella ricerca (NC3Rs) via concedere NC/R001138/1.

Tutte le procedure con gli animali devono essere eticamente approvate in anticipo. Nella nostra istituzione, tutte le procedure sono eseguite in conformità alla legge UK animali (procedure scientifiche) 1986 per le licenze Home Office istituzione, Personal e progetto, dopo l'approvazione del benessere degli animali ed Ethical Review Board (AWERB) interno.
1. preparazione del chCD40L
<ol><li>Costrutto di cellule HEK 293-msCD8-CD40L che esprimono stabilmente un chCD40L solubile in 1 x Roswell Park Memorial Institute (RPMI) supplementato con 10% inattivati (Ciao) siero fetale di vitello (FCS) e 1 con puromicina µ g/mL a 37 ° C in un'atmosfera contenente 5% CO 2. Nota: Queste cellule sono disponibili presso l'Istituto di Pirbright in seguito alla firma dell'accordo di trasferimento di materiale appropriato.</li>
	<li>Dividere le celle ad una densità di 1:5 quando confluenti. Raccogliere il surnatante (contenente il costrutto chCD40L solubile) ogni volta che le cellule sono divisi, e centrifugare a 400 x g per 5 min rimuovere i detriti cellulari e conservare a 4 ° C.</li>
	<li>Quando sono stati raccolti 500 mL del surnatante, piscina il liquido e filtro-sterilizzarlo attraverso un filtro di 0,2 µm.</li>
	<li>Concentrare il surnatante mediante concentratori centrifughi proteine con un peso molecolare di taglio di 10 K secondo le istruzioni del produttore. Estrarre il surnatante concentrato da ogni colonna, e riunire e filtro-sterilizzarlo facendolo passare attraverso un filtro per siringa da 0,22 µm.</li>
	<li>Determinare la concentrazione finale da utilizzare in esperimenti in serie diluendo la soluzione di chCD40L in 1 x Iscove per volta di Dulbecco medio (IMDM) (descritto nel passo 2.4) e coltura primarie bursal cellule in presenza di diluizioni. Determinare il numero e la percentuale di vitalità delle cellule al giorno per fino ad una settimana. Nota: La concentrazione più bassa dove la proliferazione delle cellule e la vitalità sono adeguate è la concentrazione da utilizzare nell'analisi. Questo rischia di essere tra le 01:20 e 01:50.</li>
</ol>2. preparazione delle soluzioni per l'isolamento primario delle cellule Bursal pollo
<ol><li>Preparare soluzione salina bilanciata di Hanks' (HBBS): 1x con calcio (Ca) con l'aggiunta di 10 mL di 10 x HBBS con Ca a 90 mL di H2O sterile e 0,47 µ l di 7,5% NaHCO3.</li>
	<li>Preparare soluzione stock di collagenasi D a 8 mg/mL in 1 x HBBS con filtro Ca.-sterilizzare la soluzione attraverso un filtro da 0,2 µM. Nota: Si consiglia di preparare aliquote di 5 mL e congelarli a-20 ° C.</li>
	<li>Preparare 1 x RPMI medium supplementato con 5% Ciao FCS. Conservare i supporti a 4 ° C.</li>
	<li>Preparare 1 x 500 mL di IMDM completati con 8% Ciao FCS, 2% Ciao pollo del siero, 50mm β-mercaptoetanolo, 50 µ l di insulina-transferrina-selenito di sodio e 1% di penicillina/streptomicina. Conservare i supporti a 4 ° C. Nota: Preparare in anticipo tutte le soluzioni di cui sopra.</li>
	<li>Preparare 1 x HBBS con Ca. conservare la soluzione sul ghiaccio.</li>
	<li>Preparare 1 x HBBS senza Ca aggiungendo 10 mL di 10 x HBBS senza Ca a 90 mL di sterile H2O, 0,47 µ l di 7,5% NaHCO3ed EDTA ad una concentrazione finale di 10 mM. Conservare la soluzione sul ghiaccio.</li>
	<li>Preparare soluzione 1x collagenosi D aggiungendo 5 mL di soluzione di riserva della collagenosi D a 13 mL di HBBS con Ca per un totale di 18 mL. Conservare la soluzione sul ghiaccio. Nota: Preparare le soluzioni descritte nei passaggi 2.5-2.7 il giorno dell'esperimento.</li>
</ol>3. rimozione della borsa di Fabrizio (BF)
<ol><li>Posteriore e tratteggio polli in una struttura appropriata, approvata e umanamente li abbattere a 2 – 3 settimane dell'età. Nota: Utilizzare metodi institute-approvato per l'abbattimento.</li>
	<li>
Raccogliere il BF da ogni pollo utilizzando tecniche asettiche. Nota: Utilizzare i protocolli in atto presso l'istituzione.<ol>
<li>Posizionare la carcassa in decubito dorsale e sterilizzare la pelle e piume sovrapponendo l'addome e il torace con una soluzione di etanolo al 70%, diluito in acqua.</li>
		<li>Fare un'incisione ventrale del midline nel basso addome usando un bisturi sterilizzato o forbici.</li>
		<li>Individuare la borsa di Fabrizio, che è collegato alla sezione caudale del colon, cranica per la cloaca.</li>
		<li>Utilizzando sterilizzate pinze e le forbici, tagliare la borsa di Fabrizio libero dal colon. Prestare attenzione per evitare di perforare l'intestino.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Posizionare l'organo in PBS freddo e trasferirlo al laboratorio sul ghiaccio. Nota: le cellule primarie deve essere isolato appena possibile dopo la raccolta dell'organo.</li>
</ol>4. isolamento di cellule Bursal primario di pollo
<ol><li>Lavorando in un di sicurezza microbiologico, lavare il BF almeno 3 x in 30 mL di PBS freddo.</li>
	<li>Trasferire il tessuto di una capsula di Petri (92 mm di diametro, 21 mm in altezza) e aggiungere 5 mL di soluzione 1x collagenosi D.</li>
	<li>Utilizzando forbici sterili o un bisturi, tagliare il BF in pezzi da meno di 5 mm di diametro.</li>
	<li>Incubare il tessuto a 37 ° C con agitazione delicata periodica per 30 min. Nota: La soluzione di collagenasi inizierà a digerire il tessuto.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta Pasteur sterile, ripetutamente aspirare la miscela per incoraggiare la disintegrazione del tessuto. Se necessario, tagliare il tessuto in pezzi più piccoli.</li>
	<li>Aggiungere un altro 5 mL di soluzione 1x collagenosi D al tessuto e viene quindi incubato a 37 ° C con agitazione delicata periodica per altri 30 min.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 4.6 e 4.7 il tessuto è completamente digerito. Nota: Ci saranno piccoli granuli che non si dissolvono più ulteriormente.</li>
	<li>Passare la sospensione cellulare attraverso un colino di cella 100 µm in 20 mL di 1 x HBBS senza Ca.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 400 x g per 5 min.</li>
	<li>Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 10 mL di 1 x RPMI con 5% FCS.</li>
	<li>Sia sottoposto 5ml di media gradienti di densità sotto la sospensione cellulare 10 mL o 10 mL di sospensione cellulare in cima a 5 mL di media gradienti di densità che contengono diatrizoate polysucrose e sodio di sovrapposizione. Garantire un'interfaccia chiara tra i due.</li>
	<li>Centrifugare la sovrapposizione a 900 x g per 20 min a 4 ° C. Ridurre o rimuovere l'interruzione di centrifuga. Nota: Le cellule dovrebbero formare una band all'interfaccia fra i media di cella e i media di gradienti di densità.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta Pasteur sterile, rimuovere le cellule e metterli in PBS freddo. Lavare le cellule di 3 x di centrifugazione li a 400 x g per 5 min e li risospendere in PBS freddo.</li>
</ol>5. la cultura delle cellule Bursal primarie di pollo
<ol><li>Centrifugare la sospensione cellulare a 400 x g per 5 min e li risospendere in 1x IMDM completa.</li>
	<li>Prendere un'aliquota della sospensione delle cellule, aggiungerlo a una soluzione di blu di Trypan e contare il numero di cellule vitali che escludono il blu di Trypan. Determinare il numero delle cellule e la percentuale di vitalità.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 400 x g per 5 min e risospendere e in completa IMDM completati con un 01:20 diluizione di pollo CD40L ad una densità di 1 x 107 cellule/mL. Titolare il surnatante concentrato contenente il chCD40L per determinare la diluizione ottima, che è probabile che si trovano nella gamma di 01:10 a 01:50.</li>
	<li>Coltura, le cellule in entrambi 24 o 96 pozzetti piastre a 37 ° C per piastre da 96 pozzetti con fondo U h. 48 – 72 sono preferibili a piastre a fondo piatto. Nota: Le cellule possono essere coltivate anche a 40 ° C</li>
</ol>6. infezione di cellule Bursal primarie di pollo con IBDV
<ol><li>48 – 72 h post-isolamento, scongelare un'aliquota del virus, vortexare il campione e memorizzarlo sul ghiaccio.</li>
	<li>Risospendere le cellule primarie bursal, prendere un 10-µ l aliquota della sospensione delle cellule, aggiungere 10 µ l di una soluzione di blu di Trypan e determinare il numero di cellule e redditività percentuale.</li>
	<li>Diluire il virus in 1x IMDM completa alla molteplicità appropriata dell'infezione (MOI) per rendere il virus inoculo e vortex.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 400 x g per 5 min.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e risospendere le cellule nell'inoculo di virus.</li>
	<li>Incubare la sospensione cellulare a 37 ° C per 1 h con agitazione periodica.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 400 x g per 5 min, rimuovere l'inoculo di virus e lavare le cellule in 1 x multimediale IMDM completo.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 400 x g per 5 min, rimuovere il supernatante e risospendere le cellule in completa per i media IMDM completata con pollo CD40L ad una densità di 1 x 107 cellule per mL.</li>
	<li>Coltura le cellule in entrambi 24 o 96 pozzetti piastre a 37 ° C. Nota: Le cellule possono essere coltivate anche a 40 ° C</li>
</ol>7. quantificazione di IBDV replicazione in cellule Bursal primario di pollo
<ol><li>Presso il postinfection di punto di tempo desiderato, risospendere le cellule, trasferirli in una provetta di appropriati, li Centrifugare a 400 x g per 5 min e raccogliere il surnatante per titolazione del virus da saggio della placca o analisi di TCID50 secondo il Reed-Muench metodo15.</li>
	<li>Lavare le cellule in 1 mL di PBS e prepararli per immunostaining con un anticorpo specifico all'IBDV, o estrarre RNA usando un apposito kit (seguendo le istruzioni del produttore) ed esibirà trascrizione d'inversione quantitativa della polimerasi catena reazione (RT-qPCR) utilizzando primer specifici per un gene IBDV (avanti, GAGGTGGCCGACCTCAACT; Inverso, GCCCGGATTATGTCTTTGAAG). Colture cellulari Mock-infetto devono essere utilizzati come controllo.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In questo studio, descriviamo la riuscita coltura di pollo cellule primarie bursal ex vivo in presenza di chCD40L solubile e dimostrare che queste cellule in grado di supportare la replica di un ceppo attenuato e un ceppo molto virulento di IBDV. Questo modello ex vivo può essere utilizzato per determinare come le cellule rispondono a un IBDV infezione13, che presenta chiari vantaggi rispetto agli studi in vivo e in vitro .
Durante la raccolta il BF, è fondamentale per non perforare l'intestino in modo da evitare la contaminazione batterica delle cellule bursal isolate. Inoltre, è importante isolare le cellule primarie più presto possibile dopo la raccolta dell'organo per limitare la morte delle cellule. La necessità di utilizzare chCD40L tratta di una limitazione della tecnica; Tuttavia, il lavoro condotto da Soubies et al. dimostra che l'uso di phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) per prolungare la vitalità cellulare bursal anziché chCD40L14 può attivare il modello essere adottato da un maggior numero di laboratori. Il protocollo di cui sopra determina la concentrazione ottimale di chCD40L empiricamente, coltivando cellule primarie di B in diluito serialmente concentrazioni della molecola e osservando la proliferazione delle cellule e vitalità. Per purificare la molecola di chCD40L e aggiungere una concentrazione specifica per terreni di coltura cellulare per evitare-lotto variabilità, potrebbe essere una potenziale modifica al protocollo.
In vivo gli studi hanno indicato che l'infezione IBDV seguente, che c'è un aumento nell'espressione di geni coinvolti nelle risposte di citochina pro-infiammatoria, risposte IFN di tipo I e apoptosi nel BF5,9,10 . Tuttavia, a seguito di infezione, c'è un afflusso delle cellule infiammatorie e cellule T effettrici in BF, che differiscono da nei geni che esprimono rispetto alla popolazione delle cellule B infettate9. È, pertanto, difficile da interpretare come infetta le cellule rispondono all'IBDV. Per risolvere questo problema, alcuni gruppi di ricerca hanno caratterizzato la risposta trascrizionale di cellule infettate con IBDV in cultura16,17,18,19,20. Questi studi in vitro hanno il vantaggio di MOIs ben definito e un postinfection di intervalli di tempo. Tuttavia, gli studi in vitro sono stati caratterizzati in genere in fibroblasti cellule16,17,20 o cellule dendritiche18. Mentre fornire qualche informazione sulle interazioni cellula-IBDV ospite, la convinzione corrente è che l'infezione delle cellule B è essenziale per la patogenesi di IBDV e, pertanto, la rilevanza dei dati non può essere overinterpreted. Prima del nostro ex vivo bursal modello della coltura cellulare, soltanto uno studio aveva caratterizzato la risposta cellulare delle cellule di B a IBDV infezione19; Tuttavia, questo studio ha utilizzato una linea di cellulari immortalizzate B che è stata trasformata a causa di infezione con ALV, limitando le conclusioni che potrebbero essere fatte. Al contrario, il modello ex vivo di infezione IBDV descritto qui permette ai ricercatori di mantenere i vantaggi degli studi in vitro , quali definiti MOIs e tempo-punti, mentre lo studio delle interazioni del virus con la cellula ospite pertinenti. Come le cellule bursal primarie sono ottenute da tessuti BF non infetti, ci sono non infiammatoria o cellule T presenti e noi abbiamo dimostrato di flusso cytometry (condizioni standard di utilizzo) che, dopo stimolazione chCD40L, 97% della popolazione cellulare è positivo per l'indicatore di cella B Bu-1 (dati non mostrati). Dato che il 3% delle cellule sono Bu-1 negativo, sarà interessante determinare se queste cellule infettano con IBDV ed esplorare la loro espressione genica e contributo alla patogenesi.
Prevediamo che il modello di cultura ex vivo bursal primario delle cellule di pollo può essere espanso per studiare le interazioni virus-cellula ospite di altri virus tropici della B-cellula che infetta polli, ad esempio ALV o REV e potrebbe anche essere ampliato ad altre specie avicole ( ad esempio, anatre o tacchini). La capacità di coltura primaria bursal cellule ex vivo anche apre la possibilità di studiare aspetti della patogenesi e dell'immunosoppressione causate da questi virus senza la necessità di infettano gli uccelli. Come in vivo studi causano la morbosità significativa, questo avrà un impatto sostanziale sulla sostituzione, raffinatezza e la riduzione dell'uso di animali nella ricerca.
In sintesi, la cultura di bursal primario delle cellule ex vivo pollo modello qui descritto ha il potenziale per espandere la comprensione della B-cellula come aviaria virus tropici interagire con le cellule dell'ospite, riducendo il numero di uccelli utilizzati in vivo in studi di infezione. Le tecniche possono essere applicate a più organi linfoidi, più virus e, potenzialmente, più specie di uccelli, che lo rende un modello attraente che può contribuire per i campi di virologia e immunologia aviaria.

L'industria del pollame globale è essenziale per garantire cibo a sufficienza per una popolazione umana d'espansione. Tuttavia, l'immunosoppressione è la minaccia per la sicurezza alimentare e il benessere degli uccelli commoventi e rappresenta una sfida economica fondamentale per l'industria. La maggior parte dei casi di immunosoppressione nei polli è causata tramite l'infezione con virus immunosoppressivi, con i più responsabili di alterare la immunità acquisita avendo un tropismo per i linfociti T e B1. Negli uccelli, la maggior parte delle cellule B si trovano all'interno di un organo conosciuto come la borsa di Fabrizio (BF). Le cellule B sono suscettibili all'infezione con diversi virus immunosoppressivi, tra cui quelli che causano la lisi, come il virus della malattia di IBDV e di Marek (MDV) e quelli che causano la trasformazione, ad esempio virus Leucosi Aviarie (ALV) e Reticoloendoteliosi virus ( REV).
Al fine di sviluppare strategie più efficaci per il controllo di queste infezioni, è essenziale per caratterizzare l'interazione dei virus con pollo B cellule. Tuttavia, quando le cellule B vengono rimossi da un uccello, non sopravvivono bene in ex vivo cultura2, rendendo difficile per eseguire un'analisi approfondita delle interazioni di IBDV con pollo B celle o gli eventi precoci dopo l'infezione di ALV o REV. Di conseguenza, molte interazioni di virus-cellula ospite sono stati studiati in vivo3,4,5,6,7,8,9, 10. Anche se questi studi sono di carattere informativi, comportano l'uso di uccelli infetti che soffrono di malattie che possono essere gravi.
Il ligando di CD40 è una molecola che induce la proliferazione di cellule B11. A seguito di identificazione del pollo gene codifica CD40L (chCD40L), una proteina di fusione solubile è stata progettata che, quando aggiunto al terreno di coltura, ha indotto la proliferazione di pollo primaria B cellule ex vivo12. Nel 2015, coltivate in questo modo le cellule di B sono state trovate per supportare la replica di MDV2 e nel 2017, noi ed altri trovati che primarie bursal cellule stimolate con chCD40L potrebbero essere usate come modello per studiare IBDV replica13,14. Qui, descriviamo l'isolamento e coltura di cellule bursal primario di pollo, l'infezione delle cellule con IBDV e la quantificazione della replicazione virale. Anche se Descriviamo il metodo nel contesto del BF, questo potrebbe essere applicato alle cellule isolate e cultura da diversi organi linfoidi.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640 Medium</td><td>Merck</td><td>R8758-500ML</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>gibco di Life Technologies</td><td>10099-141</td><td>inattivato a caldo a 56 &deg; C per 1 h</td></tr><tr><td>Puromicina dicloridrato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Filtro monouso sterile a flusso rapido con membrana PES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>168-0045</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Protein Concentrator PES (10K MWCO, 20 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88528</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &; m Filtro per siringa Millex-GP</td><td>Merck</td><td>F7648</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBBS) + CaCl2 + MgCl2</td><td>gibco di Life Technologies</td><td>14060-040</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBBS) - CaCl22 - MgCl2</td><td>gibco di Life Technologies</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamminotetraacetico soluzione acida (EDTA)</td><td>Merck</td><td>03690-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) (1 X) + GlutaMAX</td><td>gibco di Life Technologies</td><td>31980-030</td><td></td></tr><tr><td>Siero di pollo</td><td>Merck</td><td>C5405-100ML</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo 50 mM</td><td>gibco di Life Technologies</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Gibco di insulina-transferrina-sodio-selenito</td><td>di Life Tecnologie</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; m Cell Strainer</td><td>Corning</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1083</td><td>Merck</td><td>10831-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di tripano blu</td><td>Merck</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>Nunc96 Piastre per micropozzetti a fondo tondo in polistirene Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>163320</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Piastra per colture cellulari multipozzetto a fondo piatto trasparente a 24 pozzetti trattata con TC, con coperchio, Corning</td><td></td> <td>sterile</td><td></td>353047</tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr></tbody></table>

un modello di cultura bursal-cellula primaria di pollo ex vivo per studiare la patogenesi virus bursite infettiva

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Virus della bursite infettiva (IBDV) è un birnavirus di importanza economica per il settore avicolo. Il virus infetta le cellule di B, causando morbilità, mortalità e immunosoppressione in volatili infetti. In questo studio, descriviamo l'isolamento di cellule bursal primario di pollo da Borsa di Fabrizio, la cultura e l'infezione delle cellule con IBDV e la quantificazione della replicazione virale. L'aggiunta di ligando di CD40 pollo ha aumentato significativamente la proliferazione delle cellule quattro volte su sei giorni di cultura e di attuabilità delle cellule significativamente migliorata. Due ceppi di IBDV, una coltura cellulare adattato ceppo, D78 e un ceppo molto virulento, UK661, replicato anche in colture cellulari ex vivo . Questo modello sarà di uso nel determinare come le cellule rispondere all'IBDV infezione e consentiranno una riduzione del numero di volatili infetti utilizzati negli studi di patogenesi IBDV. Il modello può anche essere ampliato per includere altri virus e potrebbe essere applicato a diverse specie di uccelli.

Le cellule primarie Bursal di pollo possono essere coltivate in presenza di pollo CD40L
Quando le cellule primarie bursal di pollo sono state coltivate in presenza di chCD40L solubile, il numero delle cellule è quadruplicate dal 9,02 x 105 a 3,63 x 106 / mL su un periodo di 6 giorni, a differenza di quando era assente (p &lt; 0,05) ( Figura 1A). La vitalità cellulare è stata migliorata anche significativamente, ad esempio da 25% a post-cultura giorno 3 in assenza di chCD40L al 48% in presenza di chCD40L (p &lt; 0,05) (Figura 1B)13.
Le cellule primarie Bursal di pollo in grado di supportare la replica di entrambi coltura cellulare adattato e ceppi molto virulenti di IBDV
Colture cellulari infetti e mock-infettati sono stati corretti 18h postinfection, etichettati con un anticorpo monoclonale contro IBDV VP2 e un anticorpo secondario coniugato di Alexa Fluor 488 e controcolorati con DAPI. Le cellule infettate hanno avuti prova di fluorescenza verde intorno al nucleo (Figura 2A), coerenza con la presenza di IBDV nel citoplasma. Questo è stato evidente per due ceppi di IBDV, una coltura cellulare adattato ceppo, D78 e un ceppo molto virulento, UK661 (Figura 2A). Alle 5, 18, 24 e un postinfection di 48h, RNA era estratta da culture infettate e sottoposti a RT-qPCR con gli iniettori specifici per una regione conservata del gene VP4 IBDV. L'espressione di VP4 era prima normalizzato al gene house-keeping TBP e poi espresso come variazione piega rispetto al finti campioni in un'analisi di ΔΔCt. IBDV VP4 espressione aumentata di 16.603 copie presso un postinfection di 48h con D78 e 38.632 copie presso un postinfection di 48 h con UK661. Presi insieme, questi dati dimostrano che le cellule di bursal primario di pollo potrebbero sostenere la replica delle cellule-cultura-adattato e molto virulento IBDV ceppi13.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58489/58489fig1.jpg"> Figura 1: pollo primario bursal cellule possono essere coltivate in presenza di pollo CD40L. Pollo primario bursal cellule sono state coltivate in presenza o in assenza di chCD40L (black bar e barre bianche, rispettivamente). (A) il numero di cellule vive e (B) la percentuale di cellule vitali erano risoluti a un postinfection di tempo-punti indicati. I dati riportati sono rappresentativi di almeno tre replicati esperimenti, le barre di errore rappresentano la deviazione standard della media e la significatività statistica è stata determinata utilizzando un accoppiato dello studente t-test a ogni punto di tempo, * p &lt; 0,05. questa figura è stata modificata con il permesso di Dulwich et al. 13.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58489/58489fig2.jpg"> Figura 2: cellule bursal primarie di pollo in grado di supportare la replica della cellula-cultura sia adattato e ceppi molto virulenti di IBDV. (A) cellule bursal primarie di pollo erano mock-infettati o infettate D78 o UK661 e un campione da ogni cultura è stato risolto, etichettato e imaged: IBDV VP2, verde; nuclei, blu. Barra della scala = 7 µm. (B) RNA è stata estratta a un postinfection di tempo-punti indicati, retrotrascritto, e una regione conservata del gene VP4 IBDV è stata amplificata mediante PCR quantitativa. La piega di10 registro modifica in VP4 numero di copia è stato normalizzato per il gene housekeeping TBP ed espresse in relazione mock-infettati i campioni secondo il metodoΔΔCT –2. I dati riportati sono rappresentativi di almeno tre replicati esperimenti, e le barre di errore rappresentano la deviazione standard della media. Questa figura è stata modificata con il permesso di Dulwich et al. 13.

Qui descriviamo l'isolamento di cellule bursal primario di pollo da Borsa di Fabrizio, la cultura e l'infezione delle cellule con virus della bursite infettiva e la quantificazione della replicazione virale.

Un modello di cultura Bursal-cellula primaria di pollo Ex Vivo per studiare la patogenesi Virus bursite infettiva

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della virologia aviaria, come il modo in cui i virus immunosoppressivi interagiscono con le cellule B. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le cellule sono più rilevanti delle linee cellulari immortalate attualmente utilizzate in laboratorio. Sebbene questo metodo fornisca informazioni su come le cellule di pollo rispondono all'IBDV, può anche essere applicato ad ALV e REV.Questo metodo riduce il numero di uccelli nella nostra ricerca ed è vantaggioso per le tre R, che sta per la sostituzione, la riduzione e il perfezionamento dell'uso di animali nella ricerca. In un armadio di sicurezza microbiologico, lavare il BF in 30 millilitri di PBS freddo almeno tre volte. Trasferire il tessuto lavato in una piastra di Petri e aggiungere cinque millilitri di una soluzione 1X di collagenasi D.Utilizzare forbici sterili o una lama bisturi per tagliare il BF in pezzi di diametro inferiore a cinque millimetri. Incubare a 37 gradi Celsius con agitazione delicata periodica per 30 minuti. Successivamente, utilizzare una pipetta Pasteur sterile per aspirare ripetutamente la miscela per incoraggiare la disintegrazione del tessuto.Aggiungere altri cinque millilitri di soluzione 1X di collagenasi D al tessuto e incubarlo a 37 gradi Celsius con agitazione delicata periodica per altri 30 minuti. Ripetere questo processo, aspirando la miscela, aggiungendo soluzione di collagenasi D fresca e incubando fino a quando il tessuto non viene completamente digerito. Si noti che ci saranno piccoli granuli che non si dissolveranno ulteriormente.Passare la sospensione cellulare digerita attraverso un colino cellulare da 100 micron in 20 millilitri di 1X HBBS senza calcio. Centrifuga a 400 volte g per cinque minuti. Scartare il supernatante, rimescolare il pellet in 10 millilitri di 1X RPMI con 5%FBS.Quindi, sovrapporre 10 millilitri della sospensione cellulare sopra cinque millilitri di mezzi gradienti di densità che contengono polisucrose e diatrizoato di sodio. Assicurarsi che vi sia un'interfaccia chiara tra i due livelli. Centrifuga a 900 volte g e quattro gradi Celsius per 20 minuti.Le celle devono formare una banda all'interfaccia tra il supporto cellulare e il supporto gradiente di densità. Quindi, utilizzare una pipetta Pasteur sterile per rimuovere le cellule e trasferirle in un tubo contenente PBS freddo. Lavare le cellule centrifugandole a 400 volte g per cinque minuti e quindi rimornendole in PBS freddo.Ripetere questo lavaggio tre volte. In primo luogo, centrifugare la sospensione cellulare a 400 volte g per cinque minuti. Rimossare le celle in 30 millilitri di IMDM completo 1X.Prendere un'aliquota della sospensione cellulare e aggiungerla a una soluzione blu Trypan. Contare il numero di celle vitali che escludono il blu di Trypan e determinare il numero di celle e la percentuale di vitalità. Successivamente, centrifugare la sospensione cellulare a 400 volte g per cinque minuti.Risosopend le cellule in IMDM completo integrato con una diluizione uno-a-20 del ligando CD40 di pollo ad una densità di 10 milioni di cellule per millilitro. Coltura delle cellule in piastre da 96 o 24 pozzi per 48-72 ore. Da 48 a 72 ore dopo l'isolamento, scongelare un'aliquota del virus.Vortice il campione, e conservarlo sul ghiaccio. Rimossare le celle bursal primarie nel mezzo IMDM. Prendere un'aliquota di 10 microlitri della sospensione cellulare e aggiungerla a 10 microlitri di una soluzione blu Trypan.Quindi, determinare il numero di celle e la vitalità percentuale. Diluire il virus in 1X completare IMDM alla molteplicità appropriata di infezione per rendere il virus inoculo. Mescolare questa diluizione con il vortice.Centrifugare la sospensione cellulare a 400 volte g per cinque minuti. Quindi, rimuovere il supernatante e rimescolare le cellule nell'inoculo del virus. Incubare a 37 gradi Celsius per un'ora con agitazione periodica.Successivamente, centrifugare la sospensione cellulare a 400 volte g per cinque minuti. Rimuovere l'inoculo del virus e lavare le cellule in un supporto IMDM completo 1X. Coltura delle cellule in piastre da 96 o 24 pozzi.In questo studio, le cellule bursali primarie di pollo vengono successivamente coltivate ex vivo in presenza di ligando CD40 di pollo solubile. Si vede che le cellule coltivate in presenza di ligando CD40 di pollo solubile aumentano di quattro volte da 902.000 a 3,63 milioni per millilitro in un periodo di sei giorni. La vitalità cellulare è anche significativamente migliorata in presenza di ligando CD40 di pollo.Nelle immagini rappresentative della microscopia confocale, si vede che le cellule infette hanno una fluorescenza verde attorno al nucleo, che è coerente con la presenza di IBDV nel citoplasma. Questo è evidente per due ceppi di IBDV, un ceppo adattato alla coltura cellulare, D78, e un ceppo molto virulento, UK661. L'RNA viene quindi estratto a cinque, 18, 24 e 48 ore dopo l'infezione e sottoposto a RT-qPCR con primer specifici per una regione conservata del gene IBDV VP4.L'espressione IBDV VP4 è vista aumentare a 16.603 copie a 48 ore dopo l'infezione da D78 e a 38.632 copie a 48 ore di postinfection con UK661. Questi dati dimostrano che le cellule bursali primarie di pollo possono supportare la replicazione di ceppi IBDV adattati alla coltura cellulare e molto virulenti. Seguendo questa procedura, altri metodi come RT-qPCR, microarray o RNA-Seq possono essere eseguiti al fine di rispondere a domande aggiuntive, come come le cellule rispondono all'infezione.Abbiamo confrontato il modo in cui le cellule rispondono all'infezione con un ceppo attenuato e un ceppo molto virulento di IBDV e il nostro ora indagare su come rispondono ad altre infezioni virali. La capacità di coltura di queste cellule ci consente di studiare aspetti della patogenesi virale e dell'immunosoppressione senza la necessità di infettare gli uccelli. Ciò avrà un impatto sostanziale sulle tre R, la sostituzione, l'affinamento e la riduzione dell'uso degli animali nella ricerca.

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