Name: Analisi dellattività dellendotossina per il rilevamento dellendotossiamia del sangue intero nei pazienti in malattia critica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Impara l'Endotoxin Activity Assay per la diagnosi di endotossiemia nel sangue intero di pazienti critici. Questo metodo rapido e affidabile aiuta a identificare precocemente il rischio di shock settico e a migliorare la gestione clinica.

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Ringraziamo Paolo Braganò e Lisa Mathiasen, Ph.D. per la loro revisione della metodologia del protocollo di analisi. Dario Winterton, MD fornì un sostanziale aiuto alla revisione del manoscritto per la conoscenza della lingua inglese.

Il protocollo è condotto secondo le linee guida istituzionali relative alla gestione delle biocampioni umane e seguendo le attuali procedure operative standard del nostro laboratorio clinico. L'uso dei dati EA e delle informazioni cliniche dei pazienti testati segue le linee guida del comitato etico della ricerca umana della nostra istituzione.
1. Attrezzature di laboratorio e contenuti del kit di anamante
<ol><li>Conservare il kit EA a 2-8 gradi centigradi quando non è in uso.</li>
	<li>
Ogni test EA è costituito da 5 diversi tipi di tubi; utilizzare ciascuno di essi per una parte diversa del test (vedere la sezione 2).
	<ol>
<li>Utilizzare tubo #1 (il tubo "Control") per misurare l'attività basale della raffica ossidativa non specifica dei neutrofili del paziente in assenza di un anticorpo specifico.</li>
		<li>Utilizzare il tubo #2 (il tubo "Campione") per misurare la raffica ossidativa in risposta al complesso dell'anticorpo LPS.</li>
		<li>Usa il tubo #3 (il tubo "Max") per misurare la picchiata ossidativa massima dei neutrofili del paziente in risposta a un eccesso di endotossina.</li>
		<li>Utilizzare il tubo #4 (il tubo "LPS") come fonte di endotossina endogena endogena.</li>
		<li>Utilizzare tubo #5 ("tubo "Aliquota") per l'immagazzinamento del sangue. NOT:</</c2> Duplicati di tubi #1, #2 e #3 sono previsti per un totale di 8 tubi da utilizzare per ogni campione di sangue sottoposto a test (la bottiglia di reagente EA e il test di controllo di qualità possono essere utilizzati per tutte le prove contenute in una sacca).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Raccogliere campioni di sangue del paziente in tubi sterili contenenti anticoagulante EDTA. Conservare i campioni di sangue a temperatura ambiente prima di eseguire il test EA.</li>
	<li>Prima di iniziare il test, accendere il chemiluminometro e lo shaker dell'incubatrice. Riscaldare l'incubatrice alla temperatura di 37 gradi centigradi.</li>
	<li>Idealmente, iniziare l'elaborazione del campione entro 30 min dalla raccolta del sangue.</li>
</ol>2. Saggio di attività dell'endotossina
<ol><li>Preparare le provette EA per il campione di sangue di ogni paziente che è necessario testare. Mettere i tubi in rastrelliere a tubo. Quindi rimuovere i tappi.</li>
	<li>Utilizzando una combipipetta, pipette un volume di 1 mL del reagente EA dalla bottiglia in tubi #1 (tubo di controllo), #2 (tubo di campionamento) e #3 (tubo massimo), ciascuno in duplicato. NOT:</</c0> Pipetta lungo il lato del tubo per evitare soluzione spruzzi indietro.</li>
	<li>Mescolare il campione di sangue del paziente invertendo delicatamente il tubo di raccolta del sangue per 20 volte. Quindi, pipetta 0,5 mL di sangue del paziente nel tubo #4 (tubo massimo LPS) e tubo #5 aliquota (tubo). Tubo vortice #4 per 10 s.</li>
	<li>Mettere i rack a tubo con tutte le provette EA nello shaker dell'incubatore. Chiudere il coperchio e incubare per 10 min alla temperatura di 37 gradi centigradi.</li>
	<li>Aprire il coperchio e rimuovere i rack tubo dallo shaker incubatrice. #5 tubo Vortex (tubo Aliquota). Utilizzando una punta sterile, pipetta 40 -L di sangue in tubi #1 e #2, in duplicato.</li>
	<li>#4 tubo Vortex (tubo LPS). Utilizzando la stessa punta di pipetta, pipetta 40 -L di sangue dal tubo #4 in #3 tubo (tubo Max), in duplicato.</li>
	<li>Vortex le sei provette finali (#1, #2, #3 e rispettivi duplicati), quindi riposizionarle nei loro rack. NOT:</</c1> Assicurarsi che tutti i tubi siano vortice per la stessa quantità di tempo.</li>
	<li>Rimettere i rack del tubo nello shaker per incubazione e chiudere il coperchio. Impostare lo shaker di incubazione a 100 giri/m, quindi avviare il movimento per 14 min.</li>
	<li>Inserire la scheda chipcard etichettata EA nel chemiluminometro e premere start. Dopo l'incubazione di 14 min, seguire le istruzioni visualizzate sul chemiluminometro per leggere i tubi EA nell'ordine corretto.</li>
	<li>Vorticare delicatamente ogni tubo per 10 s prima di posizionarlo sul supporto del campione del chemiluminometro. Aprire il cassetto campione e posizionare il tubo #1 nel supporto del campione. Quindi, chiudere il cassetto di esempio e attendere la lettura dell'unità luminosa relativa (RLU).</li>
	<li>Ripetere il passaggio 2.10 per il tubo 2 e il tubo 3.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 2.10 per i tubi duplicati 1, 2 e 3. NOT:</</c2> Provate a vorticare tutti i tubi per la stessa quantità di tempo durante i passaggi 2.10–2.12.</li>
	<li>Dopo che tutti i tubi sono stati elaborati, si noti che i risultati EA verranno calcolati e stampati automaticamente. I livelli sono espressi come unità EA e rappresentano la media di determinazioni duplicate dagli stessi campioni.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 2.2 a 2.13 per ogni campione di sangue che deve essere testato.</li>
	<li>Una volta completato il test, conservare le provette e i reagenti EA rimanenti a 2-8 gradi centigradi per un massimo di 30 giorni.</li>
</ol>

<ol><li>Akira, S., Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor signalling.</a> Nature Reviews Immunology. 4 (7), 499-511 (2004).</li>
<li>Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+integration+of+innate+immune+recognition+systems%3A+the+Toll-like+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endotoxin+Research%22%5BJournal%5D)">Evolution and integration of innate immune recognition systems: the Toll-like receptors.</a> Journal of Endotoxin Research. 11 (1), 51-55 (2005).</li>
<li>Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+gram-negative+bacteria+and+endotoxin+by+the+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system.</a> Current Opinion in Immunology. 11 (1), 19-22 (1999).</li>
<li>Natanson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin+and+tumor+necrosis+factor+challenges+in+dogs+simulate+the+cardiovascular+profile+of+human+septic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endotoxin and tumor necrosis factor challenges in dogs simulate the cardiovascular profile of human septic shock.</a> The Journal of Experimental Medicine. 169 (3), 823-832 (1989).</li>
<li>Suffredini, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cardiovascular+response+of+normal+humans+to+the+administration+of+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The cardiovascular response of normal humans to the administration of endotoxin.</a> The New England Journal of Medicine. 321 (5), 280-287 (1989).</li>
<li>Singer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Third+International+Consensus+Definitions+for+Sepsis+and+Septic+Shock+%28Sepsis-3%29%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%3A+The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3).</a> JAMA: The Journal of the American Medical Association. 315 (8), 801-810 (2016).</li>
<li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture-Negative+Severe+Sepsis%3A+Nationwide+Trends+and+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Culture-Negative Severe Sepsis: Nationwide Trends and Outcomes.</a> Chest. 150 (6), 1251-1259 (2016).</li>
<li>Ikeda, T., Ikeda, K., Suda, S., Ueno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Usefulness+of+the+endotoxin+activity+assay+as+a+biomarker+to+assess+the+severity+of+endotoxemia+in+critically+ill+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immunity%22%5BJournal%5D)">Usefulness of the endotoxin activity assay as a biomarker to assess the severity of endotoxemia in critically ill patients.</a> Innate Immunity. 20 (8), 881-887 (2014).</li>
<li>Dellinger, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Targeted+Polymyxin+B+Hemoperfusion+on+28-Day+Mortality+in+Patients+With+Septic+Shock+and+Elevated+Endotoxin+Level%5BTitle%5D)+AND+%22The+EUPHRATES+Randomized+Clinical+Trial.+JAMA%3A+The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Effect of Targeted Polymyxin B Hemoperfusion on 28-Day Mortality in Patients With Septic Shock and Elevated Endotoxin Level.</a> The EUPHRATES Randomized Clinical Trial. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 320 (14), 1455-1463 (2018).</li>
<li>Marshall, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+and+prognostic+implications+of+endotoxemia+in+critical+illness%3A+results+of+the+MEDIC+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Diagnostic and prognostic implications of endotoxemia in critical illness: results of the MEDIC study.</a> The Journal of Infectious Diseases. 190 (3), 527-534 (2004).</li>
<li>Levin, J., Bang, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clottable+protein+in+Limulus%3B+its+localization+and+kinetics+of+its+coagulation+by+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+et+Diathesis+Haemorrhagica%22%5BJournal%5D)">Clottable protein in Limulus; its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin.</a> Thrombosis et Diathesis Haemorrhagica. 19 (1), 186-197 (1968).</li>
<li>Marshall, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+endotoxin+activity+in+critically+ill+patients+using+whole+blood+neutrophil+dependent+chemiluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Measurement of endotoxin activity in critically ill patients using whole blood neutrophil dependent chemiluminescence.</a> Critical Care. 6 (4), London, England. 342-348 (2002).</li>
<li>Grimaldi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Level+of+Endotoxemia+Following+Out-of-Hospital+Cardiac+Arrest+Is+Associated+With+Severity+and+Duration+of+Postcardiac+Arrest+Shock%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">High Level of Endotoxemia Following Out-of-Hospital Cardiac Arrest Is Associated With Severity and Duration of Postcardiac Arrest Shock.</a> Critical Care Medicine. 43 (12), 2597-2604 (2015).</li>
<li>Klein, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EUPHRATES+trial+%28Evaluating+the+Use+of+Polymyxin+B+Hemoperfusion+in+a+Randomized+controlled+trial+of+Adults+Treated+for+Endotoxemia+and+Septic+shock%29%3A+study+protocol+for+a+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Trials%22%5BJournal%5D)">The EUPHRATES trial (Evaluating the Use of Polymyxin B Hemoperfusion in a Randomized controlled trial of Adults Treated for Endotoxemia and Septic shock): study protocol for a randomized controlled trial.</a> Trials. 15, 218(2014).</li>
<li>Bottiroli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+clinical+significance+of+early+high+Endotoxin+Activity+in+septic+shock%3A+An+observational+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Prevalence and clinical significance of early high Endotoxin Activity in septic shock: An observational study.</a> Journal of Critical Care. 41, 124-129 (2017).</li>
<li>Kaukonen, K. M., Bailey, M., Suzuki, S., Pilcher, D., Bellomo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mortality+related+to+severe+sepsis+and+septic+shock+among+critically+ill+patients+in+Australia+and+New+Zealand%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%3A+The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Mortality related to severe sepsis and septic shock among critically ill patients in Australia and New Zealand.</a> JAMA: The Journal of the American Medical Association. 311 (13), 1308-1316 (2014).</li>
<li>Biagioni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin+activity+levels+as+a+prediction+tool+for+risk+of+deterioration+in+patients+with+sepsis+not+admitted+to+the+intensive+care+unit%3A+a+pilot+observational+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Endotoxin activity levels as a prediction tool for risk of deterioration in patients with sepsis not admitted to the intensive care unit: a pilot observational study.</a> Journal of Critical Care. 28 (5), 612-617 (2013).</li>
<li>Roth, R. I., Levin, F. C., Levin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+detection+of+bacterial+endotoxin+in+plasma+with+the+Limulus+test%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Laboratory+and+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Optimization of detection of bacterial endotoxin in plasma with the Limulus test.</a> The Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 116 (2), 153-161 (1990).</li>
<li>Yaguchi, A., Yuzawa, J., Klein, D. J., Takeda, M., Harada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+intermediate+levels+of+the+Endotoxin+Activity+Assay+%28EA%29+with+other+biomarkers+in+the+assessment+of+patients+with+sepsis%3A+results+of+an+observational+study%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Combining intermediate levels of the Endotoxin Activity Assay (EA) with other biomarkers in the assessment of patients with sepsis: results of an observational study.</a> Critical Care. 16 (3), London, England. (2012).</li>
<li>Earley, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burn+Injury+Alters+the+Intestinal+Microbiome+and+Increases+Gut+Permeability+and+Bacterial+Translocation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Burn Injury Alters the Intestinal Microbiome and Increases Gut Permeability and Bacterial Translocation.</a> PLoS One. 10 (7), (2015).</li>
<li>Munster, A. M., Smith-Meek, M., Dickerson, C., Translocation Winchurch, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidental+phenomenon+or+true+pathology%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Incidental phenomenon or true pathology?</a> Annals of Surgery. 218 (3), 321(1993).</li>
<li>Clementi, A., Virzì, G. M., Brocca, A., Ronco, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Endotoxin+in+the+Setting+of+Cardiorenal+Syndrome+Type+5%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiorenal+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Role of Endotoxin in the Setting of Cardiorenal Syndrome Type 5.</a> Cardiorenal Medicine. 7 (4), 276-283 (2017).</li>
<li>Virzì, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiorenal+Syndrome+Type+5+in+Sepsis%3A+Role+of+Endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22in+Cell+Death+Pathways+and+Inflammation.+Kidney+and+Blood+Pressure+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiorenal Syndrome Type 5 in Sepsis: Role of Endotoxin.</a> in Cell Death Pathways and Inflammation. Kidney and Blood Pressure Research. 41 (6), 1008-1015 (2016).</li>
<li>Mignon, F., Piagnerelli, M., Van Nuffelen, M., Vincent, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+empiric+antibiotic+treatment+on+plasma+endotoxin+activity+in+septic+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Infection%22%5BJournal%5D)">Effect of empiric antibiotic treatment on plasma endotoxin activity in septic patients.</a> Infection. 42 (3), 521-528 (2014).</li>
<li>Klein, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Daily+variation+in+endotoxin+levels+is+associated+with+increased+organ+failure+in+critically+ill+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Daily variation in endotoxin levels is associated with increased organ failure in critically ill patients.</a> Shock. 28 (5), 524-529 (2007).</li>
</ol>

Estor SpA ha coperto il costo della pubblicazione della rivista e della tassa di produzione video. Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Lo shock settico è ancora oggi associato a una mortalità fino al 40%, anche se questo tasso varia a seconda dei rapporti considerati16. La necessità di biomarcatori nuovi e migliori è sostenuta dalla maggior parte degli esperti del campo al fine di aiutare i medici nella diagnosi precoce, una migliore gestione e la prognosticazione dei pazienti con shock settico6.
L'esecuzione di un test EA non richiede conoscenze tecniche precedenti o sofisticat...

Il Lipopolysaccharide (LPS), noto anche come endotossina, è un componente chiave della struttura della membrana dei batteri Gram-negativi (GN). Esso costituisce circa il 10% della parete cellulare, essendo vitale per l'integrità della membrana esterna e l'omeostasi. Inoltre, è un potente attivatore del sistema immunitario innato dell'ospite1,2.
L'esposizione in vitro delle cellule del sistema immunitario innato a LPS porta a cambiamenti nell'espressione di più geni3. La somministrazione di piccole quantità di LPS in volontari umani sani innesca la cascata di infiammazione sistemica acuta, mentre la sepsi e lo shock settico possono insorgere con concentrazioni di endotossina più elevate4,5.
La sepsi è una condizione pericolosa per la vita che, se non prontamente riconosciuta, può portare all'insufficienza multiorgano e alla morte. I pazienti settici devono essere trattati in modo tempestivo, con rianimazione aggressiva, terapia antibiotica adeguata, controllo ottimale del codice sorgente e strategie di supporto all'organo tempestivo. La diagnosi dell'eziologia della sepsi si basa principalmente sul riconoscimento clinico e sul rilevamento di patogeni basati sulla cultura6. Tuttavia, i risultati delle colture microbiche possono richiedere fino a 48 h e sono inconcludenti fino al 30% dei casi7. L'identificazione precoce e l'intervento possono portare a migliori esiti per i pazienti. Nei pazienti in cui si sospetta la sepsi, le decisioni sono spesso prese sulla base di parametri fisiologici e biochimici, senza un chiaro segno di endotossia.
La misurazione dell'attività endotossina (EA) può essere ottenuta mediante un saggio commerciale (vedi Tabella deimateriali) nel sangue intero. Può essere utilizzato come biomarcatore dell'endotossia sistemica per la stratificazione precoce della gravità della malattia, in particolare nei pazienti a rischio di sviluppare shock settico8. Il test è stato utilizzato per guidare la terapia dell'emoperfusione Polymyxin B in uno studio clinico in doppio cieco controllato da randomizzati in pazienti con shock settico9. Nei pazienti in stato di crisi, lo studio MEDIC ha mostrato un aumento dei livelli di EA da associare alla disfunzione di organi multipli, alla durata del soggiorno dell'unità di terapia intensiva (ICU) e alla mortalità10.
Sono stati sviluppati diversi saggi per rilevare l'endotossina. L'assaggio di Limulus Amoebocyte (LAL), sia come gel-clot, turbidimetrico, o test cromogenico, è stato finora il più frequentemente adottato per la stima dell'endotossina del siero. Si basa sulla capacità di endotossina per indurre la coagulazione dell'emolina del granchio a ferro di cavallo, Limulo polyphemus. Tuttavia, questo saggio ha alcune limitazioni in termini di specificità. In particolare, può anche essere attivato da prodotti microbici diversi dall'endotossina, come i componenti della parete cellulare fungina, e può essere inibito da varie proteine plasmatiche umane11.
Durante l'ultimo decennio la misurazione di EA è stata sviluppata e convalidata come biomarcatore dell'endotossia circolante. Rispetto al test LAL, EA è più veloce e più facile da implementare in ambito clinico. Inoltre, è stato dimostrato di essere più preciso di LAL nel sangue intero, con una maggiore sensibilità e specificità, sia in vitro che in vivo12.
Nonostante la sua implementazione iniziale come uno strumento diagnostico precoce per la rapida identificazione dei batteri GN come agenti causali di sepsi, il livello di EA è stato studiato anche come biomarcatore della gravità della malattia. In questo contesto, è stato dimostrato di essere particolarmente utile valutare lo stato di ipoperfusione a causa di malattie critiche in corso, come lo shock settico o la sindrome da arresto post-cardiaco13. Più recentemente, dopo lo sviluppo di sistemi di emopurazione, è stato proposto anche un risultato positivo di EA come strumento di screening per identificare con precisione i potenziali candidati per tale terapia14. Recentemente abbiamo condotto uno studio retrospettivo osservazionale sulla prevalenza e l'importanza clinica dei primi livelli di EA in 107 pazienti con shock settico. In linea con altri risultati recenti, abbiamo scoperto che EA è un promettente marcatore della gravità della malattia nei pazienti con shock settico15.
Lo scopo del presente manoscritto è descrivere il metodo per eseguire il saggio EA, sia al capezzale che in laboratorio, e descriverne l'uso potenziale in uno scenario rappresentativo di shock settico. Questa tecnica è in grado di rilevare l'attività di LPS misurando l'esplosione ossidativa avanzata nei neutrofili in seguito al loro innesco da complessi di un anticorpo anti-endotossina e LPS. L'aumento dell'esplosione respiratoria viene rilevato da un chemiluminometro e la quantità di luce emessa è considerata proporzionale alla quantità di endotossina nel campione di sangue. Il saggio richiede pochi reagenti, richiede circa 30 min per eseguire eutilizza appena 40 .

<table><tbody><tr><td>Kit EAA</td><td>Spectral Medical Inc.</td><td>EAAST-20</td><td>Pacchetto con 20 test + 1 controllo qualità</td></tr><tr><td>Smart Line TL</td><td>Berthold</td><td>EAASL</td><td>Luminometro</td></tr><tr><td>Agitatore per incubatrice</td><td>GRANT</td><td>ES-20</td><td>Agitatore per mini-incubatrice</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>VWR</td><td>444-2790</td><td>Strumento a vortice</td></tr></tbody></table>

analisi dell'attività dell'endotossina per il rilevamento dell'endotossiamia del sangue intero nei pazienti in malattia critica

Endotoxin Activity Assay for the Detection of Whole Blood Endotoxemia in Critically Ill Patients

Il lipopolisasseride, noto anche come endotossina, è una componente fondamentale dei batteri gram-negativi e svolge un ruolo cruciale nello sviluppo della sepsi e dello shock settico. L'identificazione precoce di un processo infettivo che si sta rapidamente evolvendo verso una malattia critica potrebbe indurre un trattamento più rapido e più intensivo, portando così potenzialmente a migliori esiti per i pazienti. L'attività endotossina (EA) può essere utilizzato al capezzale come biomarcatore affidabile dell'endotossia sistemica. È stato ripetutamente dimostrato che la rilevazione di livelli elevati di attività endotossina sia associata ad un aumento della gravità della malattia nei pazienti con sepsi e shock settico. Il saggio è veloce e facile da eseguire. In breve, dopo il campionamento, un di sangue intero viene mescolato con un anticorpo anti-endotossina e con LPS aggiunto. L'attività dell'endotossina è misurata come la relativa raffica ossidativa di neutrofili innescati rilevati dalla chemioluminescenza. L'output del saggio è espresso su una scala da 0 (assente) a 1 (massimo) e classificato come "basso" (<0,4 unità), "intermedio" (0,4–0,59 unità) o "alto" (unità 0,6 USD). La metodologia dettagliata e la logica per l'attuazione del saggio EA sono riportate in questo manoscritto.

Un uomo di 72 anni è stato ricoverato al Pronto Soccorso (ED) di un ospedale urbano accademico. Pochi giorni prima si era presentato al suo medico di base lamentandosi di bruciare la minzione. È stata raccomandata una terapia a breve corso con fosforomicina orale. La sua storia medica includeva l'ipertensione, il diabete non complicato di tipo 2 e l'iperplasia prostatica benigna. I suoi farmaci includevano enalapril, atorvastatina, tamsulosin e metformina.
<p class="jove_content" fo:k...

Con la presentennotità di un protocollo per misurare al capezzale l'attività di endotossina dei campioni di sangue intero umano. Il saggio Endotoxin Activity è un semplice test da eseguire e può essere un biomarcatore utile nei pazienti critici con sepsi.

Analisi dell'attività dell'endotossina per il rilevamento dell'endotossiamia del sangue intero nei pazienti in malattia critica

Lipopolysaccharide, also known as endotoxin, is a fundamental component of gram-negative bacteria and plays a crucial role in the development of sepsis ...

La sepsi può portare all'insufficienza multiorgano e alla morte. L'endotossina è un componente fondamentale dei batteri gram-negativi. Elevati livelli circolanti di endotossina potrebbero identificare il paziente a più alto rischio di sviluppare una malattia più grave.Il saggio di attività dell'endotossina può essere utilizzato come biomarcatore semplice, rapido e affidabile dell'endotossiemia sistemica. La diagnosi precoce di questa tossina potrebbe aiutare i medici a trattare i pazienti con shock settico. Nel paziente con shock settico, l'identificazione precoce di una condizione in rapida evoluzione potrebbe richiedere una terapia di supporto alla vita più rapida e intensiva, potenzialmente portando a risultati migliori.A dimostrare questa procedura sarà Lisa Mathiasen, biologa molecolare che collabora con il nostro gruppo di ricerca. Per iniziare questa procedura, impostare un kit di prova EA e disimballare i cinque diversi tipi di tubi. Utilizzare il tubo numero uno, il tubo di controllo, per misurare l'attività basale dello scoppio ossidativo non specifico dei neutrofili del paziente in assenza di un anticorpo specifico.Utilizzare il tubo numero due, il tubo campione, per misurare l'esplosione ossidativa in risposta al complesso anticorpale LPS. Utilizzare il tubo numero tre, il tubo Max, per misurare l'esplosione ossidativa massima dei neutrofili del paziente in risposta a un eccesso di endotossina. Utilizzare il tubo numero quattro, il tubo LPS, come fonte di endotossine esogene.E usa il tubo numero cinque, il tubo Aliquot, per la conservazione del sangue. Raccogliere campioni di sangue del paziente in tubi sterili contenenti anticoagulante EDTA e conservarli a temperatura ambiente prima di eseguire il test EA. Prima di iniziare il test, accendere il chemiluminometro e lo shaker dell'incubatore e riscaldare l'incubatore a 37 gradi Celsius.In primo luogo, posizionare i tubi EA da utilizzare nei rack dei tubi e rimuovere i tappi. Utilizzare una combipipette per trasferire un millilitro del reagente EA dalla bottiglia in tubi numero uno, numero due e numero tre tubazioni lungo il lato dei tubi. Invertire delicatamente il tubo di raccolta del sangue 20 volte per mescolare il campione di sangue del paziente.Quindi, pipetta 0,5 millilitri di sangue paziente nel tubo numero quattro e nel tubo numero cinque. Tubo vortice numero quattro per 10 secondi. Posizionare i rack dei tubi con tutte le provette EA nello shaker dell'incubatore.Chiudere il coperchio e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Successivamente, aprire il coperchio dell'incubatore e rimuovere i rack del tubo dallo shaker. Tubo vortice numero cinque.Utilizzando una punta sterile, pipettare 40 microlitri di sangue in tubi numero uno e numero due, in duplicato. Tubo vortice numero quattro. Utilizzando la stessa punta della pipetta, trasferire 40 microlitri di sangue dal tubo numero quattro nel tubo numero tre, in duplice copia.Vortice le sei provette finali una per una. Riposizionare le rastrelliere del tubo nello shaker di incubazione e chiudere il coperchio. Impostare lo shaker su 100 giri/min e avviare il movimento per 14 minuti.Inserire la chipcard con etichetta EA nel chemiluminometro e premere Start. Dopo l'incubazione di 14 minuti, seguire le istruzioni visualizzate sul chemiluminometro. Vortice delicato per ogni tubo per 10 secondi prima di posizionarlo sul supporto del campione del chemiluminometro.Aprire il cassetto del campione e posizionare il tubo numero uno nel portacampioni. Quindi, chiudere il cassetto del campione e attendere la lettura relativa dell'unità luminosa. Ripetere questo processo di lettura per i tubi due e tre e tutti i duplicati, come indicato nel protocollo di testo.Dopo che tutti i tubi sono stati lavorati, i risultati EA verranno calcolati e stampati automaticamente. Ripetere l'intero processo di dosaggio per ogni campione di sangue che deve essere testato. Conservare il kit EA Assay e i suoi componenti nella confezione sigillata originale a una temperatura compresa tra i due e i 25 gradi Celsius.In questo studio, viene eseguito un test di attività dell'endotossina per rilevare l'endotossiemia del sangue intero in pazienti gravemente malati. Un valore EA inferiore a 0,40 unità EA indica un basso livello di attività dell'endotossina, pari a una bassa concentrazione di LPS circolante, che rappresenta un basso rischio di progressione verso uno stato di malattia grave. Un risultato compreso tra 0,40 e 0,59 unità EA indica un livello intermedio di attività dell'endotossina, che rappresenta un rischio intermedio per lo sviluppo di sepsi grave e shock settico.Risultati pari o superiori a 0,60 unità EA indicano un alto livello di attività dell'endotossina, che rappresenta un alto rischio di shock settico e scarsi risultati del paziente. Il sangue dei tubi numero quattro e cinque deve essere miscelato con la provetta corretta. Occorre prestare particolare attenzione a seguire l'ordine corretto indicato nel protocollo.Ogni tubo viene eseguito in duplicati, portando potenzialmente a errori in questa fase. Dopo la sua introduzione, il saggio EA è stato proposto come biomarcatore per la stratificazione del rischio del paziente con ipoperfusione sistemica. Inoltre, è stato studiato come test di screening per selezionare i pazienti per strategie avanzate di trattamento dell'emopurificazione.

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Descriviamo un immunodosaggio semplice per misurare la produzione di citochine pro-infiammatorie, come IL-1 beta di produzione, in pazienti con fenotipi autoinfiammatorie. Attivando le cellule in colture di sangue intero con i modelli molecolari patogeni associati, in particolare con lipopolisaccaride, la secrezione di citochine possono essere convenientemente valutati in surnatanti di sangue intero.

Misurazione accurata e semplice della citochina pro-infiammatoria IL-1β utilizzando un intero saggio stimolazione del sangue

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Analisi dell'attività dell'endotossina per il rilevamento dell'endotossiamia del sangue intero nei pazienti in malattia critica

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