Meticolosina Sistemi colatori di blocchi biocompatibili per la consegna mirata del DNA plasmide
6 agosto 2019
Questo lavoro presenta la preparazione di copolimeri a blocchi biocompatibili funzionalizzati di methionina (mBG) tramite il metodo RAFT (reversibile addometto-frammentazione a catena di trasferimento). Sono state studiate anche la capacità di complessire il DNA plasmide del mBG ottenuto e la loro efficienza di trasfezione. Il metodo RAFT è molto utile per polimerizzare i monomeri contenenti gruppi funzionali speciali.
I portatori di farmaci polimerici cationici hanno i vantaggi di una buona stabilità, bassa immunogenicità e facile preparazione e modifica. Qui, offriamo un metodo rapido e semplice per la sua sintesi. Il metodo di polimerizzazione reversibile di trasferimento della catena di addizione-frammentazione è un metodo applicabile ai polimeri a blocchi di snervamento con peso molecolare controllato e struttura e che trasportano gruppi funzionali.
Questi portatori di farmaci possono trasportare contemporaneamente diversi farmaci per ottenere il trattamento di collaborazione di cancro, infiammazione e altre malattie. La polimerizzazione IFT è un metodo classico, e questo protocollo fornisce un esempio della sua applicazione nella terapia genica. La chiave del successo per la sintesi di questo polimero è controllare con precisione la temperatura di reazione.
È più consigliabile utilizzare un bagno d'olio che un bagno d'acqua. Per iniziare questa procedura, ottenere un pallone a fondo rotondo con un tappo di gomma e un agitatore magnetico da utilizzare come bottiglia di polimerizzazione. Sciogliere 1,87 grammi di BIS-idrossi HEMA in un millilitro di acqua distillata nella bottiglia di polimerizzazione.
In un bicchiere da cinque millilitri, sciogliere 0,03 grammi di CTP e 0,02 grammi di ACVA in 0,5 millilitri di 1, 4-diossano. Aggiungere questa miscela alla bottiglia di polimerizzazione. Quindi, utilizzare una trappola di condensa per congelare la soluzione nella bottiglia di polimerizzazione.
Fissare la bottiglia al supporto di ferro e utilizzare un condotto inciampato con un ago per aspirare e iniettare azoto nella miscela di reazione. Quindi, sigillare la bottiglia di polimerizzazione e scongelare la soluzione a temperatura ambiente per 30 minuti. Ripetere questo ciclo di congelamento-pompa-scongelamento tre volte.
Successivamente, mettere la bottiglia in un bagno d'olio a 70 gradi Celsius e lasciare che la soluzione reagisca per 24 ore sotto l'atmosfera di azoto. Il giorno successivo, raffreddare la bottiglia di polimerizzazione a zero gradi Celsius e aprire il tappo di gomma per terminare la reazione di polimerizzazione. Successivamente, preraffreddare l'acetone in frigorifero a -20 gradi Celsius per due ore e mescolarlo con la soluzione di reazione nella bottiglia di polimerizzazione con un rapporto di 50 a uno.
Centrifugare questa miscela a 8.200 volte g per 10 minuti per rimuovere l'acetone e raccogliere il precipitato. Per purificare il poli bis-idrossi idrossi HEMA sintetizzato, sciogliere il precipitato raccolto in due millilitri di acqua pura. Quindi, mescolarlo con 100 millilitri di acetone preraffreddato con un rapporto da uno a 50.
Centrifugare la soluzione a 8.200 volte g per 10 minuti per raccogliere il precipitato. Ripetere tre volte questo processo di purificazione della dissoluzione, miscelazione e centrifugazione del precipitato. In primo luogo, sciogliere 0,96 grammi di APMA e 0,93 grammi del poli bis-idrossiere purificato HEMA in cinque millilitri di acqua distillata in un becher da 10 millilitri.
Sciogliere 0,01 grammi di ACVA in 0,5 millilitri da 1, 4-diossano e aggiungerlo alla soluzione APMA e poly bis-idrossi HEMA. Trasferire questa miscela in una bottiglia di polimerizzazione e ventilare con azoto secco per un'ora. Quindi, metti la bottiglia di polimerizzazione in un bagno d'olio a 70 gradi Celsius e lasciala reagire per 24 ore sotto l'atmosfera di azoto.
Il giorno successivo, raffreddare la bottiglia di polimerizzazione a zero gradi Celsius e aprire il tappo di gomma per terminare la soluzione del processo di polimerizzazione. Per cominciare, seminare cellule MCF-7 nei pozzi di una piastra di sei po 'ad una densità di 20.000 cellule per pozzo. Coltura delle cellule in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per 12 ore.
Successivamente, sostituire il mezzo di coltura con il mezzo di coltura fresco contenente polimero cationico e poliplex pDNA di diverso rapporto tra rapporto azoto-fosforo. Coltura delle cellule per sei ore, quindi sostituire il mezzo con due millilitri di mezzo RPMI 1640 fresco. Continuare a coltivare per 48 ore.
Quindi, raccogliere le cellule e utilizzare un citometro a flusso per rilevare la fluorescenza verde. In questo studio, i copolimeri a blocchi biocompatibili funzionalizzati alla meionina vengono preparati attraverso il metodo reversibile di trasferimento della catena di addizione-frammentazione e viene studiata la capacità di carnagione del DNA plasmide dell'mBG ottenuto e la loro efficienza di trasfezione. La dimensione media delle particelle e il potenziale zeta dei poliplex mBG/pDNA sono 124 nanometri e più 15,7 millivolt, rispettivamente, con un rapporto N-P di 16.
Il ritardo elettroforetico rivela che il pDNA con un rapporto N-P pari a zero può muoversi senza ritegno nel gel di agarosio ed è osservato come una striscia nell'imager del gel. Quando il pDNA è complesso con mBG, il movimento del pDNA è ritardato e, successivamente, la luminosità della banda viene ridotta. Ciò dimostra che mBG può complessare completamente il pDNA quando la N a P è superiore a quattro.
La citotossicità dei poliplex mBG/pDNA viene quindi misurata utilizzando il saggio MTT standard Questi risultati mostrano che i poliplex mBG/pDNA hanno citotossicità rispetto ai polilessi PEI/pDNA ai rapporti N-p di quattro, otto, 16 e 32. Come si può anche vedere, la citotossicità dei polilessi mBG/pDNA aumenta con un aumento del rapporto N-P. Questo aumento della citotossicità è il risultato del componente GPMA caricato positivamente.
Il rapporto N-P utilizzato nell'esperimento di trasfezione del pDNA viene selezionato in base ai risultati della citotossicità. Le capacità di trasfezione di mBG1, mBG2 e mBG3 vengono confrontate misurando l'intensità di fluorescenza della GFP, e i risultati hanno mostrato che mBG3 è il vettore genico ottimale. È importante esaurire l'aria dal pallone a fondo rotondo del limo e mantenere la temperatura di reazione.
I portatori di farmaci polimerici ottenuti possono essere applicati alla co-somministrazione di farmaci chemioterapici e farmaci genetici per trattare sinergisticamente il cancro resistente ai farmaci. Il meccanismo molecolare di combinazione di farmaci genetici e farmaci chemioterapici può essere ulteriormente esplorato per il trattamento di tumori resistenti ai farmaci. L'acetone è classificato come a bassa tossicità per la sua tossicità acuta.
Le chiavi, l'inalazione o il contatto con gli occhi o la pelle devono essere evitati. Evitare il rischio di scottature durante la procedura di riscaldamento.
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Panoramica
Questo studio presenta un metodo rapido e semplice per sintetizzare vettori di farmaci polimerici cationici utilizzando il metodo di polimerizzazione a trasferimento di catena reversibile con addizione-frazionamento (RAFT). I copolimeri a blocchi biocompatibili funzionalizzati con metionina (mBG) sintetizzati sono stati valutati per la loro capacità di complessare il DNA plasmidico e la loro efficienza di trasfezione.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Chimica dei polimeri
- Terapia genica
- Sistemi di somministrazione dei farmaci
Sfondo
- I vettori di farmaci polimerici cationici offrono stabilità e bassa immunogenicità.
- La polimerizzazione RAFT consente un peso molecolare e una struttura controllati.
- Questi vettori possono trasportare più farmaci per un trattamento collaborativo.
- Il controllo preciso della temperatura di reazione è cruciale per una sintesi di successo.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo per sintetizzare copolimeri a blocchi biocompatibili.
- Investigare la capacità di complessazione del DNA dei polimeri sintetizzati.
- Valutare l'efficienza di trasfezione dei vettori di farmaci.
Metodi utilizzati
- Polimerizzazione a trasferimento di catena reversibile con addizione-frazionamento (RAFT).
- Sintesi di copolimeri a blocchi funzionalizzati con metionina.
- Valutazione della capacità di complessazione del DNA plasmidico.
- Valutazione dell'efficienza di trasfezione.
Risultati principali
- I mBG sintetizzati hanno dimostrato un'efficace complessazione del DNA plasmidico.
- L'efficienza di trasfezione è stata valutata con successo.
- La polimerizzazione RAFT si è dimostrata vantaggiosa per la sintesi di polimeri funzionalizzati.
- Il metodo permette la somministrazione simultanea di più farmaci.
Conclusioni
- Lo studio ha sviluppato con successo un metodo per sintetizzare mBG.
- Questi polimeri biocompatibili mostrano promessa per le applicazioni di terapia genica.
- Ulteriori ricerche potrebbero migliorarne l'efficacia nella somministrazione dei farmaci.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This work presents a RAFT polymerization-based method for synthesizing methionine-functionalized biocompatible block copolymers capable of complexing plasmid DNA, offering a tunable platform for gene delivery vector development. The ability to control molecular weight, charge ratio, and particle size enables predictive design of non-viral carriers with reduced cytotoxicity compared to PEI, supporting early-stage de-risking of nucleic acid therapeutics. Such systems address the need for scalable, reproducible polymer synthesis in preclinical discovery workflows where mechanistic clarity and formulation consistency impact go/no-go decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of polymer-DNA interactions through quantifiable complexation at defined N/P ratios, supporting target validation via controlled gene delivery.
- Operational Value: Provides a reproducible synthesis route for cationic block copolymers with tunable methionine and guanidine functionalization, reducing variability in early screening assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates well-defined polyplexes with measurable zeta potential (+15.7 mV at N/P 16) and size (124 nm), enabling standardized assessment of transfection efficiency and cytotoxicity.
- Operational Value: Facilitates high-throughput screening of polymer variants (mBG1, mBG2, mBG3) by linking APMA content (21%, 37%, 52%) to functional outcomes in gene transfer assays.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates complete plasmid DNA retardation at N/P >4, indicating reliable cargo protection—a key preclinical benchmark for vector stability.
- Operational Value: Supports formulation screening across N/P ratios (8, 16, 4) to identify optimal transfection conditions while monitoring cytotoxicity trends linked to GPMA content.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling synthesis of defined gene carriers for lead identification in nucleic acid delivery, where polymer structure-function relationships inform advancement decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on polymer-mediated gene delivery by providing quantifiable outputs (particle size, zeta potential, transfection efficiency) to correlate structure with biological activity.
- Screening: Enables assay-ready polyplex production with consistent size (100–200 nm at N/P 16–32) and surface charge, improving reproducibility across compound evaluation campaigns.
- Analytics: Generates measurable biophysical readouts (N/P ratio, zeta potential, electrophoretic retardation) that allow comparative analysis of polymer variants under standardized conditions.
- Translational Research: Connects polymer design to preclinical relevance through demonstrated pDNA complexation and reduced cytotoxicity relative to PEI, supporting risk-adjusted advancement.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular RAFT-based platform adaptable to other functional amino acids or therapeutics, promoting cross-project standardization in polymer synthesis.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in gene carrier performance by linking molecular design (methionine/guanidine content) to DNA binding and transfection outcomes.
- Operational Value: Delivers a scalable, purification-friendly synthesis protocol using acetone precipitation and RAFT control, improving batch-to-batch consistency.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by offering a lower-cytotoxicity alternative to PEI, enabling better go/no-go decisions in nucleic acid therapeutic development.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of polymer leads (e.g., mBG3 as optimal carrier) based on transfection efficiency and safety profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RAFT polymerization, including freeze-pump-thaw degassing and inert atmosphere handling.
- Dependent on precise temperature control (oil bath at 70°C) and specialized reagents (ACVA, CTP) for reproducible block copolymer synthesis.
- Necessitates analytical infrastructure for GPC, zeta potential, particle sizing, and fluorescence-based transfection assays to evaluate polyplex performance.
- Adaptation to other cell lines or payloads may require re-optimization of N/P ratio and cytotoxicity assessment due to variable GPMA-mediated effects.
- Practical limitations include the need for multi-step purification and sensitivity to oxygen during polymerization, which must be mitigated via rigorous degassing protocols.
