Purificazione di affinità del cloroplasto Translocon proteina complessi usando il Tag di rubinetto
November 1st, 2018
Qui presentiamo un protocollo collaudato e testato per la purificazione del cloroplasto complessi di importazione della proteina (complesso di TOC-TIC) utilizzando il rubinetto-tag. Il protocollo di affinità-isolamento di uno stadio potenzialmente può essere applicato a qualsiasi proteina ed essere utilizzato per identificare nuovi partners di interazione mediante spettrometria di massa.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dei cloroplasti, ad esempio la composizione dei macchinari per l'importazione di proteine cloroplaste. È essenziale per l'invernimento e la fotosintesi e quindi per la produzione alimentare sul pianeta. La macchina molecolare è costituita da due complessi separati nel membro esterno ed interno del cloroplasto chiamato TOC e TIC, ma la composizione non è completamente nota.
Il principale vantaggio di questa tecnica è che la purificazione del complesso Arabidopsis TOC/TIC può essere realizzata in un unico metodo di purificazione in un unico passaggio, la purificazione TAP-TOC. Si tratta di un metodo specifico ed efficiente. Generalmente, i ricercatori nuovi a questo metodo possono avere difficoltà perché non hanno familiarità con l'isolamento delle frazioni di membrana cloroplasta, detergente, solubilizzazione o purificazione dell'affinità.
Dopo aver preparato le piante di Arabidopsis, macinare 10 grammi di piantine vecchie di tre settimane in azoto liquido, usando una malta fredda e pestello con sabbia. Aggiungere 20 millilitri di tampone di macinazione a freddo ai tessuti macinati. Mescolare bene e lasciare scongelare la miscela sul ghiaccio.
Quindi, immergere due strati di materiale di filtrazione rapida con tampone di rettifica. Filtrare l'omogeneizzato attraverso i due strati di materiale filtrante in un tubo di centrifuga conico da 50 millilitri. Centrifugare il filtrato a 1.500 volte g in quattro gradi Celsius per 10 minuti e trasferire il supernatante in un tubo di centrifuga conico fresco pre-refrigerato da 50 millilitri.
Ripetere la centrifugazione ancora una volta alle stesse condizioni. Trasferire il supernatante in un tubo ultracentrifugo freddo da 38,50 millilitri e completarlo fino a 35 millilitri con tampone di macinazione a freddo. Utilizzare un ultracentrifugo per centrifugare il campione a 100.000 volte g e quattro gradi Celsius per un'ora.
Utilizzando un omogeneizzatore in teflon in vetro, rimescolare il pellet verde nel tampone di rettifica. Centrifugare a 100.000 volte g e quattro gradi Celsius per un'ora e scartare il supernatante. Utilizzare l'omogeneizzatore teflon in vetro per rimescolare il pellet verde in 18,75 millilitri di un tampone di rettifica x.
Quindi aggiungere altri 9.375 millilitri di un buffer di rettifica x. Aggiungere 9,375 millilitri di quattro x soluzione di solubilizzazione per portare il volume finale a 37,5 millilitri e incubare su uno shaker rotante a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, utilizzare un ultracentrifugo per centrifugare il campione a 100.000 volte g e quattro gradi Celsius per un'ora.
Trasferire il supernatante contenente le membrane solubilizzate in un tubo di centrifuga conico fresco da 50 millilitri. Dopo aver preparato la resina di agarosio IGG, trasferire la resina di agarosio IGG precedentemente lavata nel tubo conico da 50 millilitri contenente i 37,5 millilitri delle membrane solubilizzate. Incubare durante la notte su uno shaker rotante a quattro gradi Celsius.
Il giorno dopo, sedimentare la resina di agarosio IGG a 100 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Utilizzare una pipetta per rimuovere il supernatante. Era la resina di agarosio IGG in 37,5 millilitri di tampone A e incubare su uno shaker rotante a temperatura ambiente per 10 minuti.
Continuare a sedimentare e lavare la resina come delineato nel protocollo di testo. Successivamente, trasferire la resina di agarosio IGG in una colonna di spin da 500 microliter con un filtro da 35 micron. Lavare le perline due volte con 300 microlitri di tampone di eluizione TEV per l'equilibrazione.
Successivamente, aggiungere 300 microlitri di tampone di eluizione TEV contenenti 10 microlitri di proteasi TEV. Incubare la colonna di spin con perline in un Thermomixer a 16 gradi Celsius e 350 giri/min per due ore. Quindi, aprire la colonna di rotazione e posizionarla in un nuovo tubo pulito da 1,5 millilitri.
Ruotare questo tubo a 100 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti per raccogliere l'eluato. In questo studio viene purificato un complesso proteico di involucro di cloroplasto taggato TAP da piante transgeniche di A.thaliana. L'analisi immunoblot conferma che l'isolamento TAP-TOC159 interagisce con TOC75 e TOC33 del complesso TOC.
Anche la membrana esterna cloroplasta chinasi, KOC1, nota per il fosforilato TOC159, è co-isolata. La presenza di TIC110 rivela che il complesso isolato TAP-TOC159 contiene anche i componenti del complesso TIC. L'anticorpo FBN1A non ha riconosciuto il complesso TAP-TOC159, indicando l'assenza di contaminazioni.
Nel controllo negativo, la proteina NTAP immunoprecipitata non si è co-isolata con nessuna delle proteine TOC, TIC e conferma la specificità della purificazione TAP-TOC159. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'importazione di proteine cloroplaste, può potenzialmente essere applicato a qualsiasi altro complesso nel sistema di bottiglie arabidopsis thaliana. Seguendo questa procedura, possono essere applicati altri metodi come l'assorbimento occidentale o la spettrometria di massa per dimostrare la presenza di componenti noti o per identificare nuovi componenti dei complessi TOC e TIC.
Questa tecnica ha aperto la strada alla ricerca nel campo dell'importazione di proteine cloroplaste per esplorare la funzione di nuovi componenti dei complessi TOC e TIC.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo di isolamento basato su affinità in un singolo passaggio per purificare i complessi di importazione di proteine dei cloroplasti (complesso TOC-TIC) utilizzando il TAG TAP. Questo metodo può identificare nuovi partner di interazione mediante spettrometria di massa ed è cruciale per comprendere la funzione dei cloroplasti.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Biologia dei cloroplasti
- Purificazione delle proteine
- Spettrometria di massa
Conoscenze di base
- Il macchinario di importazione delle proteine dei cloroplasti è essenziale per la fotosintesi e la produzione di cibo.
- I complessi TOC e TIC sono coinvolti nell'importazione delle proteine, ma la loro composizione completa non è ben compresa.
- I metodi attuali per isolare questi complessi possono essere complessi e dispendiosi in termini di tempo.
- Questo studio mira a semplificare il processo di purificazione.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un protocollo semplice per purificare il complesso TOC-TIC.
- Facilitare l'identificazione di nuovi componenti coinvolti nell'importazione delle proteine dei cloroplasti.
- Fornire un metodo che possa essere applicato ad altri complessi proteici in Arabidopsis thaliana.
Metodi utilizzati
- Preparazione di piantine di Arabidopsis e macinazione in azoto liquido.
- Centrifugazione sequenziale per isolare le membrane dei cloroplasti.
- Purificazione per affinità utilizzando resina di agarose IGG.
- Analisi immunoblot per confermare la presenza di proteine specifiche.
Risultati principali
- Il complesso TAP-TOC159 è stato purificato con successo e si è dimostrato interagire con TOC75 e TOC33.
- Il co-isolamento di TIC110 ha indicato la presenza di componenti TIC nel complesso purificato.
- Il metodo ha dimostrato specificità, poiché i controlli negativi non hanno mostrato co-isolamento con proteine TOC e TIC.
- Questa tecnica consente un'ulteriore esplorazione dei meccanismi di importazione delle proteine dei cloroplasti.
Conclusioni
- Il metodo di purificazione con TAG TAP è efficiente e specifico per l'isolamento dei complessi proteici dei cloroplasti.
- Questo approccio può migliorare la ricerca sul sistema di importazione delle proteine dei cloroplasti.
- Gli studi futuri possono sfruttare questo metodo per identificare nuovi componenti dei complessi TOC e TIC.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Understanding the composition of chloroplast protein import complexes is critical for advancing plant biotechnology and improving crop yield. The TAP-TOC159 purification method enables efficient isolation of membrane protein complexes, supporting target validation and mechanistic de-risking in chloroplast-related research. This approach enhances predictive confidence in identifying novel components of the TOC and TIC complexes, with implications for synthetic biology and metabolic engineering in biopharma-relevant plant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of the chloroplast protein import machinery by isolating TOC159-containing complexes for functional analysis.
- Operational Value: Provides a specific and efficient one-step purification strategy that reduces experimental variability in complex isolation.
- Strategic Value: Supports hypothesis-driven target validation by confirming interactions with known components like TOC75, TOC33, TIC110, and KOC1.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified complexes suitable for downstream applications such as mass spectrometry to identify novel interactors.
- Operational Value: Produces reproducible isolations amenable to standardized workflows for complex profiling.
- Strategic Value: Facilitates assay readiness by delivering enriched complexes that improve detection sensitivity in screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains complex integrity through gentle TEV protease elution, preserving native interactions for functional follow-up.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to validation by providing material suitable for immunoblot and mass spectrometry analysis.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement by confirming specificity through negative controls, reducing false-positive risks.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology phase, enabling isolation of native complexes to inform target identification and pathway elucidation before progressing to functional assays or engineering efforts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating TOC-TIC complexes to study protein import mechanisms.
- Screening: Delivers solubilized membrane complexes that are amenable to affinity capture and downstream analytical readouts.
- Analytics: Enables quantitative and qualitative analysis via immunoblot and mass spectrometry to compare complex composition across conditions.
- Translational Research: Connects discovery to validation by providing biochemically defined complexes that reflect native chloroplast membrane environments.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable affinity purification platform applicable to other membrane-bound complexes in Arabidopsis thaliana.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by enabling specific isolation of TOC159-associated complexes.
- Operational Value: Improves reproducibility through standardized affinity purification and gentle elution conditions.
- Strategic Value: Enhances decision-making by providing reliable data on complex composition to guide target prioritization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted investment in chloroplast-targeted traits by de-risking target identification through specific complex isolation.
Implementation Considerations
- Expertise in chloroplast membrane isolation and detergent-based solubilization is required.
- Access to ultracentrifugation equipment and affinity resins (IgG agarose) is necessary for membrane preparation and complex capture.
- Standardization of washing and elution conditions across labs is critical to ensure reproducibility of complex isolation.
- Adaptation to other model systems may require optimization of tag accessibility and complex stability.
- Practical limitations include the need for transgenic lines expressing TAP-tagged constructs and potential tag interference with native function.
