Name: Crescita di batteri magnetotattici del genere Magnetospirillum: ceppi MSR-1, AMB-1 e MS-1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Impara a coltivare i batteri magnetotattici Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1, M. magneticum AMB-1 e M. magnetotacticum MS-1 con controllo ottimizzato dell'ossigeno. Questo metodo riproducibile utilizza media liquidi e semi-solidi per studi di microbiologia ambientale.

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Ringraziamo Richard B. Frankel per il suo aiuto con MTB culture, Adam P. Hitchcock e Xiaohui Zhu per il loro supporto durante la configurazione delle culture MTB presso la McMaster University e Marcia Reid per la formazione e l'accesso alla struttura di microscopia elettronica (McMaster University, Facoltà di Scienze della salute). Questo lavoro è stato supportato da scienze naturali e ingegneria ricerca Consiglio del Canada (NSERC) e la US National Science Foundation.

1. installazione della stazione2 N
Nota: Scegliere il diametro interno del tubo di modo che può essere collegato al serbatoio con perdita minima e in modo che il cilindro di una siringa di plastica da 1 mL si adatta strettamente in questo tubo. Un'illustrazione del completo N2 stazione di gas è fornita nella Figura 1.
<ol><li>Tranquillamente installare un serbatoio di gas N2 nei pressi di una panchina su cui c'è spazio sufficiente per impostare la stazione di2 N (una lunghezza di circa 50 cm).</li>
	<li>Collegare al serbatoio un pezzo di tubo abbastanza a lungo per raggiungere l'area dove sorgerà la stazione. Se necessario, applicare il nastro di Teflon all'uscita del serbatoio per evitare eventuali perdite.</li>
	<li>Per costruire una stazione in grado di bubbling cinque bottiglie di mezzo allo stesso tempo, tagliate quattro pezzi di tubo di circa 5 cm di lunghezza.</li>
	<li>Assemblare i pezzi di tubo in una linea con tre raccordi in plastica a forma di T di tre vie. Collegare un'estremità di questa linea per il pezzo di tubo all'uscita del serbatoio2 N attraverso un raccordo a T extra. Aggiungere un raccordo all'estremità opposta del gomito di 90°.</li>
	<li>Utilizzare nastro per fissare la struttura di un'asta metallica orizzontale posizionato circa 30 cm sopra la panca.</li>
	<li>Collegare cinque pezzi di tubi (circa 20 cm di lunghezza) alle uscite libera degli accessori installati nel passo 1.4.</li>
	<li>Rimuovere i pistoni da cinque siringhe di plastica 1,0 mL e tagliare l'estremità più grande di queste siringhe (cioè., il fronte lato all'ago), mantenendo solo la parte graduata. Riempire queste siringhe con cotone, non troppo strettamente.</li>
	<li>Inserire le siringhe nei pezzi di tubi verticali lunghe 20 cm e utilizzare acqua saponata per garantire che non vi siano perdite quando N2 sta fluendo.</li>
	<li>Rimuovere i tappi di cinque aghi 25g (0,5 x 25 mm) e inserire questi aghi 10 cm pezzi di tubi sottili. Accertarsi che gli aghi misura strettamente nella tubazione. Attenzione: Esiste un rischio di accoltellamento durante questo passaggio. Fatelo lentamente e con attenzione.</li>
	<li>Attaccare gli aghi preparati nel passaggio 1,9 per le siringhe della stazione2 N. Assicurarsi che N2 è che fluisce attraverso tutte le cinque linee e tenere la stazione in stand-by.</li>
</ol>2. crescita media preparazione
Nota: È possibile regolare la quantità di terreno preparato, come spiegato nella procedura 2.1.2, 2.2.2 e 2.3.8. La quantità di acqua e prodotti chimici utilizzati appena ha bisogno di essere regolato proporzionalmente. Il ruolo di tutti i componenti di media è descritto in supplementari nella tabella 1.
<ol><li>Preparazione del terreno di coltura liquido per MSR-1<ol>
<li>Preparare una soluzione di citrato ferrico 10mm aggiungendo 0,245 g di citrato ferrico a 100 mL di acqua distillata deionizzata. Riscaldare e mescolare per sciogliere, fino al giallo all'arancione chiaro soluzione è ottenuta. Autoclave la soluzione utilizzando uno standard ciclo (almeno 15 min di esposizione a 121 ° C) e quindi conservare questa soluzione madre a temperatura ambiente al buio. Nota: Eliminare la soluzione di citrato ferrico quando un precipitato diventa evidente.</li>
		<li>In un becher contenente 1 L di acqua distillata e deionizzata, aggiungere quanto segue nell'ordine mescolando: 1,0 mL del minerale traccia supplemento soluzione, 0,1 g di KH2PO4, 0,15 g di MgSO4,7 H2O, 2,38 g di HEPES, 0,34 g di NaNO3 , Estratto di 0,1 g di lievito, 3,0 g di peptone di fagioli di soia, 4,35 mL di lattato di potassio (soluzione al 60% w/w) e 5 mL di soluzione madre di Fe (III) citrato da 10 mM. Nota: Regolare le quantità proporzionalmente se è necessaria una minore quantità di mezzo di crescita. Per una stazione di2 N capace di bubbling cinque bottiglie allo stesso tempo, come quella costruita nel passaggio 1 del presente protocollo, preparare 300 mL di terreno. Attenzione: Traccia minerale e Fe (III) citrato stock soluzioni devono essere mantenuti sterili. Per evitare contaminazioni, utilizzare una tecnica sterile standard quando utilizzarli (fiamma aperta cime delle bottiglie utilizzando un bruciatore di Bunsen) e Puntali sterili per l'erogazione. Conservare la soluzione minerale in frigorifero a 4 ° C.</li>
		<li>Dopo l'aggiunta di tutte le sostanze chimiche, regolare il pH a 7.0 con soluzione di NaOH 1 M. Dispensare il mezzo preparato in flaconi da 125 mL del siero. Versare 60 mL di terreno in ogni bottiglia.</li>
		<li>Bolla N2 nel medium per 30 min rimuovere il disciolto O2, utilizzando il piccolo tubo collegato alla stazione2 N descritta nel passaggio 1. Mettere un tappo di gomma butilica sopra ogni bottiglia, lasciando una piccola apertura per consentire al gas in eccesso di uscire la bottiglia. Attenzione: Schiuma potrebbe formare mentre spumeggiante con N2. Regolare di conseguenza il flusso di gas per evitare la produzione di schiuma.</li>
		<li>A crimpare sigillare ogni bottiglia con il tappo preparato e un sigillo in alluminio. Il sigillo di alluminio assicura che la bottiglia rimane sigillata durante il resto del protocollo.</li>
		<li>Scollegare gli aghi e il tubo sottile dalla stazione2 N e sostituirli con aghi puliti (1 pollice, ≤ 23 G). Regolare le valvole del serbatoio2 N in modo che un delicato flusso continuo di gas esce il serbatoio (circa 50 mL/min). Nota: Maggiore di 23G aghi possono lasciare permanente unsealable fori nel tappo.</li>
		<li>Inserire uno degli aghi collegati al serbatoio2 N in una bottiglia di mezzo, attraverso il tappo di gomma. Inserire immediatamente un altro ago pulito nella stessa bottiglia. Ripetere questo passaggio per le altre bottiglie e lasciate scorrere2 N per circa 30 min sostituire l'aria nelle bottiglie di N2.</li>
		<li>Scollegare una bottiglia dalla stazione2 N rimuovendo l'ago corrispondente. Attendere per alcuni secondi fino a quando la pressione nella bottiglia di terreno diminuisce a pressione atmosferica e rimuovere il secondo ago. Ripetere questo passaggio per tutte le bottiglie rimanenti. Attenzione: Per evitare O2 da immettere nuovamente le bottiglie di terreno di coltura dopo passo 2.1.4, eseguire passaggi 2.1.4 - 2.1.8 in rapida successione. Se tutte le bottiglie non possono essere collegate alla stazione2 N allo stesso tempo, procedere con passaggi 2.1.4-2.1.8 per il primo set di bottiglie e quindi ripetere questi passaggi per le bottiglie rimanenti.</li>
		<li>Autoclave le bottiglie. Lasciate raffreddare fino a temperatura ambiente durante la notte e conservarle a temperatura ambiente in seguito.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione del terreno di coltura liquido per AMB-1 e MS-1<ol>
<li>Preparare una soluzione di chinato ferrico di 10 mM. Prima sciogliere 0,19 g di acido chinico in 100 mL di acqua distillata o deionizzata, quindi aggiungere 0,27 g di FeCl3.6h2O. mescolare per sciogliere, fino ad ottenuta una soluzione di rossa, chiara scuro. Sterilizzare in autoclave la soluzione utilizzando un ciclo standard (almeno 15 min di esposizione a 121 ° C). Nota: Conservare la ferrica soluzione chinato a temperatura ambiente al buio come una soluzione sterile. Scartare la soluzione quando un precipitato diventa evidente.</li>
		<li>In un becher contenente 1 L di acqua distillata e deionizzata, aggiungere quanto segue nell'ordine mescolando: 10,0 mL della soluzione di supplemento di vitamina, 5,0 mL della soluzione di integratore minerale traccia, 0,68 g di KH2PO4, 0,848 g del succinato del sodio bibasico esaidrato, 0,575 g di-sodio tartrato diidrato, 0,083 g di sodio acetato triidrato, 0,45 mL di 0,1% Resazurin acquosa, 0,17 g di NaNO3, 0,04 g di acido ascorbico e 3,0 mL della soluzione di riserva chinato di Fe (III) da 10 mM. Nota: Regolare le quantità proporzionalmente se è necessaria una minore quantità di mezzo di crescita. Per una stazione di2 N capace di bubbling cinque bottiglie allo stesso tempo, come quella costruita nel passaggio 1 del presente protocollo, preparare 300 mL di terreno. Attenzione: Vitamina, minerali traccia e soluzioni di riserva chinate di Fe (III) devono essere mantenuti sterili. Per evitare contaminazioni, utilizzare una tecnica sterile standard e Puntali sterili durante l'erogazione. Conservare le soluzioni minerali e vitamina in frigorifero a 4 ° C.</li>
		<li>Dopo l'aggiunta di tutte le sostanze chimiche, regolare il pH a 6,75 utilizzando la soluzione di NaOH 1 M.</li>
		<li>Fare riferimento alla procedura 2.1.3-2.1.9 per il resto del protocollo.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione del terreno di coltura semisolido per MSR-1<ol>
<li>Preparate un 0,5 M tampone fosfato soluzione pH 7.0 sciogliendo 3,362 g di K2HPO4 e g 4,178 di KH2PO4 in 100 mL di acqua distillata deionizzata. Controllare se il pH è 7.0 e regolare il pH leggermente con KH2PO4 o NaOH se necessario. Conservare la soluzione in una bottiglia di vetro tappata (preferibile alla plastica al fine di evitare scambio di ossigeno).</li>
		<li>Preparare 100 mL di una soluzione di acido cloridrico 0,02 M. Aggiungere 0,2 g di FeCl2.4h2O questa soluzione e mescolare per sciogliere al fine di ottenere una soluzione di cloruro di ferro di 10 mM. Conservare la soluzione al buio in una bottiglia di vetro tappata.</li>
		<li>Preparare una soluzione di bicarbonato di sodio 0,8 M sciogliendo 6,72 g di NaHCO3 in 100 mL di acqua distillata deionizzata. Conservare la soluzione in una bottiglia di vetro tappata.</li>
		<li>Autoclave le soluzioni preparate in passaggi 2.2.1 - 2.2.3 usando un ciclo standard (almeno 15 min di esposizione a 121 ° C). Memorizzarli come sterile soluzioni di riserva nel buio.</li>
		<li>In un becher contenente 1 L di acqua distillata e deionizzata, aggiungere quanto segue nell'ordine continuando a mescolare: 5 mL della soluzione di integratore minerale traccia, 0,2 mL di soluzione acquosa resazurin 1%, 0,4 g di NaCl, 0,3 g di NH4Cl, 0,1 g di MgSO4.7h2 O, 0,05 g di CaCl2.2h2O, 1 g di sodio succinato, 0,5 g di acetato di sodio, 0,2 g di lievito di estrarre e 1,6 g di agar.</li>
		<li>Coprire il recipiente con carta stagnola e autoclave la soluzione preparata al punto 2.3.5.</li>
		<li>Poco prima della fine del ciclo di autoclave, preparare un fresco 4% L-cysteine· HCl· H2O soluzione sciogliendo 0,8 g di L-cysteine· HCl· H2O in 20 mL di acqua distillata deionizzata. Neutralizzare la soluzione a pH 7.0 con soluzione di NaOH 5m. Attenzione: è importante che la soluzione di cisteina è preparata fresco per evitare l'ossidazione della cisteina. Conservare la soluzione minerale in frigorifero a 4 ° C.</li>
		<li>Dopo la sterilizzazione in autoclave, lasciare raffreddare la media fino a 50 – 60 ° C e portare il becher sotto la fiamma di un becco Bunsen. Rimuovere il foglio di alluminio e aggiungere rapidamente le seguenti in ordine mentre mescolando delicatamente: 0,5 mL di soluzione di vitamine, 2,8 mL di soluzione tampone fosfato sterile stock, 3 mL di soluzione madre di sterile ferro cloruro, 1,8 mL di brodo sterile bicarbonato di sodio soluzione e 10 mL di soluzione di cisteina filtro-sterilizzato. Nota: Regolare le quantità proporzionalmente se è necessaria una minore quantità di mezzo di crescita. È solitamente conveniente preparare un lotto di 120 mL di terreno. Attenzione: Tutte le soluzioni devono rimanere sterili per uso futuro. Eseguire il passaggio 2.3.8 utilizzando una tecnica sterile standard e pipetta sterile suggerimenti durante l'erogazione.</li>
		<li>Dopo l'aggiunta di tutte le sostanze chimiche, è possibile trasferire il mezzo caldo in provette Hungate di 16 mL tappo a vite sterile. 12 mL di terreno di trasferimento in ogni provetta e sigillare i tubi. Attenzione: Per evitare contaminazioni, eseguire il passaggio 2.3.9 sotto la fiamma di un becco Bunsen. Eseguire prima l'agar solidifica, mentre il mezzo è a 40 ° C o sopra.</li>
		<li>Lasciare riposare i tubi per diverse ore fino a quando l'agar si solidifica e l'OAI diventa apparente, materializzando come una rosa al interfaccia incolore, circa 1 a 3 cm sotto la superficie del mezzo. Nota: Il mezzo dovrebbe girare lentamente incolore nel tubo. La quantità di tempo necessario per questa transizione è variabile e dipende dalla quantità di O2 inizialmente disciolto nel mezzo.</li>
	</ol></li>
</ol>3. inoculazione di MTB
Nota: Le colture di ceppi AMB-1, MS-1 e MSR-1 possono essere ottenute in commercio (Tabella materiali).
Attenzione: Eseguire le seguenti operazioni in condizioni sterili, sotto la fiamma di un becco Bunsen.
<ol><li>Inoculazione di ceppi MSR-1, AMB-1 e MS-1 in mezzo liquido<ol>
<li>Sigillare una bottiglia di siero vuoto 125 mL con un tappo di gomma butilica e un sigillo di alluminio a crimpare. Inserire due aghi in bottiglia attraverso il tappo e collegare una siringa preparata come 1.7 passaggio ad uno di loro. Collegare la siringa in un cilindro di O2 attraverso lo stesso tipo di tubazione come quello utilizzato per la stazione di2 N.</li>
		<li>Lasciate che attraversa2 O la bottiglia per circa 30 min, per garantire che tutta l'aria nella bottiglia è sostituito da O2. Rimuovere entrambi gli aghi, consentendo una leggera sovrapressione in bottiglia e quindi autoclave. Consentire la bottiglia raffreddare a temperatura ambiente prima dell'uso. Nota: Per risparmiare tempo, eseguire i passaggi 3.1.1 e 3.1.2 durante la preparazione media e autoclave la bottiglia con il mezzo o le soluzioni di riserva.</li>
		<li>Sterilizzare le cime dei tappi di sia il fresca bottiglia e la bottiglia di2 O applicando alcune gocce di soluzione di etanolo 70% sopra di essi e passarli attraverso la fiamma di un becco Bunsen.</li>
		<li>Utilizzando un ago e una siringa sterile, estrarre 1 mL O2 dalla bottiglia O2 e trasferirlo nella bottiglia media fresca. Assicurarsi che l'ago sia strettamente sulla siringa durante questo passaggio per evitare qualsiasi aria nella siringa.</li>
		<li>Se si utilizza l'inoculo da un'altra cultura cresciuta in una bottiglia di vetro, sterilizzare i tappi il fresca bottiglia media sia il più vecchio flacone di coltura applicando alcune gocce di soluzione di etanolo 70% sopra di essi e passarli attraverso la fiamma di un becco Bunsen. Se si utilizza l'inoculo da un tubo della cultura congelato, basta lasciarlo caldo fino a temperatura ambiente con il tubo sigillato sotto la fiamma di un becco Bunsen.</li>
		<li>Se si utilizza l'inoculo da un'altra cultura cresciuta in una bottiglia di vetro, inoculare 1 mL della cultura più anziane nel medium fresco. Se si utilizza l'inoculare da azione congelate, inoculare solo 0,1 mL per diluire il glicerolo o dimetil solfossido (DMSO) utilizzato nel processo di congelamento. In entrambi i casi, utilizzare un ago sterile e una siringa sterile.</li>
		<li>Incubare la coltura a 32 ° C ed e inoculare in mezzo fresco dopo 4-7 giorni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inoculazione di MSR-1 in mezzo semi-solido gradiente di O2<ol>
<li>Verificare che il tubo di mezzo fresco Visualizza un ben definito OAI, materializzata da una rosa di interfaccia incolore.</li>
		<li>Se l'inoculo è proveniente da un altro O2 gradiente di concentrazione semi-solida cultura, raccogliere i batteri di pipettaggio 50 µ l della cultura con una pipetta sterile messo sulla band formata dai batteri. Inoculare lentamente questi batteri a OAI nel medium fresco (Rosa/incolore interfaccia), evitando di disturbare l'interfaccia. Se l'inoculo è proveniente da una cultura congelata, procedere nello stesso modo con 100 µ l di inoculo invece.</li>
		<li>Sigillare il tubo e lasciare che i batteri crescono tra i 25 ° C e 30 ° C. Trasferimento in mezzo fresco utilizzando la stessa procedura prima della band di batteri raggiunge la superficie del mezzo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. osservazione dei batteri
<ol><li>Sterilizzare il tappo della bottiglia cultura applicando la soluzione di etanolo 70% su di esso e facendolo passare attraverso la fiamma di un becco Bunsen. Per mezzo di semi-solido, aprire il tubo sotto la fiamma di un becco Bunsen. Usare un ago sterile e una siringa sterile per estrarre i batteri.</li>
	<li>Uso l'impiccagione drop metodo8 per garantire che i batteri sono magnetici e motili. Nota: Microscopia di contrasto di fase dà grandi risultati, ma non è obbligatoria. Ingrandimenti compresi tra 10 X 60 X sono adatti.</li>
	<li>Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) consente di osservare la struttura delle cellule e la magnetosomes in dettaglio8.</li>
</ol>

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<li>Lefevre, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+magnetite-producing+magnetotactic+bacteria+belonging+to+the+Gammaproteobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Novel magnetite-producing magnetotactic bacteria belonging to the Gammaproteobacteria.</a> The ISME Journal. 6 (2), 440(2012).</li>
<li>Williams, T. J., Lefèvre, C. T., Zhao, W., Beveridge, T. J., Bazylinski, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetospira+thiophila+gen.+nov.%2C+sp.+nov.%2C+a+marine+magnetotactic+bacterium+that+represents+a+novel+lineage+within+the+Rhodospirillaceae+%28Alphaproteobacteria%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Systematic+and+Evolutionary+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Magnetospira thiophila gen. nov., sp. nov., a marine magnetotactic bacterium that represents a novel lineage within the Rhodospirillaceae (Alphaproteobacteria).</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 62 (10), 2443-2450 (2012).</li>
<li>Zhu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+a+marine+magnetotactic+spirillum+axenic+culture+QH-2+from+an+intertidal+zone+of+the+China+Sea%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of a marine magnetotactic spirillum axenic culture QH-2 from an intertidal zone of the China Sea.</a> Research in Microbiology. 161 (4), 276-283 (2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

I requisiti specifici di O2 concentrazione di MTB li rendono banale a crescere in laboratorio. Un passaggio chiave del protocollo per mezzo liquido è la rimozione iniziale di tutti i O2 dal mezzo al fine di controllare la concentrazione finale aggiungendo un volume determinato di O2, appena prima dell'inoculazione. È stato dimostrato che MSR-1 cresce in condizioni aerobiche quasi completamente, tuttavia, il magnetismo delle cellule è drasticamente ridotto. I risultati dello stesso studio ...

I batteri magnetotattici (MTB) rappresentano una vasta gamma di procarioti gram-negativi onnipresente in habitat acquatici d'acqua dolce e marini1. Questi batteri condividono la capacità di produrre magnetici cristalli di magnetite (Fe3O4) o grigite (Fe3S4), che sono nella maggior parte dei casi assemblati in catene all'interno delle cellule. Questo particolare motivo strutturale è dovuta alla presenza di numerose proteine specifiche che agiscono sia nel citoplasma dei batteri e sulla membrana del lipido che circonda ogni cristallo2. Ogni singolo cristallo e sua circostante delle vescicole di membrana viene chiamato un magnetosoma ed è che variano nel formato da circa 30 a 50 nm in Magnetospirillum specie3. A causa della disposizione di catena di magnetosomes, questi batteri possiedono un momento di dipolo magnetico permanente che li rende allineare passivamente con campi magnetici applicati esternamente. Di conseguenza, questi batteri nuotano attivamente lungo linee di campo magnetico, che agiscono come semovente micro-Compasso presumibilmente a più efficacemente individuare le condizioni più favorevoli (ad es., concentrazione di O2 ) per la crescita.
Una proprietà interessante della MTB è la loro capacità di regolare sia la chimica e la cristallografia dei loro cristalli magnetosoma. Maggior parte dei ceppi produrre relativamente elevata purezza cristalli di magnetite o greigite, anche se alcuni biomineralize entrambi minerali4. In tutti i casi, i batteri sono in grado di controllare con precisione le dimensioni e la forma dei loro cristalli di singolo dominio magnetico. Questo spiega perché una grande quantità di ricerca è impegnata a sviluppare una migliore comprensione di come MTB eseguire questo processo biomineralization. Comprensione di questo processo potrebbe consentire ai ricercatori di adattare-fare nanocristalli magnetici per molte applicazioni mediche e commerciali.
Un ostacolo sostanziale al ricerche approfondite su MTB è stata la difficoltà della loro coltivazione in laboratorio. Maggior parte delle specie, tra cui i ceppi utilizzati in questo lavoro, sono obligately microaerofili se coltivata con O2 come un accettore terminale di elettroni. Questo spiega perché questi batteri si trovano più spesso la zona di transizione tra condizioni ossidanti e anossiche (l'interfaccia ossica-anossico, OAI). Ciò dimostra chiaramente che la MTB hanno precise esigenze di concentrazione di O2 che ovviamente deve essere presa in considerazione quando si concepisce la crescita media per questi organismi. Inoltre, la grande varietà esistente di MTB implica che diversi ceppi saranno necessari diversi tipi di gradienti chimici e sostanze nutrienti per ottenere una crescita ottimale.
In questo lavoro descriviamo i metodi per la coltivazione di tre di MTB più ampiamente studiati: Magnetospirillum magneticum (ceppo AMB-1), M. magnetotacticum (MS-1) e M. gryphiswaldense (MSR-1). Queste specie filogeneticamente appartengono alla classe di Alphaproteobacteria , nel phylum Proteobacteria , sono elicoidale nella morfologia e possiedono un flagello polare a ciascuna estremità della cella. Forniamo i protocolli per la coltivazione di ceppo MSR-1 sia liquido e O2 gradiente di concentrazione media semi-solido, basato su ricette medie precedentemente pubblicate5,6. Inoltre presentiamo un protocollo dettagliato per la crescita di ceppi AMB-1 e MS-1 nelle modificate magnetico Spirillum crescita medio (MGSM)7.

<table><tbody><tr><td>AMB-1</td><td>Collezione di cultura di tipo americano (ATCC)</td><td>ATCC 700264</td><td></td></tr><tr><td>MS-1</td><td>ATCC ATCC</td><td>31632&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MSR-1</td><td>Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)</td><td>DSM 6361</td><td></td></tr><tr><td>Citrato ferrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3388-250G</td><td></td></tr><tr><td>Integratore di oligoelementi</td><td>ATCC</td><td>MD-TMS</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>EMD</td><td>PX1565-1</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7 H2O</td><td>EMD</td><td>MX0070-1</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BioShop Canada Inc</td><td>HEP001.250</td><td></td></tr><tr><td>NaNO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5506-250G</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Fischer scientific</td><td>DF210929</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Fischer scientific</td><td>DF0436-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di L-lattato di potassio (60%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60389-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>D-(-)-Acido chinico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>138622</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3.6H2O</td><td>Fischer scientific</td><td>I88-100</td><td></td></tr><tr><td>Integratore vitaminico</td><td>ATCC</td><td>MD-VS</td><td></td></tr><tr><td>Sodio succinato esaidrato</td><td>Fischer scientific</td><td>S413-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodio L-tartrato dibasico diidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>228729-100G</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio triidrato</td><td>EMD</td><td>SX0255-1</td><td></td></tr><tr><td>Resazurin</td><td>Difco</td><td>0704-13</td><td></td></tr><tr><td>Acido ascorbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544-25G</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Caledon</td><td>6620-1-65</td><td></td></tr><tr><td>FeCl2 .4H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44939-250G</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>EMD</td><td>SX0320-1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Caledon</td><td>7560-1</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>EMD</td><td>1011450500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2.2 H2O</td><td>EMD</td><td>1023820500</td><td></td></tr><tr><td>Agar A</td><td>Bio Basic Canada Inc</td><td>FB0010</td><td></td></tr><tr><td>L-cisteina.HCl.H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7880-100G</td><td></td></tr><tr><td>1,0 mL siringhe</td><td>Fischer scientific</td><td>B309659</td><td></td></tr><tr><td>25G&nbsp; x 1 aghi</td><td>BD</td><td>305125</td><td></td></tr><tr><td>125 mL flaconi di siero</td><td>Wheaton</td><td>223748</td><td></td></tr><tr><td>20 mm guarnizioni in alluminio</td><td>Wheaton</td><td>224223-01</td><td></td></tr><tr><td>20mm E-Z Crimper</td><td>Wheaton</td><td>W225303</td><td></td></tr><tr><td>tappi in gomma butilica</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>2048-11800</td><td></td></tr><tr><td>Tubi Hungate</td><td>Chemglass (VWR)</td><td>CLS-4208-01</td><td></td></tr><tr><td>Tappo del setto, 13 mm, Hungate</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>2047-11600</td><td></td></tr><tr><td>Provette per colture in vetro</td><td>Corning (VWR)</td><td>9826-16X</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico 36,5-38%, BioReagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758-100ML</td><td>11,6 - 12 N</td></tr></tbody></table>

crescita di batteri magnetotattici del genere magnetospirillum: ceppi msr-1, amb-1 e ms-1

Growing Magnetotactic Bacteria of the Genus Magnetospirillum: Strains MSR-1, AMB-1 and MS-1

I batteri magnetotattici sono Gram-negativi, mobili, prevalentemente acquatiche procarioti onnipresente in habitat d'acqua dolce e marini. Sono caratterizzati dalla loro capacità di magnetosomes di biomineralize, che sono magnetici dimensioni nanometriche cristalli di magnetite (Fe3O4) o di grigite (Fe3S4) circondati da una membrana lipidica a doppio strato, nelle loro citoplasma. Per la maggior parte dei batteri magnetotattici noto, magnetosomes sono assemblati in catene all'interno del citoplasma, quindi conferendo un momento di dipolo magnetico permanente alle cellule e causando loro di allineare passivamente con campi magnetici esterni. A causa di queste caratteristiche specifiche, batteri magnetotattici hanno un grande potenziale per applicazioni mediche e commerciali. Tuttavia, la maggior parte delle specie sono microaerofili e hanno requisiti specifici O2 concentrazione, che li rende più difficile a crescere regolarmente rispetto a molti altri batteri come Escherichia coli. Qui presentiamo protocolli dettagliati per la coltivazione di tre dei più ampiamente studiati ceppi di batteri magnetotattici, tutti appartenenti al genere Magnetospirillum. Questi metodi consentono un controllo preciso della concentrazione2 O reso disponibile ai batteri, al fine di garantire che si sviluppano normalmente e sintetizzare magnetosomes. Crescita di batteri magnetotattici per ulteriori studi utilizzando queste procedure non richiede lo sperimentalista di essere un esperto in microbiologia. I metodi generali presentati in questo articolo possono anche essere utilizzati per isolare e cultura altri batteri magnetotattici, anche se è probabile che la composizione chimica media di crescita dovrà essere modificato.

Corretta preparazione dei media crescita può essere valutato come segue. Alla fine del processo, soluzioni chiare (cioè., privo di qualsiasi precipitato) dovrebbe essere ottenuta (questo è vero sia per mezzi liquidi e la coltura di semi-solido gradiente O2 ). Un'immagine di visualizzazione l'aspetto previsto del mezzo liquido MSR-1 prima inoculazione può essere visto nella Figura 2a. Un successo mezzo semi-solido di O2 gradiente...

Presentiamo una procedura per la coltivazione di diversi ceppi di Magnetospirillum in due diversi tipi di crescita media. Ceppo di Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1 viene coltivato in sia liquido e gradiente di concentrazione di O2 terreni semi-solidi mentre M. magneticum ceppo AMB-1 e M. magnetotacticum ceppo MS-1 sono coltivate in terreno liquido.

Crescita di batteri magnetotattici del genere Magnetospirillum: ceppi MSR-1, AMB-1 e MS-1

Magnetotactic bacteria are Gram-negative, motile, mainly aquatic prokaryotes ubiquitous in freshwater and marine habitats. They are characterized by their ...

Questo metodo consente di coltivare tre diverse specie di batteri magnetotattici chiamati MSR-1, AMB-1 e MS-1. Tutte le specie d'acqua dolce, e tutte del genere magnetospirillum. Si tratta di un primo passo essenziale per qualsiasi tipo di ricerca riproducibile che coinvolga questi organismi.I batteri magnetotattici hanno requisiti di ossigeno molto specifici, motivo per cui hanno sviluppato un sistema di navigazione magnetica. È quindi molto importante controllare la quantità di ossigeno a loro disposizione. Tutto questo protocollo è stato ottimizzato per alcuni ceppi specifici di magnetospirilla d'acqua dolce.I suoi dettagli possono essere ottimizzati al fine di soddisfare il fabbisogno di ossigeno e nutrienti di altri batteri magnetotattici. Installare in sicurezza un serbatoio di gas azoto vicino a un banco su cui c'è abbastanza spazio per allevare la stazione di azoto. Collegare un pezzo di tubo al serbatoio che è abbastanza lungo da raggiungere l'area in cui verrà costruita la stazione.Se necessario, applicare il nastro teflon all'uscita del serbatoio per evitare perdite. Per costruire una stazione in grado di gorgogliare cinque bottiglie di mezzo contemporaneamente, tagliare quattro pezzi di tubi di circa cinque centimetri di lunghezza. Assemblare i pezzi di tubi in linea con tre raccordi in plastica a forma di T a 3 modi.Collegare un'estremità di questa linea al pezzo di tubo all'uscita del serbatoio dell'azoto attraverso un raccordo extra a forma di T. Aggiungere un raccordo a gomito di 90 gradi all'altra estremità. Utilizzare il nastro adesivo per fissare la struttura a un'asta metallica orizzontale posizionata a circa 30 centimetri sopra la panca.Collegare cinque pezzi di tubi di circa 20 centimetri di lunghezza alle tre uscite dei raccordi installati. Rimuovere i pistoni da cinque siringhe di plastica da un millilitro e tagliare l'estremità più grande di queste siringhe, mantenendo solo la parte graduata. Riempire queste siringhe con cotone, facendo attenzione a non fare le valigie troppo strettamente.Inserire le siringhe nei pezzi verticali di tubi lunghi 20 centimetri. Accendere il gas e utilizzare acqua sapona per assicurarsi che non vi siano perdite quando l'azoto scorre. Rimuovere i tappi di cinque aghi calibro 25 e inserire questi aghi in pezzi di 10 centimetri di tubi sottili.Attaccare gli aghi preparati alle siringhe della stazione di azoto. Assicurarsi che l'azoto fluisa attraverso tutte e cinque le linee e mantenere la stazione in standby. Preparare una soluzione di citrato ferrico da 10 millimolare aggiungendo 0,245 grammi di citrato ferrico a 100 millilitri di acqua deionizzata distillata.Scaldare e mescolare per sciogliere fino a ottenere una soluzione chiara arancione. Autoclavare la soluzione utilizzando un ciclo standard di almeno 15 minuti di esposizione a 121 gradi Celsius prima di conservare la soluzione di stock sterilizzato a temperatura ambiente al buio. Per preparare cinque bottiglie di mezzo di crescita liquida per MSR-1, aggiungere le sostanze chimiche elencate in un protocollo di testo a un bicchiere contenente 300 millilitri di acqua deionizzata distillata.L'aggiunta del citrato ferrico sterile e delle soluzioni minerali deve essere eseguita sotto la fiamma di un bruciatore Bunsen utilizzando tecniche steril. Le condizioni sterili sono essenziali per evitare la contaminazione della coltura da parte di altre specie batteriche. Dopo l'aggiunta di tutte le sostanze chimiche, regolare il pH a 7.0 con una soluzione molare di idrossido di sodio.Distribuire il mezzo appena preparato in bottiglie di siero da 125 millilitri, versando 60 millilitri di mezzo in ogni bottiglia. Bollare l'azoto nel mezzo per 30 minuti per rimuovere l'ossigeno disciolto utilizzando i piccoli tubi collegati alla stazione di azoto. Posizionare un tappo di gomma butile sopra ogni bottiglia, lasciando una piccola apertura per consentire al gas in eccesso di uscire dalla bottiglia.Dopo 30 minuti, crimpare ogni bottiglia con il tappo preparato e una guarnizione in alluminio. La guarnizione in alluminio assicura che la bottiglia rimanga sigillata durante il resto del protocollo. Scollegare gli aghi e i tubi sottili dalla stazione di azoto e sostituirli con aghi puliti.Regolare le valvole del serbatoio dell'azoto in modo che un flusso delicato e continuo di gas esca dal serbatoio. Ora, inserire uno degli aghi collegati al serbatoio dell'azoto in una bottiglia di mezzo attraverso il tappo di gomma. Inserire immediatamente un altro ago pulito nella stessa bottiglia.Ripetere questo passaggio per le altre bottiglie e lasciare scorrere l'azoto per circa 30 minuti per sostituire l'aria nelle bottiglie con azoto. Dopo 30 minuti, scollegare una bottiglia dalla stazione di azoto rimuovendo l'ago corrispondente. Attendere alcuni secondi fino a quando la pressione nella bottiglia di mezzo diminuisce alla pressione atmosferica e rimuovere il secondo ago.Ripetere questo passaggio per tutte le bottiglie rimanenti. Per preparare 120 millilitri di mezzo di crescita semisolido per MSR-1, coprire il becher con foglio di alluminio e autoclave la soluzione preparata come descritto nel protocollo di testo. Poco prima della fine del ciclo dell'autoclave, preparare una nuova soluzione di cisteina al 4% e regolare il pH a 7,0 con una soluzione di idrossido di sodio molare, come descritto nel protocollo di testo.Dopo l'autoclave, lasciare raffreddare il mezzo fino a 50-60 gradi Celsius e portare il becher sotto la fiamma di un bruciatore Bunsen. Rimuovere il foglio di alluminio e aggiungere rapidamente le sostanze chimiche elencate nel protocollo di testo utilizzando tecniche sterili mescolando delicatamente. Aggiungere 1,2 millilitri di soluzione di cisteina sterilizzata a filtro.Dopo l'aggiunta di tutte le sostanze chimiche, trasferire il mezzo caldo in 16 millilitri tappo a vite sterile Tubi Hungate. Trasferire 12 millilitri del mezzo in ogni tubo e sigillare i tubi. Per inoculare i ceppi MSR-1, AMB-1 e MS-1 in mezzo liquido, fiammare le cime dell'ossigeno e delle bottiglie medie fresche applicando etanolo sui tappi e passandoli attraverso la fiamma di un bruciatore Bunsen.Utilizzando una siringa sterile e un ago, estrarre un millilitro di ossigeno dalla bottiglia di ossigeno e trasferirlo nella bottiglia media fresca. Se si utilizza l'inoculo di un'altra coltura coltivata in una bottiglia di vetro, fiammare entrambe le bottiglie. Quindi inoculare un millilitro della coltura più antica nel mezzo fresco.Incubare la coltura a 32 gradi Celsius e inocularla in mezzo fresco dopo quattro o sette giorni. Per inoculare MSR-1 in gradiente di ossigeno, mezzo semisolido, verificare che il tubo di mezzo fresco mostra un OAI ben definito, materializzato da un'interfaccia da rosa a incolore circa uno o tre centimetri sotto la superficie del mezzo. Se l'inoculo proviene da un'altra coltura semisolida del gradiente di concentrazione di ossigeno, raccogliere i batteri aspirando 50 microlitri della coltura con una punta sterile di pipetta posta sulla banda formata dai batteri.Inoculare lentamente questi batteri all'OAI nel mezzo fresco, evitando di disturbare l'interfaccia. Sigillare il tubo e lasciare che i batteri crescano tra i 25 gradi Celsius e i 30 gradi Celsius. Per assicurarsi che i batteri siano sia magnetici che modali, posizionare una goccia di coltura sullo scivolo di copertura del microscopio.Capovolgere il coperchio e installarlo su un O-ring appoggiato su uno scivolo di vetro. Assicurarsi che la caduta non tocchi la diapositiva inferiore. Posizionare la goccia appesa al microscopio e concentrarsi su un bordo della goccia.Posizionare il polo sud di un magnete vicino a quel bordo e guardare i batteri nuotare verso il bordo. Capovolgere il magnete per farli nuotare nella direzione opposta. Qui sono mostrate le bottiglie di mezzi liquidi prima dell'inoculazione e dopo la crescita batterica.La torbidità nella seconda bottiglia indica che i batteri stanno crescendo. Questo film due volte accelerato mostra il risultato atteso di un esperimento di caduta sospesa per una coltura di batteri magnetotattici modali e magnetici. I batteri inizialmente nuotavano verso il bordo della goccia quando viene applicato un campo magnetico.Quando la direzione del campo del magnete è invertita, i batteri nuotano lontano dal bordo in cui viene applicato il campo magnetico. Qui sono mostrati tubi di mezzo semisolido prima dell'inoculazione e dopo la crescita batterica. Come previsto, una banda di batteri si forma all'interfaccia osso-anossica e migra nel tempo man mano che l'ossigeno viene consumato e l'interfaccia si sposta verso l'alto.Qui è mostrata una micrografia elettronica rappresentativa di uno spirillo magnetico. Le flagelli sono indicate dalle frecce nere, mentre le frecce rosse mostrano i magnetosomi. Quando si tenta questa procedura, è molto importante ricordare che i batteri magnetotattici hanno requisiti di livello di ossigeno molto specifici per crescere correttamente e produrre magnetosoma.Questo protocollo mostra come controllare e monitorare i livelli di ossigeno nei mezzi di crescita al fine di raggiungere le micro condizioni preferite da questi organismi. Seguendo questo metodo, è possibile ottenere alte concentrazioni di cellule sane e altamente magnetiche. In questo modo, possono essere eseguiti esperimenti che richiedono grandi quantità di batteri, come l'estrazione di magnetosomi, studi genomici e genetici o l'osservazione del moto collettivo mediante microscopia.La possibilità di coltivare batteri magnetotattici in laboratorio è davvero ciò che ha permesso agli scienziati di esplorare in modo sistematico le affascinanti proprietà biochimiche e fisiche di questi organismi.

growing-magnetotactic-bacteria-genus-magnetospirillum-strains-msr-1

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Biologia

Mama è un unico Magnetosome proteina associata che ha dimostrato di essere coinvolti nella attivazione magnetosome. Qui vi presentiamo il protocollo di purificazione di Mama cancellazione mutante (MamAΔ41)...

Purificazione della M. magneticum Strain AMB-1 proteina Magnetosome Associated MamAΔ41

Fonte: Le Nagard, L., et al. Batteri magnetotattici in crescita del genere Magnetospirillum: ceppi MSR-1, AMB-1 e MS-1. J. Vis. Exp. (2018).Questo video mostra come coltivare i batteri Magnetospirillum in condizioni microaerobiche utilizzando terreni liquidi e semisolidi. Evidenzia la formazione di una banda batterica visibile all'interfaccia ossico-anossica e la sua migrazione verso l'alto quando l'ossigeno si esaurisce. Il video mostra anche come valutare il comportamento magnetotattico...

Crescita dei batteri Magnetospirillum e valutazione del loro comportamento magnetotattico

Dimostriamo un metodo per raccogliere batteri magnetotactic (MTB) che possono essere applicati alle acque naturali. MTB può essere isolato e arricchita da campioni di sedimento con una configurazione relativamente semplice che sfrutta il magnetismo naturale dei batteri. Isolato MTB può essere esaminata in dettaglio utilizzando sia la luce e la microscopia elettronica.

Raccolta, isolamento e di arricchimento di batteri naturalmente presenti magnetotactic dall&#39;ambiente

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L'obiettivo generale del presente protocollo è di sintetizzare funzionale Nanosensori per il portatile, conveniente, e rilevamento rapido di specificamente mirati batteri patogeni attraverso una combinazione di rilassamento magnetico e le modalità di emissione di fluorescenza.

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High-throughput screening e biopercezione con fluorescente C. elegans Ceppi

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Crescita di batteri magnetotattici del genere Magnetospirillum: ceppi MSR-1, AMB-1 e MS-1

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