Name: Isolamento, fissazione e immunofluorescenza Imaging delle ghiandole adrenali Mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Impara l'isolamento, la fissazione e l'immunofluorescenza delle ghiandole surrenali di topo per studiare la zonazione surrenale e l'identità cellulare preservando la morfologia tissutale.

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Ringraziamo il Dr. Mohamad Zubair per i suoi utili suggerimenti e assistenza tecnica alla creazione di questo protocollo. Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of Diabetes e digerente e malattie renali, istituti nazionali di salute Research Grant 2R01-DK062027 (per Gallucci).

Tutti i metodi sono stati effettuati secondo protocolli istituzionalmente approvati sotto gli auspici del Comitato Università sull'uso e la cura degli animali presso l'Università del Michigan.
1. preparazione per la chirurgia
<ol><li>Il giorno prima dell'intervento chirurgico, preparare la paraformaldeide al 4% (PFA) / tampone fosfato salino (PBS). In caso di aliquote congelate, procedere a scongelare uno e conservare a 4 ° C. Nota: 4% PFA non è stabile per più di 48 h. Attenzione: PFA è tossico, evitare il contatto con pelle e occhi e gettare in un contenitore appropriato.</li>
	<li>Il giorno dell'intervento chirurgico, preparare gli strumenti chirurgici di sterilizzazione le forbici e pinze con 70% di etanolo (EtOH) e lasciarle asciugare su della carta assorbente.</li>
	<li>Luogo pieno di una piastra a 24 pozzetti con PBS 1X (1 mL/pozzetto è sufficiente) in un secchio di ghiaccio. Nota: Le ghiandole surrenali verranno mantenute in questo piatto multi-pozzetto cultura dopo la chirurgia.</li>
</ol>2. adrenale dissezione
<ol><li>Eutanasia il mouse seguendo protocolli standard approvati dalla istituzionale Animal Care and uso Committee (IACUC). È necessario un metodo secondario dell'eutanasia per assicurare la morte (ad esempio decapitazione).<ol>
<li>Per l'eutanasia per overdose di isoflurano, posizionare il mouse in una camera piena di vapori di isoflurano, fino a quando non cessa di respirazione, quindi rimuovere il mouse dalla camera, collocarlo su una superficie ed eseguire dislocazione cervicale. Nota: La maggior parte dei metodi di eutanasia provocare disagio per l'animale e non sono adatti per gli studi di stress perché essi possono aggiungere la variabile di confusione dell'attivazione dell'asse ipofisi-surrene e rilascio di catecolamine midollare. In questo caso, la decapitazione è la tecnica suggerita da adottare.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Posare il mouse Supino, sterilizzare l'area incisione sull'addome e fianchi con 70% EtOH. Nota: Mentre rasatura aumenterà la sterilità, per questa particolare applicazione non è necessario.</li>
	<li>Tagliare la pelle al centro dell'addome utilizzando le forbici, separare la pelle dal peritoneum, deskin il mouse pizzicare la pelle intorno il taglio e tirandolo in direzioni opposte (caudale e rostrale). Poi tagliare il peritoneo fino a raggiungere i fianchi posteriori sinistro e destro.</li>
	<li>Rimuovere il taglio della ghiandola surrenale murino intorno il tessuto adiposo circostante e inserirlo nella piastra 24-pozzetti riempito con 1x PBS e tenuta su ghiaccio.</li>
</ol>3. rimozione di grasso Peri-adrenali
<ol><li>Sotto un microscopio per dissezione, collocare le surrenali su un vetro base o una piastra di Petri sul piatto fase, posizionare la sorgente di luce, selezionare l'ingrandimento e regolare la messa a fuoco per ottenere una visione chiara dell'intera adrenale. Nota: L'ingrandimento utilizzato può variare a seconda delle preferenze personali. Un ingrandimento totale di 30 X con una lente piano 1 X, zoom 3x e oculare 10x permette di visualizzare l'intera ghiandola con un buon campo di vista.</li>
	<li>Rimuovere rapidamente i tessuti grassi adiacenti con due aghi 25g, evitando la disidratazione dell'adrenale. Se questo accade prima che tutto il grasso viene rimosso, mossa adrenale indietro nel pozzo contenente 1X PBS per 1 – 2 min e poi continuare con il processo di rimozione di grasso.</li>
	<li>Lavare 2x per 2 minuti ciascuno, in PBS 1X.</li>
</ol>4. tessuto lavorazione e incorporamento
<ol><li>Difficoltà i tessuti in 4% PFA/PBS a 4 ° C su una piattaforma a dondolo per 2 h.</li>
	<li>Rimuovere il 4% PFA e lavare i tessuti con PBS 1X, 3x per 15 minuti ciascuno, a 4 ° C. Attenzione: PFA è tossico ed è un rifiuto pericoloso; deve essere maneggiato con cautela sotto una cappa chimica e disposti in un contenitore di rifiuti pericolosi.</li>
	<li>Incubare le ghiandole surrenali in 50% EtOH a 4 ° C su una piattaforma a dondolo per 2 h.</li>
	<li>Incubare le ghiandole surrenali nel 70% EtOH a 4 ° C su una piattaforma a dondolo per un minimo di 2 h. Nota: Se non procedendo con lavorazione per l'incorporamento del tessuto, le ghiandole surrenali possono essere memorizzate in 70% EtOH a 4 ° C. Evitando la conservazione a lungo termine in 70% EtOH e procedere al tessuto lavorazione appena possibile produce campioni di qualità migliori.</li>
	<li>Preparare le surrenali per lavorazione da avvolgendolo in garza e incorporarla in un tessuto che cassetta del tessuto. Posizionare la cassetta in un vaso riempito con 70% EtOH e conservare a 4 ° C fino al momento di spostare il processatore di tessuti. Inserire la cassetta nel processatore di tessuti programmato come riportato nella tabella 1 ed eseguire il programma.</li>
	<li>Trasferire la cassetta in una stazione di incorporamento riempita con paraffina fusa a 65 ° C. Nel caso in cui una stazione di raffreddamento non è disponibile, posizionare un vassoio di raffreddamento freddo accanto ad essa.</li>
	<li>Etichettare un'incorporamento muffa e aprire il tessuto l'incorporamento di cassetta. Utilizzando un paio di pinze, scartare la garza e posizionare le surrenali delicatamente nella posizione desiderata al centro della base nello stampo incorporamento. Versare la paraffina fusa su adrenale. Se necessario, è possibile tenere adrenale con pinze per consolidare la sua posizione nello stampo altrimenti esso può muoversi all'interno dello stampo.</li>
	<li>Delicatamente spostare lo stampo incorporamento per il vassoio di raffreddamento e attendere l'indurimento della paraffina. Dopo di che, per facilitare il sezionamento, memorizzare l'incorporamento stampi in un luogo fresco.</li>
</ol>5. sezionamento con un microtomo rotativo
<ol><li>Controllare che il microtomo sia pulito prima di iniziare, spazzare via tutti i residui di paraffina scartati, assicurarsi che il coltello (o lama) è affilato, il meccanismo interno di olio e retrarre completamente del supporto del blocco se necessario.</li>
	<li>Etichettare una serie di vetrini da microscopio (positivamente caricata o rivestito per evitare la perdita di tessuto (Vedi Tabella materiali)), stenderli su un insieme di diapositive più caldo a 37 ° C ed erogare alcuni acqua ultrapura in autoclave di tipo 1 in cima a ogni diapositiva.</li>
	<li>Impostare lo spessore di sezione a 5 µm.</li>
	<li>Inserire la lama del microtomo del portalama, controllare l'angolo della lama, assicurarsi che la lama è fissata saldamente nel supporto e verificare il gioco del blocco di paraffina e supporto del blocco.</li>
	<li>Portare il titolare di blocco nella posizione più alta e, se possibile, bloccare la leva d'armamento, rimuovere il blocco di paraffina dallo stampo e inserirlo nel supporto blocco fissandolo saldamente con il morsetto. L'angolo della linea centrale della lama con la superficie di rivestimento del blocco dovrebbe essere di circa 20°. Se necessario, regolare di nuovo il blocco di paraffina. Attenzione: La lama è affilata.</li>
	<li>Se precedentemente bloccato, sbloccare la rotella di mano e abbassare il blocco di paraffina fino a quando il suo volto è a livello con il bordo della lama del microtomo. Ruotare la rotella di mano con un ritmo costante. Eseguire la rimozione iniziale per rimuovere la paraffina ed esporre le surrenali.</li>
	<li>Mantenere girando la rotella di mano e la sezione fino alla fine dell'adrenale. Utilizzare un microscopio a campo chiaro o dissezione per verificare la presenza di tessuto nelle sezioni. Togliere il nastro dalla lama e con l'aiuto di un'altra coppia di pinze posarla sull'acqua posato su vetrino. Può essere utile posizionare il nastro su una superficie, allungarlo con attenzione e quindi montarla sulla diapositiva.</li>
	<li>Asciugare i vetrini sulla piastra calda. Stendetele piatta su un vassoio di diapositiva, quindi infornare a 37 ° C durante la notte o più, se l'acqua è ancora presente. Una volta asciutto, è possibile conservare i vetrini in una scatola di diapositiva a temperatura ambiente.</li>
	<li>Riporre tutte le attrezzature usate e pulire il microtomo.</li>
</ol>6. immunofluorescenza
<ol><li>Selezionare le diapositive per immunostaining e metterli in un portavetrini.</li>
	<li>Su un piatto caldo, portare un becher pieno di 0,01 M citrato a pH 2.0 a bollire. Il volume del buffer dipende dalle dimensioni Becher e deve essere sufficiente per coprire le sezioni sulle diapositive durante l'ebollizione (alcuni evaporazione deve essere presa in considerazione). Coprire il recipiente con carta stagnola. Nota: Altri metodi di ricupero dell'antigene sono disponibili (Vedi discussione).</li>
	<li>Deparaffinizzare le diapositive in xilene 100% 2 x per 5 minuti ciascuno. Reidratare le diapositive utilizzando la seguente serie: 100% EtOH 2 x per 5 min, 70% EtOH 2 x per 5 min, digitare 1 acqua ultrapura per 5 min. Nota: Dopo Sparaffinatura, è importante non lasciare che le sezioni asciugarsi: sezioni di tessuto devono essere sempre coperti con buffer o soluzioni fino alla fine della procedura o la struttura del tessuto può essere danneggiata.</li>
	<li>Per ricupero dell'antigene, mettere i vetrini in un supporto a slitta in metallo e inserirlo nel becher con bollente citrato senza il foglio di alluminio. Far bollire per 10 min.</li>
	<li>Rimuovere il recipiente dalla piastra scaldante e lasciarlo raffreddare per 20 min. Assicuratevi che le sezioni adrenale sono ancora coperti con il buffer.</li>
	<li>Preparare la soluzione di blocco. Se usando la macchiatura disponibili in commercio kit impiegato per la Rappresentante risultati (Vedi la Tabella materiali), in una provetta aggiungere 1,25 mL di PBS 1X, 1 goccia (pari a circa 45 µ l) di Mouse Ig reagente bloccante e il 5% di siero di capra normale. Conservare la soluzione bloccante a 4 ° C o su ghiaccio durante il lavoro. Nota: Il siero utilizzato dipende dalla specie ospite di anticorpo secondario. Qui sono stati utilizzati anticorpi secondari generati in capra. Per altri anticorpi, le concentrazioni nel siero diverse può essere necessari. Empiricamente determinare la concentrazione nel siero corretta testando diverse concentrazioni.</li>
	<li>Trasferire i vetrini in una vaschetta di Coplin contenente PBS 1X e lavare 3 x 10 min ciascuno su un rocker con dolce dondolio.</li>
	<li>Preparare una camera umidificata per la colorazione.</li>
	<li>Delicatamente, scrollarsi di dosso il PBS da una diapositiva; pulire la parte inferiore della diapositiva con un panno privo di lanugine per rimuovere l'eccesso di PBS.</li>
	<li>Usando un pennarello speciale per diapositive con proprietà idrofobe, disegnare un cerchio che circonda ogni sezione adrenale, assicurandosi che la superficie di vetro è asciutta per evitare la diffusione della soluzione inchiostro alla sezione. Se necessario, asciugare delicatamente la superficie. Porre il vetrino nella camera umidificata.</li>
	<li>Rapidamente, pipettare 50 µ l (o abbastanza per coprire sezioni) di soluzione su ogni sezione di blocco. Incubare per 1 h a temperatura ambiente. Nota: Blocco volume di soluzione necessario può variare; è importante che le sezioni sono ben coperti con la soluzione.</li>
	<li>Preparare la soluzione di diluente da kit disponibile in commercio con 7,5 mL di PBS 1X, 600 µ l di proteina concentrato siero normale di capra stock soluzione e 5% (o qualsiasi altri siero e concentrazione usata nella soluzione bloccante). Conservare la soluzione diluente a 4 ° C o su ghiaccio durante il lavoro.</li>
	<li>Preparare le soluzioni di anticorpo primario diluendo gli anticorpi primari a concentrazioni appropriate nella soluzione diluente. Per co-macchiatura, aggiungere un'aliquota di ciascun anticorpo in un nuovo tubo e mescolare delicatamente. Mettere gli anticorpi e soluzioni dell'anticorpo sul ghiaccio fino all'uso. Nota: Qui abbiamo impiegato anticorpo anti-SF1 alzato nel coniglio e un anticorpo anti-TH alzato nel topo. Per preparare l'anticorpo allestimenti da seguono come indicato.<ol>
<li>Per la soluzione di lavoro di SF1, in una provetta, aggiungere 1 µ l di anticorpo anti-SF1 a 999 µ l di soluzione diluente (concentrazione finale di 1,5 µ g/mL). Per la soluzione di lavoro del TH, in una provetta, aggiungere 1 µ l anti-TH anticorpo in 499 µ l di soluzione diluente (stimato concentrazione finale di 2-6 µ g/mL).</li>
		<li>Per SF1 + TH mix di lavoro dell'anticorpo, in una nuova provetta, pipettare 250 µ l di soluzione di lavoro di SF1 e 250 µ l di soluzione di lavoro di TH. Mescolare delicatamente pipettando. Conservare il ghiaccio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trasferire i vetrini in una vaschetta di Coplin contenente 1X PBS e lavare 3 volte per 5 minuti ciascuno su un rocker con dolce dondolio.</li>
	<li>Posto le diapositive indietro nella camera umidificata dopo pulire fuori l'eccesso di PBS, pipetta il SF1 + TH anticorpo lavoro mix (o altra soluzione di anticorpo primario) su ogni sezione, chiudere la camera umidificata e lasciarlo tutta la notte a 4 ° C.</li>
	<li>Il giorno seguente, spostare le diapositive in un Coplin barattolo contenente 1X PBS e lavare 3x per 15 min su un rocker con dolce dondolio.</li>
	<li>Mentre ci si lava le diapositive, preparare la soluzione di anticorpo secondario nella soluzione diluente usando la concentrazione appropriata. Se eseguendo co-macchiatura, aggiungere pari quantità di ogni soluzione di anticorpo secondario in un nuovo tubo. Mescolare delicatamente pipettando. Conservare il ghiaccio. Proteggere i tubi dalla luce e conservare il ghiaccio fino all'uso. Nota: Qui, gli anticorpi secondari utilizzati sono 488 nm fluorescente tingere-contrassegnati anti-topo generato in capra e 549 fluorescente tingere-contrassegnati anti-coniglio sollevato in capra. La soluzione di anticorpo secondario è stata preparata con l'aggiunta di 0,5 µ l di ogni anticorpo secondario in 799 µ l di soluzione diluente (concentrazioni finali di 1,2 µ g/mL).</li>
	<li>Porre i vetrini indietro nella camera umidificata dopo aver rimosso l'eccesso di PBS, rapidamente dispensare la soluzione di anticorpo secondario sulle sezioni adrenale, chiudere la camera umidificata e proteggerlo dalla luce. Incubare per 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare i vetrini in una vaschetta di Coplin con 1x PBS e lavare 3x per 15 min su un rocker con dondolio, assicurandosi di proteggerli dalla luce.</li>
	<li>Preparare la soluzione 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), 4' per la macchiatura nucleare: 1 µ l di DAPI (20 mg/mL) in 1 mL di PBS 1X. Nota: Controcolorazione nucleare blu fluorescente può essere ottenuto anche utilizzando colorante Hoechst.</li>
	<li>Pipettare soluzione DAPI sulle sezioni adrenale, coprire dalla luce e incubare a temperatura ambiente per 7 min.</li>
	<li>Lavare i vetrini in una vaschetta di Coplin con 1x PBS e lavare 3 volte per 5 min su un rocker con dondolio, proteggendo i vetrini dalla luce.</li>
	<li>In una zona al riparo da luce diretta, stabilire una copertura vetrata e pipettare 60 µ l o circa 3 gocce di agente di montaggio adatto per immunofluorescenza lungo la superficie del vetro di copertura.</li>
	<li>Strofinare delicatamente la parte posteriore di una diapositiva con un panno privo di lanugine, posizione della diapositiva a faccia in giù verso il vetro di copertura e parallelo ad esso, in modo da affrontano le sezioni di tessuto il vetro di copertura con l'agente di montaggio su di esso. Premere la diapositiva il vetro di copertura leggermente e assicurarsi che nessuna bolla di aria è intrappolata tra la diapositiva e il vetro di copertura.<ol>
<li>Se necessario, applicare una pressione ulteriore per rimuovere le bolle d'aria e l'eccesso di agente di montaggio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fissare il vetrino in un contenitore scuro e la cura a temperatura ambiente per un minimo di 24h (o il tempo indicato nella finestra delle informazioni dell'agente montaggio utilizzato) e quindi procedere a imaging.</li>
</ol>7. imaging
Nota: Un microscopio a fluorescenza collegato ad una macchina fotografica è necessario per il rilevamento e l'acquisizione della fluorescenza emessa dai tessuti dopo l'eccitazione a determinate lunghezze d'onda. Mentre è ovvio, è importante ricordarsi di scegliere il secondario anticorpo coniugato con fluorocromi cui eccitazione e spettri di emissione sono compatibili con le attrezzature disponibili. Impostazioni di imaging variano secondo il microscopio e il software utilizzato per catturare le immagini. Ci sono alcune regole di base che si applicano per sezioni adrenale di imaging, ad esempio per assicurarsi che il tempo di esposizione, fotocamera impostazioni di guadagno e intensità della sorgente luminosa vengono mantenuti costanti.
<ol><li>Accendere la fonte di luce e la fotocamera, avviare il software di imaging seguendo le indicazioni del produttore. Nota: L'ordine di queste azioni può differire a seconda dell'attrezzatura impiegata.</li>
	<li>Proteggere il vetrino sul palco, aprire l'otturatore ed esaminando gli oculari del microscopio utilizzare nucleare colorazione (DAPI) canale e basso ingrandimento (4x) per identificare il tessuto sulla diapositiva: sezioni adrenale sono piccole, e la loro visualizzazione potrebbe richiedere qualche tempo.</li>
	<li>Cambiare per un maggiore ingrandimento (10x), messa a fuoco e chiudere l'otturatore. Nota: È importante evitare inutilmente lunga esposizione alla luce che possono causare photobleaching, con conseguente perdita di segnale.</li>
	<li>Utilizzando i comandi del software, selezionare l'obiettivo (X 10) e il canale in uso (DAPI), regolare il tempo di esposizione (1 s, può essere regolato se il segnale è troppo forte o debole). Se disponibili, impostare binning per formazione immagine dal vivo (non acquisto) su "2 X 2', conversione guadagno 'mid', velocità di lettura a 20 MHz". Se il software utilizzato non Visualizza la barra della scala alla fine dell'imaging, selezionare l'opzione di barra di scala dal menu e la barra di posizione dove desiderato.</li>
	<li>Aprire l'otturatore, regolare nuovamente la messa a fuoco se necessario e cambiare i canali (FITC, TRITC, DAPI). Se il microscopio non è automatico, scattare una foto dell'adrenale in ciascun canale senza spostare il palco e assicurarsi di regolare la selezione del canale in uso. Chiudere l'otturatore una volta finito. Nota: Annotare le impostazioni impiegate nel caso in cui il software non salva automaticamente li.</li>
	<li>Salvare le immagini. Nota: Immagini unite possono essere spesso creati utilizzando software del microscopio o altri pacchetti di software di editor di grafica.</li>
	<li>Formazione immagine di ripetizione per altri settori della sezione e/o con un ingrandimento maggiore. Nota: Un ingrandimento 20 X spesso richiede un tempo di esposizione più breve (cioè, 800 ms).</li>
	<li>Alla fine dell'imaging, spegnere tutte le apparecchiature nell'ordine corretto.</li>
</ol>

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<li>Epp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+CLARITY+for+Clearing+Whole-Brain+and+Other+Intact+Organs%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs.</a> eNeuro. 2 (3), (2015).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo protocollo descrive un metodo per l'isolamento delle ghiandole surrenali del mouse insieme con la preparazione e colorazione delle ghiandole surrenali sezionato paraffina-incastonato del mouse.
Rispetto ad altri protocolli che abbiamo testato, questo protocollo di immunofluorescenza ha dimostrato adatto per la maggior parte degli anticorpi utilizzati nel nostro laboratorio. Tuttavia, in alcuni casi può richiedere qualche aggiustamento per migliorare i risultati di colorazione. Una varia...

Immunohistochemistry è una tecnica per la rilevazione di componenti del tessuto con l'uso di anticorpi contro specifiche molecole cellulari e successive tecniche di colorazione per rilevare gli anticorpi coniugati1. Questa procedura di immunohistochemical richiede particolare attenzione e il trattamento dei tessuti che sono spesso empiricamente determinati per l'antigene specifico, dei tessuti e l'anticorpo utilizzato2. La fissazione è cruciale per mantenere lo stato "originale" del tessuto e quindi mantenendo intatto cellular e strutture subcellulari e modelli di espressione. Ulteriore elaborazione e incorporare procedure necessari per preparare il tessuto per il taglio a fettine sottili che vengono utilizzati per gli studi istologici che coinvolgono immunohistochemistry.
Immunostaining può essere eseguita con rilevamento o cromogenico o fluorescente. Cromogenico rilevamento richiede l'utilizzo di un enzima per convertire un substrato solubile in un prodotto colorato insolubile. Mentre questo enzima può essere coniugato all'anticorpo riconosce l'antigene (anticorpo primario), esso è più spesso coniugata con l'anticorpo che riconosce l'anticorpo primario (cioè, l'anticorpo secondario). Questa tecnica è altamente sensibile; il prodotto colorato risultante dalla reazione enzimatica è fotostabile e richiede solo un microscopio a campo chiaro per l'imaging. Tuttavia, cromogenico immunostaining può non essere adatto quando si tenta di visualizzare due proteine che co-localizzano, poiché la deposizione di un colore può mascherare la deposizione di altro. In caso di co-macchiatura, immunofluorescenza ha dimostrato di essere più vantaggioso. L'avvento dell'immunofluorescenza è attribuita a Albert Coons e colleghi, che ha sviluppato un sistema per identificare gli antigeni del tessuto con anticorpi marcati con fluoresceina e visualizzarli nei tessuti sezionati sotto luce ultravioletta3. Rilevazione della fluorescenza è basato su un anticorpo coniugato con un fluoroforo che emette luce dopo l'eccitazione. Poiché esistono diversi fluorofori con emissioni a lunghezze d'onda (con poca o nessuna sovrapposizione), questo metodo di rilevamento è ideale per gli studi di molte proteine.
Il surrene è un organo accoppiato situato sopra il rene e caratterizzato da due componenti embriologicamente distinte, circondate da una capsula mesenchymal. Corteccia surrenale esterna, derivata dal mesoderma intermedio mesonefrici, secerne ormoni steroidei, mentre il midollo interno, derivato dalla cresta neurale, produce le catecolamine tra cui adrenalina, noradrenalina e dopamina. La corteccia surrenale è istologicamente e funzionalmente suddiviso in tre zone concentriche, con ogni zona che secernono diverse classi di ormoni steroidei: l'esterno zona glomerulare (zG) produce mineralcorticoidi che regolano l'omeostasi dell'elettrolito e volume intravascolare; la centrale zona fascicolata (zF), direttamente sotto il zG, secerne i glucocorticoidi che mediano la risposta allo stress attraverso la mobilitazione delle riserve di energia per aumentare il glucosio del plasma; e i reticularis di zona interna (zR), che sintetizza il sesso precursori steroidei (cioè, del deidroepiandrosterone (DHEAS))4.
Qualche variazione nella zonazione corticosurrenale è presente tra le specie: per esempio, Mus musculus manca la zR. X-zone postnatale unica di M. musculus è un residuo della corteccia fetale caratterizzata da piccole cellule lipido-poveri con acidofilico citoplasmi5. X-zone scomparirà alla pubertà nei topi maschi e dopo la prima gravidanza nei topi femmina, o gradualmente degenera in femmine di razza non6,7. Inoltre, la tortuosità e lo spessore delle esposizioni zG segnato variazione tra le specie come organizzazione delle cellule staminali e progenitori periferiche in ed adiacente la zG. Il ratto, a differenza di altri roditori, ha una zona indifferenziata visibile (zU) tra il zG e zF che funzioni come una zona di cellule staminali e/o una zona del transiente amplificando progenitori. Se il zU è unica ai ratti o semplicemente un più prominente organizzato aggregato di cellule è sconosciuto8,9.
Le cellule della corteccia surrenale contengono goccioline lipidiche contenenti esteri del colesterolo che servono come il precursore di tutti gli ormoni steroidei10,11.  Il termine "steroidogenesi" definisce il processo di produzione di ormoni steroidei dal colesterolo tramite una serie di reazioni enzimatiche che coinvolgono l'attività del fattore steroidogenico 1 (SF1), la cui espressione è un indicatore del potenziale steroidogenic. Nella ghiandola adrenale, Sf1 espressione è presente solo nelle cellule della corteccia12. Un interessante studio ha trovato l'espressione di biotina endogena in cellule corticosurrenali con potenziali steroidogenic13. Mentre questo può essere la causa di un più elevato background in metodi di colorazione biotina/streptavidina-base, a causa del rilevamento di biotina endogena di anticorpo coniugato con streptavidina, questa caratteristica potrebbe essere impiegata anche per distinguere il steroidogenic cellule da altre popolazioni all'interno della ghiandola surrenale, cioè, endoteliale, capsulare e cellule di midollo.
Innervati dai neuroni preganglionic simpatici, il midollo surrenale è caratterizzato da cellule basophilic con un citoplasma granulare contenente epinefrina e norepinefrina. Cellule di midollo sono denominate "cromaffine" grazie all'elevato contenuto di catecolamine che formano un pigmento marrone dopo ossidazione14. Tirosina idrossilasi (TH) è l'enzima che catalizza la tappa limitante della sintesi delle catecolamine e, nella ghiandola adrenale, è espresso solo nel midollo15.
Qui presentiamo un protocollo per l'isolamento delle ghiandole surrenali di mouse, loro elaborazione per l'incorporamento in paraffina e sezionamento e un metodo per eseguire immunofluorescenza su sezioni adrenale di colorazione al fine di identificare i tipi cellulari che costituiscono il corteccia surrenale e nel midollo. Questo protocollo è uno standard nel nostro laboratorio per immunostaining con gli anticorpi più abitualmente utilizzati nella nostra ricerca.

<table><tbody><tr><td>piastra per coltura cellulare a 24 pozzetti</td><td>Nest Biotechnology Co.</td><td>0412B</td><td></td></tr><tr><td>Aghi monouso 25 G x 5/8"</td><td>Exel International</td><td>26403</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast plus</td><td>McCormik scientific</td><td>39502004</td><td>Paraffina per l'inclusione dei tessuti</td></tr><tr><td>Cassette per biopsia Shandon II con coperchio attaccato</td> Cassette <td>per 1001097</td><td>termoscientifiche</td><td>per il trattamento dei tessuti</td></tr><tr><td>Lame per microtomo ad alto profilo</td><td>Accu-Edge</td><td>4685</td><td>Lame monouso in acciaio inossidabile</td></tr><tr><td>Stampi monouso per l'inclusione di tessuti in plastica Peel-a-way Polysciences</td><td>Inc.</td><td>18986</td><td>Troncato, 22 mm quadrato superiore rastremato a 12 mm inferiore</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Vetrini per microscopio</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Chemical</td><td>X5P1GAL&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>200 Prova Etanolo</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Certi-Pad Garze</td><td>Sicurezza certificata Mfg, Inc</td><td>231-210</td><td>3" x 3. Garze sterili prive di lattice</td></tr><tr><td>Kit M.O.M.</td><td>Vector laboratories</td><td>BMK-2202</td><td>Per il rilevamento di anticorpi primari di topo su tessuto di topo</td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td>Salviette 4,4 pollici x 8,4 pollici</td></tr><tr><td>Super PAP PEN</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>00-8899</td><td>Penna per disegnare su vetrini</td></tr><tr><td>Vetro di copertura del microscopio&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>12-544-D</td><td>Dimensioni: 22 x 50 x 1,5</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542&nbsp;</td><td>(Preparato in brodo da 20 mg/mL)</td></tr><tr><td>Reagente antifading ProLong Gold</td><td>Sonde molecolari</td><td>P36930</td><td>Agente di montaggio per immunofluorescenza</td></tr><tr><td>serie X-cite 120Q</td><td>Lumen Dynamics</td><td></td><td>Sorgente luminosa</td></tr><tr><td>Coolsnap Myo</td><td>Photometrics</td><td></td><td>Camera</td></tr><tr><td>Optiphot-2&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscopio microtomo</td><td>American Optical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue embedder</td><td>Leica</td><td>EG1150 H&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Processatore di tessuti&nbsp;</td><td>Leica</td><td>ASP300S</td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra normale</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Topo anti-TH</td><td>Millipore</td><td>MAB318</td><td>Anticorpo primario</td></tr><tr><td>Coniglio anti-SF1</td><td>Ab proteintech group (PTGlabs)</td><td>&nbsp; su misura</td><td>anticorpo primario</td></tr><tr><td>Alexa-488 topo IgG&nbsp; capra allevata</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-545-003</td><td>Anticorpo secondario</td></tr><tr><td>Dylight-549 Capra allevata IgG di coniglio</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-505-003</td><td>Anticorpo secondario</td></tr><tr><td>Citrato acido anidro</td><td>Fisher Chemical</td><td>A940-500</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements Ricerca di base&nbsp;</td><td>Software Nikon</td><td></td><td>per l'imaging</td></tr></tbody></table>

isolamento, fissazione e immunofluorescenza imaging delle ghiandole adrenali mouse

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

L'immunofluorescenza è una tecnica affermata per il rilevamento degli antigeni nei tessuti con l'impiego di anticorpi coniugati fluorocromo e ha un ampio spettro di applicazioni. Rilevamento degli antigeni permette per la caratterizzazione ed identificazione di più tipi di cellule. Situato sopra i reni e incapsulati da uno strato di cellule mesenchimali, il surrene è un organo endocrino, composto da due tessuti differenti con differenti origini embriologiche, mesonephric intermedia derivati mesoderma corteccia esterna e neurali derivati dalla cresta midollo interno. La corteccia surrenale secerne steroidi (cioè, i mineralcorticoidi, glucocorticoidi, ormoni sessuali), mentre il midollo surrenale produce catecolamine (cioè, adrenalina, noradrenalina). Durante lo svolgimento di ricerca adrenale, è importante essere in grado di distinguere le uniche cellule con funzioni diverse. Qui forniamo un protocollo sviluppato nel nostro laboratorio che descrive una serie di passi sequenziali necessarie per ottenere la colorazione di immunofluorescenza per caratterizzare i tipi di cellule della ghiandola surrenale. Prima ci concentriamo sulla dissezione delle ghiandole surrenali del mouse, la rimozione microscopica del grasso di periadrenal seguita dalla fissazione, elaborazione e inclusione in paraffina del tessuto. Descriviamo quindi la divisione dei blocchi di tessuto con un microtomo rotativo. Infine, abbiamo dettaglio un protocollo per la macchiatura immunofluorescente delle ghiandole adrenali che abbiamo sviluppato per ridurre al minimo sia non specifico anticorpo che lega e autofluorescenza al fine di ottenere un segnale ottimo.

Figura 1 rappresenta lo schema dell'intero protocollo descritto in precedenza. Ghiandole surrenali vengono raccolte dai topi, tessuto adiposo adiacente viene rimosso sotto un microscopio per dissezione e adrenale sono fissate in 4% PFA. Dopo questo passaggio, le ghiandole surrenali sono elaborate e inclusi in paraffina e sezionate con un microtomo per tagliare l'organo in fette sottili che si depositano su vetrini da microscopio. Dopo l'essiccazione delle sez...

Qui presentiamo un metodo per isolare ghiandole surrenali da topi, difficoltà i tessuti, sezione loro ed eseguire la colorazione di immunofluorescenza.

Isolamento, fissazione e immunofluorescenza Imaging delle ghiandole adrenali Mouse

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

L'immunofluorescenza è un metodo di base che può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo surrenale sulla zonazione surrenale, l'identità cellulare e la funzione. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente lo studio di più proteine preservando la morfologia del tessuto surrenale. Per rimuovere la ghiandola surrenale murina, tagliare intorno al tessuto adiposo circostante e posizionare la ghiandola in un pozzo di una piastra a 24 polilitri contenente PBS fresco sul ghiaccio.Trasferire la ghiandola su una piastra di Petri o un supporto di vetro al microscopio sezionato e utilizzare due aghi calibro 25 per rimuovere il tessuto adiposo adiacente. Quando tutto il grasso è stato rimosso, fissare il tessuto in paraformaldeide al 4% a quattro gradi Celsius con dondolo per due ore. Alla fine dell'incubazione, sciacquare la ghiandola con tre lavaggi di 15 minuti a quattro gradi Celsius in uno o due millilitri di PBS fresco per lavaggio.Dopo l'ultimo lavaggio, disidratare la ghiandola in due immersioni sequenziali di etanolo a quattro gradi Celsius con dondolo per due ore per incubazione. Per preparare il tessuto surrenale per la lavorazione, avvolgere la ghiandola in garza e racchiudere la surrenalica in una cassetta che incorpora tessuti. Quindi, posizionare la cassetta in un barattolo riempito con 70%etanolo per uno stoccaggio di quattro gradi Celsius fino alla lavorazione.Per elaborare il tessuto, inserire la cassetta nel processore tissutale per la lavorazione come indicato nella tabella. Alla fine del programma, trasferire la cassetta in una stazione di incorporamento piena di paraffina 65 gradi fusa e utilizzare un paio di forcep per scartare la garza. Trasferire delicatamente la surrenalica nella posizione appropriata al centro della base dello stampo di incorporamento e versare la paraffina fusa sulla ghiandola.Quindi, spostare attentamente lo stampo di incorporamento su un vassoio di raffreddamento per facilitare l'indurimento della paraffina. Prima di sessare con microtomo rotante, etichettare una serie di vetrini al microscopio e posare le diapositive su uno scaldascivolo Celsius di 37 gradi. Distribuire circa 450 microlitri di acqua ultra pura di tipo autoclavato su ogni scivolo e impostare lo spessore di taglio della sezione del microtomo su cinque micrometri.Caricare il tessuto incorporato sul blocco di taglio e abbassare il blocco di paraffina fino a quando il campione non è a livello del viso con il bordo della lama del microtomo. Ruotando il volantino con un ritmo costante, eseguire un taglio iniziale per rimuovere la paraffina ed esporre il tessuto surrenale. Quindi, acquisire cinque sezioni di micrometro attraverso l'estremità della ghiandola surrenale usando le forcep per trasferire ogni sezione nella goccia d'acqua su uno dei vetri pre-etichettati man mano che viene raccolta.Dopo aver confermato la presenza di tessuto nelle sezioni per microscopia, asciugare gli scivoli sulla piastra calda per circa due ore e cuocerli almeno durante la notte su una slide tray a 37 gradi Celsius fino a quando non è visibile più acqua. Una volta asciutti, conservare le diapositive in una slide box a temperatura ambiente. Per il recupero dell'antigene ad immunofluorescenza, de-paraffinare le diapositive con due immersioni di cinque minuti al 100% di xilene, seguite da reidratazione in una serie di immersione in etanolo e acqua discendente.Dopo l'immersione in acqua, trasferire gli scivoli su un supporto per vetrini metallici e posizionare il supporto in un bicchiere di citrato molare bollente 0,01 su una piastra calda per 10 minuti. Alla fine dell'incubazione, rimuovere il becher dalla piastra calda e lasciarlo raffreddare per 20 minuti, facendo attenzione che tutte le sezioni surrenali siano ancora coperte di tampone. Quando il becher viene raffreddato, trasferire gli scivoli in un barattolo coplin per tre lavaggi di 10 minuti in PBS fresco con un leggero dondolo.Dopo l'ultimo lavaggio, pulire con cura la superficie di ogni diapositiva senza danneggiare le sezioni tissutali e utilizzare un marcatore idrofobico per creare un cerchio intorno a ogni sezione. Posizionare i vetrini in una camera umidificata e aggiungere rapidamente almeno 50 microlitri di soluzione di blocco ad ogni sezione per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione di blocco, lavare gli scivoli tre volte in PBS fresco per cinque minuti per lavaggio con dondolo e restituire gli scivoli alla camera.Successivamente, aggiungere il cocktail di anticorpi primari di interesse a ogni sezione per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius. La mattina seguente, lavare i campioni con tre lavaggi di 15 minuti in PBS fresco per lavaggio ed etichettare i vetrini con l'appropriata soluzione anticorpale secondaria per un'ora protetta dalla luce. Al termine dell'incubazione, lavare i campioni con tre lavaggi di 15 minuti su un rocker protetto dalla luce, etichettando i nuclei delle sezioni con DAPI per sette minuti a temperatura ambiente protetti dalla luce dopo l'ultimo lavaggio.Dopo tre lavaggi PBS di cinque minuti con dondolo, aggiungere 60 microlitri di agente di montaggio adatti all'immunofluorescenza lungo la superficie di un vetro di copertura per campione e premere leggermente ogni sezione del tessuto di scorrimento sul vetro di copertura, facendo attenzione ad evitare bolle. Quindi, posare ogni scivolo piatto in un contenitore scuro per la polimerizzazione a temperatura ambiente per almeno 24 ore prima dell'imaging. Durante il processo di rimozione del grasso, è fondamentale non lasciare asciugare la ghiandola surrenale poiché la disidratazione può danneggiare la struttura del tessuto.A seguito di una rimozione riuscita del tessuto adiposo circostante, la ghiandola surrenale dovrebbe essere facilmente rilevabile senza grasso visibile aggiuntivo. L'immunosottenzione delle sezioni di ghiandola surrenale come dimostrato rivela il fattore steroidogenico nucleare una colorazione delle cellule adrenocorticali, la colorazione dell'idrossilasi tirosina delle cellule midollari, la colorazione DAPI dei nuclei delle cellule non steroidogeniche della capsula esterna e la co-colorazione con cellule adrenocorticali e midollari. Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare che le surrenali del mouse sono piccole e che le loro posizioni sono in qualche modo variabili rendendo difficile il loro rilevamento.Pertanto, è fondamentale avere una visione chiara dell'area durante la dissezione. Queste procedure sono tecniche di base per lo studio della ghiandola surrenale in vivo. A seguito di questi, è possibile eseguire ulteriori metodi di immunosocienza per soddisfare specifiche esigenze scientifiche.Dopo il suo sviluppo, l'immunostaining ha spianato la strada ai ricercatori nei campi della scienza biomedica per esplorare l'espressione proteica in situ, uno strumento utile in molte discipline e campi.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Midollare surrenale cromaffini sistemi di colture cellulari sono estremamente utili per lo studio della secrezione di accoppiamento eccitazione-in un ambiente in vitro. Questo protocollo illustra il metodo utilizzato per analizzare le ghiandole surrenali e quindi isolare la regione midollare strappando via la corteccia surrenale. La digestione del midollo in singole cellule cromaffini è poi dimostrato.

Topo surrenale cromaffini cella di isolamento

Questo video mostra un test per eseguire l'immunocolorazione multiplex utilizzando anticorpi primari della stessa specie ospite. In questo metodo, una sezione di tessuto surrenale viene sottoposta a un processo di immunocolorazione in due fasi. Inizialmente, la sezione viene colorata con anticorpi specifici per i marcatori nella corteccia, seguita dalla rimozione dell'anticorpo legato e dalla ricolorazione con anticorpi specifici per i marcatori nel midollo.

Un metodo di immunocolorazione multiplex che utilizza anticorpi primari della stessa specie ospite

Ad alta risoluzione intravital immagini con maggiore contrasto fino a 120 micron di profondità in linfonodi di topi adulti si ottiene spazialmente modulando il pattern di eccitazione di un microscopio a due fotoni multifocale. In 100 micron di profondità abbiamo misurato risoluzioni di 487 nm (laterali) e 551 nm (assiale), eludendo così dispersione e diffrazione limiti.

Altamente Risolto intravitale Striped-illuminazione Microscopia dei Centri Germinal

Dopo l'esocitosi, la membrana plasmatica fusa viene recuperata attraverso un processo noto come endocitosi. Questo meccanismo riforma le nuove vescicole sinaptiche per il successivo ciclo di rilascio. I singoli eventi endocitici vengono catturati e analizzati attraverso l'uso delle registrazioni della capacità attaccata alle cellule nelle cellule cromaffini surrenaliche di topo.

Metodi per cellulari-attached Misure di capacità in mouse surrenale cromaffini cellulare

Il protocollo immunofluorescenza indiretta descritto in questo articolo consente il rilevamento e la localizzazione delle proteine ​​nella ghiandola mammaria del mouse. Un metodo completo è dato per la preparazione di campioni della ghiandola mammaria, per eseguire immunoistochimica, per l'immagine delle sezioni di tessuto al microscopio a fluorescenza, e di ricostruire le immagini.

Immunofluorescenza indiretta su sezioni congelate di mouse ghiandola mammaria

Vi presentiamo un metodo per l'isolamento e la cultura del dotto di Wolff mouse (WD). Abbiamo anche dimostrare una procedura dettagliata per tutto il monte immunocolorazione di coltura / WD appena isolate con anticorpi con tag fluorescenza. Insieme, queste tecniche consentono lo studio dello sviluppo WD, spiralatura, e differenziazione.

Organo cultura e monte intero immunofluorescenza colorazione di mouse di Wolff Condotti

Vi presentiamo un protocollo per sezionare le ghiandole pituitarie e preparare sezioni coronali pituitarie da topi di sviluppo.

Dissezione e preparazione coronale fetta di sviluppare la ghiandola pituitaria del Mouse

Sono stati stabiliti diversi metodi per l'immunostaining multiplex utilizzando anticorpi primari della stessa specie ospite. Qui, descriviamo l'uso di anticorpi mediati a microonde e di fluoroforo-tiramide per bloccare la reattività incrociata dell'anticorpo durante l'immunostaining multiplex su sezioni adrenali del topo con paraffina fissata in formalina.

Microwaving e Fluorophore-Tyramide per l'immunostainizzazione multiplex sulle intendire del mouse - Utilizzo di anticorpi primari non conformi della stessa specie ospite

Questo protocollo descrive una tecnica di imaging confocale per rilevare tre modalità di fusione nelle cellule cromaffini surrenali bovine. Queste modalità di fusione includono 1) fusione ravvicinata (chiamata anche kiss-and-run), che coinvolge l'apertura e la chiusura dei pori di fusione, 2) la fusione di soggiorno, che coinvolge l'apertura dei pori di fusione e il mantenimento del poro aperto, e 3) la fusione termoretraibile, che coinvolge il restringimento delle vescicole fuse.

Microscopia confocale per misurare tre modalità di dinamica dei pori di fusione nelle cellule cromaffini surrenali

Questo protocollo delinea l'isolamento di progenitori fibro-adipogenici (FAP) scheletrici e cardiaci da topi spinosi (Acomys) tramite dissociazione enzimatica e smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza. I FAP ottenuti da questo protocollo possono essere efficacemente espansi e differenziati a miofibroblasti e adipociti.

Isolamento, espansione e differenziazione dei progenitori fibro-adipogenici dal modello murino spinoso

È stato sviluppato un approccio robusto e riproducibile per stabilire colture primarie 2D di cellule arricchite di zona glomerulosa e zona fascicolata, per la corteccia surrenale del muro. Questo sistema preserva le caratteristiche molecolari e funzionali chiave di ciascuna zona, consentendo un'indagine mirata delle vie di segnalazione, della produzione ormonale e del comportamento delle cellule corticali surrenali ex vivo.

Stabilimento di colture primarie arricchite in zona dalla corteccia surrenale del topo

Impara l'isolamento, la fissazione e l'immunofluorescenza delle ghiandole surrenali di topo per studiare la zonazione surrenale e l'identità cellulare preservando la morfologia tissutale.

Isolamento, fissazione e immunofluorescenza Imaging delle ghiandole adrenali Mouse

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