Isolamento dei Glomeruli e In Vivo di etichettatura delle proteine di superficie delle cellule glomerulari

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della nefrologia sul ruolo del traffico di proteine superficiali cellulari nella malattia renale proteinurica e non proteinurica. I principali vantaggi di questa tecnica sono che facilita lo studio del traffico di proteine superficiali cellulari in vivo e che più di una proteina può essere analizzata per esperimento. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul traffico di superfici cellulari glomerulari, può anche essere applicato ad altri sistemi di organi che sono perfusi e sono accessibili con tecniche di isolamento.

Inizia confermando la mancanza di risposta al dito del piedi e disinfettando il lato ventrale del mouse anestetizzato con il 70% di isopropile. Fai un taglio mediano attraverso la pelle dal bacino allo sterno e usa le pinzette per rimuovere la pelle dalla fascia addominale. Tagliare la pelle su entrambi i lati della linea mediana addominale e fare un mezzo attraverso lo strato muscolare addominale dalla vescica allo xifoide.

Usa le forbici e le pinze per dividere i muscoli in quattro quadranti E usa due morsetti chirurgici per fissare i due quadranti superiori verso il collo degli animali. Posizionare l'animale al microscopio di sezionamento e utilizzare uno scambio sterile per allontanare gli organi viscerali. Usando forbici fini, tagliare il legamento fenico epatico.

Utilizzando pinzette chirurgiche fini, posizionare una sutura attorno all'arteria mesenterica epatica delle arterie renali. E intorno all'aorta, prossimale alle arterie renali, alla ghiandola surrenale. Liberare l'aorta distale dalla fascia, dal grasso e da altri tessuti.

Quindi, bloccare la vena cava e l'aorta all'altezza della biforcazione e posizionare un'altra sutura attorno all'aorta distale delle arterie renali. Utilizzare una pinzetta per stringere la sutura aortica prossimale, attenuando il flusso sanguigno e tagliando un piccolo foro metà del diametro dell'aorta nell'aorta, distale alle arterie renali. Inserire un catetere di 10 centimetri attaccato a una siringa da 10 millilitri contenente cinque millilitri di PBS ghiacciato più calcio e magnesio nell'aorta.

E fissare il catetere con le legature preparate. Quindi inizia a perfondere i reni a una portata di due millilitri al minuto. Uso di forbici fini per tagliare un foro nella vena renale alle arterie renali e stringendo la sutura intorno alle arterie epatiche e mesenteriche.

Dopo che l'intero volume di PBS è stato consegnato sostituire il perfusato con cinque millilitri di PBS ghiacciato più calcio e magnesio integrati con 0,5 milligrammi per biotina millilitro per l'etichettatura superficiale. Continuare a perfondere i reni a una portata di due millilitri al minuto. Una volta consegnato l'intero volume, attaccare una siringa contenente cinque millilitri di PBS ghiacciato più calcio e magnesio integrati con glicina 100 millimolare al catetere.

Dissetare i glomeruli con tutti e cinque i millilitri della soluzione di glicina a una portata di due millilitri al minuto. Quindi perfondere i reni con cinque millilitri di PBS ghiacciato più calcio e magnesio integrati con 200 microlitri di perline magnetiche per millilitro a una portata di due millilitri al minuto. L'embolizzazione dei glomeruli con le perline magnetiche marroni sarà visibile sulla superficie renale.

Quando tutte le perline sono state consegnate rimuovere la capsula dei reni e raccogliere i reni all'hilum. Posizionare i reni in un piatto di coltura cellulare di 10 centimetri contenente 15 millilitri di PBS più calcio e magnesio. Utilizzare una nuova lama a doppio taglio per tagliare i reni nei pezzi più piccoli possibili.

Trasferire il tessuto in un tubo da due millilitri contenente un millilitro di collagenasi A per 30 minuti a 37 gradi Celsius, mescolando delicatamente la soluzione tissutale prima e dopo la digestione con una punta di pipetta da 1000 microlitri modificata. Alla fine dell'incubazione, filtrare il tessuto digerito attraverso un colino cellulare da 100 micron. Utilizzare un raschietto cellulare e pbs ghiacciato più calcio e magnesio per schiacciare il tessuto rimanente attraverso il filtro cellulare.

Portare il volume finale della sospensione renale a singola cellula fino a 50 millilitri con PBS freddo ghiaccio fresco più calcio e magnesio e raccogliere le cellule renali per centrifugazione. Rimuovere il supernatante, quindi sospendere di nuovo il pellet con poco meno di 1,5 millilitri di PBS ghiacciato più calcio e magnesio durante il vortice e trasferire la sospensione glomerulare in un nuovo tubo a due millilitri. Per lavare i glomeruli, posizionare il tubo in un magnete per aggregare i glomeruli.

Dopo un minuto, utilizzare una pipetta da 1000 microliter per rimuovere il supernatante. E rimuovere il tubo dal magnete. Aggiungere un millilitro di PBS più calcio e magnesio ai tessuti.

Pipettare i glomeruli su e giù una volta e vortice le cellule. Riportare il tubo al magnete e lavare nuovamente i glomeruli come appena dimostrato. Fino a quando una purezza del campione non ha raggiunto almeno il 90% mediante analisi del microscopio luminoso con un ingrandimento da 40 a 100 X.

Quindi raccogliere i glomeruli purificati di perline magnetiche mediante centrifugazione. Per ottenere una purezza superiore al 95%, i glomeruli dovevano essere lavati accuratamente come dimostrato. La perfusione di biotina facilita l'etichettatura degli anelli capillari nella biotina ma non i reni del topo perfusi non controllati.

La precipitazione immunitaria della frazione di biotina degli estratti glomerulari rivela che le proteine glomerulari transmembrana nefrrina e podocalyxin sono immunoprecipitate con la biotina ma non con la frazione di controllo. La colorazione della frazione immunoprecipitata con streptavidina conferma ulteriormente la presenza di nefrrina ladata di biotina nella biotina perfusa ma non controllare gli animali perfusi. Anche la cadherina endoteliale della proteina endoteliale e la molecola di adesione intracellulare due sono immunoprecipitate all'interno della frazione di biotina.

Nella prima fase della nefrite nefrotossica si osserva una ridotta espressione di nefrrina superficiale cellulare negli animali nefrite nefrotossica rispetto ai controlli. In effetti, l'analisi densitometica mostra una significativa riduzione della nefrina ladata alla biotina negli animali nefrite nefrotossica rispetto ai controllori. L'analisi quantitativa del rapporto totale tra nefrina e actina non rivela differenze significative tra il controllo e i topi nefrite nefrotossici.

Inoltre, si osservano quantità uguali di podociti nella nefrite nefrotossica e negli animali di controllo. Nella nefrite nefrotossica tardiva, gli animali nefrotossici nefrotossici presentano un recupero dell'espressione di nefrrina senza differenze significative nella nefrina superficiale cellulare misurata tra il controllo e i topi nefrotossici nefrotossici e una riduzione totale complessiva della nefrrina negli animali nefrotossici nefritici. Inoltre, il numero di podociti viene diminuito rispetto agli animali di controllo.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere le siringhe senza bolle durante la loro connessione al fine di evitare l'embolia dell'aria dei glomeruli e di lavorare in condizioni di freddo ghiacciato una volta iniziata la perfusione renale. Seguendo questa procedura altri metodi come l'isolamento dell'RNA glomeruli e delle proteine possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive sull'espressione proteica o sulle interazioni nei reni sani e masi.