Name: Un metodo In Vivo per studiare lintegrità della barriera ematotesticolare di Mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Scopri un metodo in vivo per valutare l'integrità della barriera ematotesticolare nel topo C57Black/6 usando inulina-FITC. Questa tecnica aiuta a studiare l'impatto di tossine ambientali e fattori genetici sulla fertilità maschile.

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Quest'opera è stata sostenuta dalla chiave nazionale di R & D programma della Cina (2016YFA0500902), National Foundation Natural Science of China (31471228, 31771653), la Fondazione di scienza di Jiangsu per illustri giovani studiosi (BK20150047), la scienza naturale Fondazione della provincia di Jiangsu (BK20140897, 14KJA180005) e il programma Innovative e imprenditoriale della provincia di Jiangsu a K.Z.

Tutti gli esperimenti sugli animali effettuati sono stati approvati dal Comitato Università medica di Nanchino. Topi maschii C57BL/6 sono stati tenuti sotto condizioni controllate fotoperiodo e sono stati forniti con cibo e acqua.
1. preparati
<ol><li>
Capillari di microiniezione
	<ol>
<li>Utilizzare i capillari microiniezione con un diametro esterno e interno dimeter lunghezza di 1.0 mm, 0.8 mm e 10,0 cm, rispettivamente.</li>
		<li>Tirare tubi capillari in vetro con un estrattore capillare (Figura 1A). Testare e regolare le impostazioni a seconda della macchina estrattore capillare che viene utilizzato.</li>
		<li>Rompere le punte di pipetta con pinze per utilizzare per ottenere i capillari di diametro 50-µm sulla punta. Nota: I suggerimenti potrebbero essere troppo lunghi per penetrare il testicolo.</li>
		<li>Affilare la punta in un angolo di 30° utilizzando un frese per micropipetta (Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reagenti
	<ol>
<li>Preparare 1% di sodio pentobarbital: sciogliere 100 mg in 10 mL di tampone fosfato salino (PBS) (punto 2.3.3) di sodio pentobarbital.</li>
		<li>Preparare 10 mg/mL inulina-FITC: sciogliere inulina-FITC 1 mg in 100 μL di PBS (passo 2.1.6).</li>
		<li>Preparare la paraformaldeide al 4%: sciogliere paraformaldeide (PFA) 4 g in 100 mL di PBS (punto 2.3.3).</li>
		<li>Preparare il 30% di saccarosio: sciogliere saccarosio 3 g in 10 mL di PBS (passo 2.3.4).</li>
		<li>Preparare il cloruro di cadmio 0,1%: sciogliere il cloruro di cadmio 10 mg in 10 mL di PBS (punto 2.1.1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. metodi
<ol><li>
Anestesia e presurgery preparazione
	<ol>
<li>Pesare i topi maschii C57BL/6 di 8-settimana-vecchio e calcolare la dose necessaria di CdCl2. Trattare un gruppo di topi (n = 3) con CdCl2 (5 mg/kg di peso corporeo, i.p.) per 3 d prima della chirurgia. Trattare un altro gruppo di topi maschii C57BL/6 di 8-settimana-vecchio (n = 3) con PBS come controllo.</li>
		<li>Eseguire un intervento chirurgico in condizioni di asepsi mediante pinze, aghi, forbici e siringa sterile.</li>
		<li>Preparare la soluzione di lavoro di anestesia appena. La dose necessaria di anestesia è 70 mg di sodio pentobarbital/kg di peso corporeo. In media, un topo adulto C57BL/6 a 8 settimane di età pesa ~ 25 g, che corrisponde a 175 μL di 1% sodio pentobarbital (1,75 mg per topo). Nota: Il sodio pentobarbital è disciolto in soluzione fisiologica sterile di tampone fosfato (PBS). La soluzione è filtrata da 0.22 um unità filtrante prima di essere utilizzati.</li>
		<li>Pulire la zona per la chirurgia con 75% di etanolo e coprire l'area con un telo di tessuto pulito.</li>
		<li>Accendere il riscaldatore termostatico e regolare la temperatura a 37 ° C.</li>
		<li>Preparare soluzione di lavoro di inulina-FITC (10 mg/mL) il giorno dell'intervento chirurgico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Procedura chirurgica
	<ol>
<li>Pesare i topi maschii C57BL/6 di 8-settimana-vecchio e calcolare la dose necessaria di anestesia.</li>
		<li>Eseguire un'iniezione intraperitoneale di sodio pentobarbital utilizzando la siringa sterile 1 mL. Tenere il mouse in una gabbia pulita.</li>
		<li>Osservare la risposta riflessa occhio e modello di respirazione del mouse per confermare che è sotto anestesia completa. Nota: Di solito 10-15 minuti sono necessari fino a quando il mouse è profondamente anestetizzato, con una totale mancanza di risposta di pizzico di punta e la manutenzione di respirazione lenta e progressiva.</li>
		<li>Spostare il mouse nell'area di operazione e coprire la zona degli occhi con una velina umida per evitare secchezza durante l'anestesia (Figura 2A).</li>
		<li>Radere il pelo addominale con un rasoio e disinfettare la zona di chirurgia con etanolo al 75%.</li>
		<li>Con forbici affilate, fare un'incisione della pelle 1 cm sopra le ghiandole prepuziali per esporre la parete addominale. Sollevare la parete addominale con una piccola pinza e praticare un'incisione di 0,5 cm per esporre la cavità peritoneale (Figura 2B).</li>
		<li>Usare pinze per cercare di cuscinetti adiposi intorno il testicolo e l'epididimo. Estrarre delicatamente i cuscinetti adiposi per esporre chiaramente il testicolo allegato (Figura 2 e 2D). Di solito, di operare su un testicolo in un momento. Nota: Evitare di toccare i cuscinetti adiposi e testicolo con le mani.</li>
		<li>Posizionare una carta (9 cm di diametro) sotto i cuscinetti adiposi e testicolo (Figura 2).</li>
		<li>Iniettare una pipetta microiniezione di inulina-FITC e collegarlo all'unità micromanipolatore (Figura 1). Delicatamente inserire la pipetta di microiniezione sotto la tunica albuginea e caricare un totale di 20 μL di inulina-FITC nell'interstizio del testicolo (Figura 2E e 2F). Nota: Premere con cura la pipetta di microiniezione per evitare lo spostamento.</li>
		<li>Monitorare il movimento di inulina-FITC nel testicolo (Figura 2).</li>
		<li>Subito rimesso il testicolo nella cavità addominale dopo il completamento dell'iniezione.</li>
		<li>Ripetere la procedura sul testicolo controlaterale. Questo testicolo viene iniettato con 20 μL di PBS come controllo.</li>
		<li>Chiudere la pelle con una sutura chirurgica e sposta il mouse in una piastra di calore di una stufa termostatica (Figura 1B). Somministrare una dose di 1 mg di analgesico (buprenorfina) per 1 kg di peso corporeo tramite iniezione sottocutanea.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Raccolta dei testicoli e la preparazione di sezioni congelate
	<ol>
<li>40 min dopo l'iniezione, eutanasia il destinatario mouse di dislocazione cervicale secondo la cura degli animali e attenersi alle linee guida.</li>
		<li>Utilizzare un paio di forbici affilate per raccogliere i testicoli. Posizionare i testicoli in 1 mL di PBS ghiacciata per rimuovere eventuali contaminazioni di sangue.</li>
		<li>Difficoltà i testicoli in paraformaldeide al 4% (PFA) a 4 ° C per 12-24 h. scartare il 4% PFA e lavare il tessuto 3 x 1,5 ml di PBS + 1% a temperatura ambiente.</li>
		<li>Disidratare il tessuto in saccarosio 30% durante la notte. Mettere il testicolo nella cornice incorporamento e coprire il tessuto con temperatura ottimale di taglio composto (OCT). Dopo l'OCT è congelato, riempire il fotogramma incorporamento con OCT in modo che l'intero testicolo può essere coperto con OCT.</li>
		<li>Taglio 5-μm di spessore, congelati sezioni trasversali dei testicoli in un criostato a-20 ° C e farli aderire ai vetrini da microscopio. Nota: Ricongelare tessuti incorporati in ghiaccio secco può aumentare la rigidità per il taglio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Richiesta di immagine
	<ol>
<li>Porre i vetrini in una scatola umidificata. Scaldare i vetrini a temperatura ambiente per 10 min.</li>
		<li>Lavare le sezioni 3 x con soluzione fisiologica tamponata (TBS) a temperatura ambiente.</li>
		<li>Asciugare all'aria per 5 min al buio. Pulire qualsiasi residuo TBS con carta privo di polvere.</li>
		<li>Coprire le sezioni trasversali con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Porre il coprivetrino invertito su un vetrino da microscopio.</li>
		<li>Acquisire immagini utilizzando un microscopio confocale. Un totale di 20 ingrandimenti è generalmente sufficiente per rilevare il segnale luminoso fluorescente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sertoli-Sertoli+and+Sertoli-germ+cell+interactions+and+their+significance+in+germ+cell+movement+in+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis.</a> Endocrine Reviews. 25 (5), 747-806 (2004).</li>
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<li>Orth, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+of+Sertoli+cells+in+fetal+and+postnatal+rats%3A+a+quantitative+autoradiographic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Proliferation of Sertoli cells in fetal and postnatal rats: a quantitative autoradiographic study.</a> Anatomical Record. 203 (4), 485-492 (1982).</li>
<li>Lee, N. P. Y., Mruk, D., Lee, W. M., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+the+cadherin%2Fcatenin+complex+a+functional+unit+of+cell-cell+actin-based+adherens+junctions+in+the+rat+testis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Is the cadherin/catenin complex a functional unit of cell-cell actin-based adherens junctions in the rat testis?</a> Biology of Reproduction. 68 (2), 489-508 (2003).</li>
<li>Bai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Germline-Specific+Role+for+the+mTORC2+Component+Rictor+in+Maintaining+Spermatogonial+Differentiation+and+Intercellular+Adhesion+in+Mouse+Testis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">A Germline-Specific Role for the mTORC2 Component Rictor in Maintaining Spermatogonial Differentiation and Intercellular Adhesion in Mouse Testis.</a> Molecular Human Reproduction. 24 (5), 244-259 (2018).</li>
<li>Korhonen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DICER+Regulates+the+Formation+and+Maintenance+of+Cell-Cell+Junctions+in+the+Mouse+Seminiferous+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium.</a> Biology of Reproduction. 93 (6), 139(2015).</li>
<li>Loir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trout+Sertoli+cells+and+germ+cells+in+primary+culture%3A+I.+Morphological+and+ultrastructural+study%5BTitle%5D)+AND+%22Gamete+Research%22%5BJournal%5D)">Trout Sertoli cells and germ cells in primary culture: I. Morphological and ultrastructural study.</a> Gamete Research. 24 (2), 151-169 (1989).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+Integrity+of+the+Blood-Testis+Barrier+%28BTB%29%3A+An+In+Vivo+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Monitoring the Integrity of the Blood-Testis Barrier (BTB): An In Vivo Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1748, 245-252 (2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Spermatogenesi avviene nell'epitelio seminifero ed è un processo altamente ordinato e dinamico che è disciplinato dalle cellule germinali e le cellule somatiche (per es., cellule di Sertoli)13. La struttura BTB, che è costruita dalle cellule di Sertoli, divide l'epitelio seminifero in un basale e un compartimento apicale. Lo sviluppo delle cellule germinali meiotiche e aploidi avviene nel compartimento apicale che forma una barriera immunologica14.
<p ...

Spermatogenesi mammifera sono considerato un processo altamente strutturato che comprende degli spermatogoni auto-rinnovamento e differenziazione attraverso spermatociti in spermatozoi aploidi tramite mitosi e meiosi spermiogenesi, durante il quale drammatica si verificano cambiamenti biochimici e morfologici. Cellule germinali in via di sviluppo sono progressivamente trasportate dalla base del tubulo seminifero verso il lume. Questo processo è regolato da contatti cellula-cellula fra le cellule germinali e le cellule Sertoli1,2. Cellule di Sertoli adiacenti formano il BTB che si trova vicino alla base del tubulo seminifero. La BTB divide fisicamente l'epitelio in un basale e un vano di adluminal. Durante fasi VIII - IX del ciclo epiteliale, preleptotene/leptotene spermatociti dai comparti basali migrano attraverso il BTB, entrando il adluminal scomparti3. Di conseguenza, la funzione del BTB è di fornire un microambiente di nuova per il completamento della meiosi e spermiogenesi4,5,6. A differenza di altre barriere di sangue-tessuti (ad es., barriera emato - encefalica) che sono composti solo da giunzioni strette (TJs), il BTB è formata da quattro diverse giunzioni (TJs, specializzazioni ectoplasmatica, giunzioni di gap e basati su filamento intermedio desmosomi) tra Sertoli cells1,7.
Molti studi hanno utilizzato topi geneticamente modificati, infezioni da virus e tossici ambientali per studiare i meccanismi di BTB integrità7,8,9. La rottura di BTB induce la spermatogenesi alterata e infertilità o sterilità. Poiché la formazione di BTB e l'integrità sono stati confermati per essere influenzata dai contatti tra le cellule di Sertoli8, un modello in vitro basato su colture primarie di cellule di Sertoli isolate è stato usato per lo studio BTB. Tuttavia, questo modello non può simulare accuratamente BTB dynamics in vivo. Inoltre, nessun tale co-coltura delle cellule di germe con le cellule di Sertoli è stato stabilito come capace di riflettere tutti i relativi componenti strutturali e funzionali dei BTB10,11.
In generale, in vivo BTB integrità saggi sono in genere basati su piccole molecole, come EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotina e coniugato FITC inulina (inulina-FITC). Normalmente, la diffusione della biotina o inulina-FITC dal vano basale è bloccata dalla struttura BTB. Pertanto, siamo in grado di utilizzare questo metodo per valutare l'entità del danno BTB rispetto ai gruppi di controllo. Mentre BTB può essere compromessa con determinati tipi di stimoli, quali il trattamento con cadmio cloruro (CdCl2)12, BTB diventa accessibile a piccole molecole, che alla fine entrare nel compartimento di adluminal come indicatori.
Un'analisi iniziale di in vivo BTB integrità consiste nell'iniettare biotina o inulina-FITC nella vena giugulare, che comporta un intervento chirurgico ed è invasivo, complicato e richiede molto tempo. Inoltre, le sostanze di reporter diffondono attraverso tutto il corpo attraverso la circolazione, la concentrazione locale di biotina o inulina-FITC nei tubuli seminiferi è limitata. Inoltre, l'esposizione sistemica può indurre reazioni immuni. Qui, presentiamo un semplice ed efficace in vivo BTB integrità dosaggio consentendo ad iniezione diretta di una piccola aliquota di inulina-FITC nell'interstizio di un testicolo. Utilizzando il metodo di etichettatura fluorescente, il processo di colorazione è conveniente, come gli anticorpi secondari non sono necessari. Qui, il processo di tintura fluorescente entrando il testicolo è visualizzato.

<table><tbody><tr><td>Estrattore capillare&nbsp;</td><td>SUTTER INSTRUMENT (USA)</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Hyclone (USA)</td><td>SH30258.01</td><td>diluizione a 1&volte; in ddH2O</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)</td><td>Sigma (USA)</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio ad adesione</td><td>CITOGLAS (Cina)</td><td>80312-3161</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di cadmio</td><td>Sigma (USA)</td><td>655198-5G</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Zeiss (Germania)</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>Carta senza polvere</td><td>Kimberly-Clark (USA)</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Inulina-FITC</td><td>Sigma (USA)</td><td>F3272</td><td></td></tr><tr><td>Capillari per microiniezione</td><td>Zhengtianyi (Cina)</td><td>BJ-40</td><td>1,0 mm &volte; 0,8 mm&nbsp; &volte; 100 mm</td></tr><tr><td>Smussatrice per micropipette</td><td>NARISHIGE (GIAPPONE)</td><td>EG-400</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>SAKURA (GIAPPONE)</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma (USA)</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sodico</td><td>Merck (Germania)</td><td>P11011</td><td></td></tr><tr><td>Rasoio&nbsp;</td><td>Yashen (Cina)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Nikon (GIAPPONE)</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio&nbsp;</td><td>Sangon Biotech (Cina)</td><td>A610498</td><td></td></tr><tr><td>Strumenti chirurgici</td><td>Stronger (Cina)</td><td></td><td>forbici, pinze, porta aghi</td></tr><tr><td>Siringa</td><td>KDL (Cina)</td><td>20163150518</td><td>0,45 mm & volte; 0,16 mm RW LB</td></tr><tr><td>riscaldatore termostatico</td><td>KELL (Nanjing, Cina)</td><td>KEL-2010</td><td></td></tr><tr><td>10x TBS, pH 7,6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 M Tris</td><td>Sangon Biotech (Cina)</td><td>A600194</td><td></td></tr><tr><td>1,37 M Nacl</td><td>Sangon Biotech (Cina</td><td>)A610476</td><td></td></tr></tbody></table>

un metodo in vivo per studiare l'integrità della barriera ematotesticolare di mouse

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Spermatogenesi sono lo sviluppo di spermatogoni in spermatozoi maturi nei tubuli seminiferi del testicolo. Questo processo è supportato da giunzioni delle cellule di Sertoli alla barriera ematotesticolare (BTB), che è la barriera più stretta di tessuto nel corpo dei mammiferi e segrega l'epitelio seminifero in due scomparti, una basale e un adluminal. La BTB crea un microambiente unico per le cellule germinali nella meiosi I / II e per lo sviluppo della postmeiotiche spermatidi in spermatozoi tramite spermiogenesi. Qui, descriviamo un test affidabile per monitorare l'integrità BTB del testicolo topo in vivo. Un intatto BTB blocca la diffusione di inulina FITC coniugato dal basale al compartimento apicale dei tubuli seminiferi. Questa tecnica è adatta per lo studio dei candidati gene, virus o tossici ambientali che possono influire sulla funzione BTB o integrità, con una procedura facile e un requisito minimo di abilità chirurgiche rispetto ai metodi alternativi.

Il set-up sperimentale per eseguire il dosaggio di integrità BTB è illustrato nella Figura 1. Tirare e affinare i capillari di microiniezione con un estrattore capillare e frese per micropipetta, rispettivamente (Figura 1A e 1C). Il riscaldatore termostatico e attrezzature per il microinjection sono illustrate nella Figura 1B e 1D.
<p class="jove_content" fo:keep...

Qui, presentiamo un protocollo per valutare l'integrità di barriera ematotesticolare iniettando inulina-FITC in testicoli. Si tratta di un metodo efficiente in vivo per studiare l'integrità della barriera ematotesticolare che può essere compromessa da elementi genetici e ambientali.

Un metodo In Vivo per studiare l'integrità della barriera ematotesticolare di Mouse

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella barriera ematico-testicolo dei campi di biologia su candidati genici, virus o tossine ambientali che possono influenzare la funzione o l'integrità della barriera ematico-testicolare. Tre giorni prima dell'intervento, trattare almeno tre topi maschi C57Black/6 di otto settimane al giorno con un cloruro di cadmio di peso corporeo di cinque milligrammi per chilogrammo tramite iniezione intraperitoneale. Il giorno dell'intervento, posizionare un tessuto pulito su un'area chirurgica sterilizzata con etanolo al 75% e impostare un riscaldatore termostatico a 37 gradi Celsius.Posizionare un topo anestetizzato sul tessuto, quindi confermare una mancanza di risposta al dito del piedino. Radere i capelli addominali con un rasoio e disinfettare la pelle esposta con il 75% di etanolo. Fai un'incisione cutanea di un centimetro sopra le ghiandole preponiali per esporre la parete addominale e usa piccole forcep per sollevare la pelle per fare un'incisione di 0,5 centimetri nel peritoneo.Usa le forcep per cercare cuscinetti di grasso intorno all'epididimo e al testicolo, tirando accuratamente fuori i cuscinetti di grasso per esporre un testicolo attaccato. Posizionare un pezzo di carta di nove centimetri sotto i cuscinetti di grasso e il testicolo e caricare una pipetta di microiniezione con soluzione inulina-FITC preparata al momento. Collegare la pipetta a un'unità micromanipolatore e utilizzare un microscopio sezionante per inserire delicatamente la punta della pipetta di microiniezione sotto l'albuginea tunica.Ruotare lentamente la leva operativa per fornire 20 microlitri dell'inulina-FITC nell'interstizio del testicolo. Se la consegna ha esito positivo, il testicolo diventerà un colore verde-giallo brillante. Riportare immediatamente il testicolo alla cavità addominale e iniettare il testicolo contralaterale con 20 microlitri di PBS, quindi chiudere la pelle con una sutura chirurgica.E posizionare il mouse sul riscaldatore di un riscaldatore termostatico. 40 minuti dopo l'iniezione, utilizzare forbici affilate per raccogliere i teste da ogni topo e lavare i tessuti in un millilitro di PBS ghiacciato. Successivamente, fissare i tester in paraformaldeide al 4% a quattro gradi Celsius per 12-24 ore, seguiti da tre lavaggi in 1,5 millilitri dell'1%PBS per lavaggio.Dopo la disidratazione del saccarosio al 30% durante la notte, trasferire i campioni in singoli telai di incorporamento e coprire i tessuti con un composto ottimale della temperatura di taglio. Impostare la temperatura di un criostato su -20 gradi Celsius e posizionare i fotogrammi nel criostato per circa 10 minuti fino a quando lo Strumento di personalizzazione di Office non viene congelato. Quindi, riempire ogni telaio di incorporamento con oct fresco fino a quando l'intero testicolo non è coperto in ogni stampo.Quando il secondo strato di OCT si è congelato, acquisire sezioni trasversali spesse cinque micrometri di ogni testicolo, catturando le sezioni di tessuto su vetrini al microscopio di vetro man mano che si ottengono. Per immagini i campioni, riscaldare prima le diapositive in una scatola umidificata a temperatura ambiente. Dopo 10 minuti, lavare gli scivoli tre volte in soluzione salina tris-tamponata fresca per lavaggio e lasciare asciugare le sezioni per cinque minuti protette dalla luce.Utilizzare carta priva di polvere per rimuovere qualsiasi salina residua e montare i campioni con un supporto di montaggio integrato da DAPI. Quindi, coprire ogni campione con uno slittamento di copertura invertito e immagini i campioni sotto l'obiettivo 20X di un microscopio confocale. Tre giorni di trattamento con cloruro di cadmio causano danni alla barriera ematico-testicolo permettendo la diffusione inulina-FITC dal compartimento basale al compartimento apicale dell'epitelio seminifero.Al contrario, questa diffusione è bloccata nei tester trattati con PBS di controllo. L'entità del danno barriera ematico-testicolo è determinata calcolando il rapporto tra la distanza di diffusione inulina-FITC e il raggio dello stesso tubulo seminifero. Inoltre, la barriera intatta tra i testicoli del sangue nei topi knockout floxed Rictor eterozigoti blocca la diffusione dell'inulina attraverso la barriera nel compartimento apicale, mentre i topi knockout Rictor condizionali possiedono una barriera emato-testicola compromessa che consente la diffusione dell'inulina.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di fornire inulina-FITC preparata il giorno dell'esperimento e di mantenere il tessuto protetto dalla luce poiché FITC è una molecola sensibile alla luce. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia della spermatogenesi compromessa perché la funzione della barriera ematico-testicolare è fornire un microambiente immune-privilegiato per il completamento della meiosi nella spermatogenesi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica fornisce un modo per i ricercatori nel campo della medicina riproduttiva di esplorare la subfertilità e l'infertilità nei topi.Non dimenticare che lavorare con le paraformaldeidi può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come indossare indumenti e maschere facciali dovrebbero sempre essere prese quando si esegue questa procedura.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

I protocolli per il trapianto di cellule germinali e xenotrapianto tessuto testicolare sono descritti. Trapianto di cellule germinali risultati in donatori-derived spermatogenesi nei testicoli dei destinatari e rappresenta un test funzionale ricostituzione per l'identificazione delle cellule staminali spermatogoni (SSC). Tessuto testicolare xenotrapianto riproduce sviluppo dei testicoli e la spermatogenesi di specie diverse donatori in topi riceventi.

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Un<em&gt; In vivo</em&gt; Test per la verifica della nave Permeabilità Sangue

Il glicocalice endoteliale / endoteliale strato superficiale è perfettamente studiata usando la microscopia intravitale. Microscopia intravitale è tecnicamente difficile in un organo in movimento come il polmone. Si dimostra come brightfield simultanea e microscopia a fluorescenza possono essere utilizzate per stimare endoteliale spessore dello strato di superficie in un movimento...

Nella misura in vivo della superficie polmonare strato endoteliale mouse

Questo articolo descrive microiniezione ed elettroporazione di topo testicolo in vivo come una tecnica di trasfezione per le cellule testicolari di topo per studiare processi unici di spermatogenesi. Il protocollo presentato prevede fasi di preparazione capillare di vetro, microiniezione attraverso il dotto efferente, e trasfezione mediante elettroporazione.

In Vivo Microiniezione e Elettroporazione di mouse Testicolo

Vi presentiamo un protocollo per studiare le interazioni umane endoteliali-periciti in mouse utilizzando una variazione del saggio spina angiogenesi gel matrice.

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Qui presentiamo un'analisi di permeabilità vascolare del cervello del mouse usando iniezione intraperitoneale di traccianti fluorescenti seguita da aspersione che è applicabile ai modelli animali di disfunzione della barriera emato - encefalica. Un hemi-cervello è usato per valutare quantitativamente permeabilità e l'altro per la visualizzazione dell'elemento tracciante/immunostaining. La procedura richiede 5-6 h per 10 topi.

In Vivo barriera emato - encefalica permeabilità saggio nei topi utilizzando fluorescente etichettati traccianti

Sfruttando la microscopia intravitale, il metodo qui presentato consente la visualizzazione in tempo reale dello spargimento di cellule epiteliali intestinali negli animali viventi. Pertanto, la mucosa intestinale macchiata localmente (acriflavina e rodiamminaB-dextran) dei topi anestetizzati viene imageizzata fino alla risoluzione a singola cellula utilizzando la microscopia confocale.

Un approccio intravitale basato sulla microscopia per valutare la permeabilità intestinale e le prestazioni di spargimento di cellule epiteliali

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Dissezione assistita da transilluminazione di stadi specifici del ciclo epiteliale seminifero del topo per analisi immunosottenifere a valle

Questo articolo riporta un'inibizione in vivo di CENP-E attraverso la chirurgia addominale e l'iniezione testicolare di GSK923295, un valido modello per la divisione meiotica maschile. Utilizzando i saggi di immunofluorescenza, citometria a flusso e microscopia elettronica a trasmissione, dimostriamo che l'inibizione di CENP-E provoca disallineamento cromosomico e instabilità del genoma negli spermatociti di topo.

Valutazione funzionale della kinesina-7 CENP-E negli spermatociti mediante inibizione in vivo , immunofluorescenza e citometria a flusso

Nel presente protocollo, la funzione di barriera endoteliale della ghiandola sottomandibolare (SMG) è stata valutata iniettando diversi traccianti fluorescenti pesati molecolari nelle vene angolari di modelli animali in vivo sotto un microscopio a scansione laser a due fotoni.

In vivo Rilevamento della permeabilità vascolare nella ghiandola sottomandibolare del topo

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Monitoraggio della glicemia nella prole di topo dopo l'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi

Scopri un metodo in vivo per valutare l'integrità della barriera ematotesticolare nel topo C57Black/6 usando inulina-FITC. Questa tecnica aiuta a studiare l'impatto di tossine ambientali e fattori genetici sulla fertilità maschile.

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