In Vitro Metodo di controllo delle concentrazioni di gas alogenati in cellule epiteliali alveolari coltivate
23 ottobre 2018
Descriviamo un protocollo facile specificamente progettato per raggiungere le concentrazioni precise e controllate del sevoflurano o isoflurano in vitro al fine di migliorare la nostra comprensione dei meccanismi coinvolti nel danno epiteliale polmonare e per testare il romanzo terapie per la sindrome da distress respiratorio.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sulle lesioni polmonari e sulla riparazione come testare l'aggiunta alogenata come potenziali nuove terapie per la sindrome da distress respiratorio acuto. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si basa su un metodo molto semplice per coltura delle cellule e per esporle ad agenti alogenati al fine di raggiungere concentrazioni precise e controllate. Per costruire la camera ermetica, utilizzare una scatola ermetica in polipropilene con una capacità di 6,5 litri.
Praticare un foro di 2,5 centimetri di diametro sul lato inferiore della parete laterale della scatola. Quindi inserire un tubo ondulato con un segno verde che fungerà da tubo di ingresso della miscela di aria gassosa. E sigillare con silicone.
Successivamente, praticare un secondo foro con un diametro di 2,5 centimetri sul lato superiore della parete laterale opposta. Inserire un altro tubo ondulato con un segno rosso e collegarlo con un filtro a carbone che fungerà da tubo di uscita della miscela di aria gassosa. Quindi sigillare con silicone.
Successivamente praticare un foro stretto con un diametro di quattro millimetri al centro della parete. Inserire il breve tubo di infusione collegato a un collettore con un blocco di esca maschile rotante. Collegalo a un analizzatore di gas e sigillalo con silicone.
Quindi posizionare un termometro digitale all'interno della camera ermetica. Sotto una cappa aspirante di laboratorio, personalizzare un circuito della macchina anestetica per cambiare la linea di gas protossido di azoto con anidride carbonica. Inserire un umidificatore riscaldato nel tubo tra la macchina anestetica e la camera ermetica per riscaldare la miscela di flusso di gas a circa 37 gradi Celsius.
Collegare la camera ermetica con il tubo ondulato marcato verde nel circuito personalizzato della macchina anestetica. Quindi, posizionare la camera ermetica su una piastra calda impostata su 37 gradi Celsius. Posizionare una piastra di sei potte contenente cellule epiteliali alveolari umane nella camera ermetica e sigillare il coperchio.
Regolare la portata del gas per ottenere rapidamente il 5% di CO2. Quindi aprire l'evaporatore dell'agente alogenato e regolare la percentuale desiderata. Una volta raggiunti i valori obiettivo, ridurre la portata del gas fresco a un litro al minuto.
La camera ermetica può essere mantenuta con questa portata di gas per tutto il tempo necessario per l'esperimento. I corsi delle concentrazioni di sevoflurane e isoflurane nel mezzo erano simili nel tempo. Subito dopo aver fissato la concentrazione richiesta di agente alogenato, le concentrazioni sono aumentate nel corso della prima ora.
Fu quindi raggiunto un altopiano che persistette fino a quando la somministrazione dell'agente alogenato non fu fermata. Dopo l'interruzione della somministrazione, le concentrazioni sono diminuite entro un'ora. Qui sono mostrate le frazioni di agente alogenato nel tempo nella camera ermetica misurata dall'analizzatore di gas.
Questa procedura è relativamente economica e molto facile da adottare anche quando i ricercatori non hanno mai manipolato una camera ermetica prima d'ora. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come la quantificazione di proteine e RNA, l'immunofluorescenza, la misurazione della permeabilità proteica e il trasporto libero al fine di rispondere alle domande sugli effetti specifici degli agenti alogenati durante la lesione polmonare epiteliale e la sua risoluzione. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica può spianare la strada alla ricerca nel campo della sindrome da distress respiratorio acuto per studiare ulteriormente il meccanismo coinvolto nella lesione polmonare epiteliale durante l'ARDS e per testare nuove terapie.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo semplice per ottenere concentrazioni precise di sevoflurano o isoflurano in vitro. Il metodo ha lo scopo di approfondire la comprensione dei meccanismi di danno epiteliale polmonare e di valutare nuove terapie per la sindrome da distress respiratorio acuto.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Medicina respiratoria
- Farmacologia
Sfondo
- La sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS) è una condizione critica che richiede nuovi approcci terapeutici.
- Agenti alogenati come sevoflurano e isoflurano potrebbero avere un potenziale nel trattamento delle lesioni polmonari.
- Comprendere i meccanismi alla base delle lesioni polmonari è essenziale per sviluppare trattamenti efficaci.
- Questo studio si concentra su un metodo per controllare l'esposizione a questi agenti in un contesto di laboratorio.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo affidabile per lo studio del danno polmonare e della riparazione.
- Verificare gli adiuvanti alogenati come potenziali terapie per la sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS).
- Migliorare la comprensione dei meccanismi del danno epiteliale polmonare.
Metodi Utilizzati
- Costruzione di una camera ermetica utilizzando una scatola in polipropilene ermetica.
- Perforazione di un foro per l'ingresso della miscela gassosa e sigillatura con silicone.
- Tecniche di coltura cellulare per esporre le cellule ad agenti alogenati.
- Raggiungimento di concentrazioni controllate di sevoflurano o isoflurano.
Risultati principali
- Il metodo consente un controllo preciso sulla concentrazione degli agenti alogenati.
- Facilita lo studio dei meccanismi di danno polmonare in vitro.
- Fornisce una piattaforma per testare nuove terapie per la sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS).
- Dimostra la semplicità e l'efficacia del protocollo.
Conclusioni
- Il protocollo sviluppato è uno strumento prezioso per la ricerca sul danno polmonare.
- Apre nuove strade per esplorare opzioni terapeutiche innovative per la sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS).
- Sono necessari ulteriori studi per convalidare i risultati ed esplorare le applicazioni cliniche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo consente un controllo preciso in vitro delle concentrazioni di gas alogenati per studiare i meccanismi di danno epiteliale polmonare nell'ARDS. Fornisce una piattaforma riproducibile per valutare nuove terapie mirate al danno alveolare e all'infiammazione. L'approccio supporta la validazione precoce dei bersagli e la riduzione del rischio meccanicistico nella scoperta di farmaci polmonari.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche che coinvolgono agenti alogenati nei percorsi di danno polmonare.
- Valore operativo: Fornisce un sistema standardizzato per la validazione funzionale delle risposte epiteliali agli agenti anestetici.
- Valore predittivo: Sostiene l'affidabilità predittiva fornendo dati quantificabili e risolti nel tempo sulla concentrazione nell'ambiente di coltura.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici validati per lo screening di composti successivi mediante esposizione controllata a gas.
- Riproducibilità: Garantisce concentrazioni costanti nei mezzi di sevoflurano e isoflurano, consentendo una valutazione affidabile dei composti.
- Scalabilità: Utilizza un design semplice di camera ermetica, adatto a formati di piastre multipozzetto ed esperimenti ripetuti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Modella il danno all'epitelio alveolare in condizioni fisiologiche rilevanti per la patofisiologia della sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS).
- Continuità traslazionale: Collega i risultati ottenuti in vitro alla validazione preclinica definendo soglie di esposizione associate a effetti biologici.
- Avanzamento basato sul rischio: Guida le decisioni di proseguimento o interruzione dello sviluppo stabilendo relazioni concentrazione-effetto per la valutazione di sicurezza ed efficacia.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dall'interazione con il bersaglio all'ottimizzazione del composto leader, in particolare per terapie polmonari rivolte a vie infiammatorie e lesive.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi su agenti alogenati come modulatori dei meccanismi di danno e riparazione epiteliale.
- Screening: Permette la standardizzazione dei saggi mediante concentrazioni gassose stabili e misurabili nella fase liquida nel tempo.
- Analisi: Genera misurazioni quantitative di variabili dipendenti (ad esempio, concentrazione nel mezzo in mg/L) tramite spettrometria di massa del gas, per il confronto tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega la dinamica dell'esposizione agli esiti biologici, favorendo una continuità preclinica allineata ai biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma riutilizzabile e a basso costo per test iterativi di terapie anestetiche o basate su gas in diversi progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nei modelli di danno polmonare fornendo condizioni controllate e riproducibili di esposizione ai gas.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità grazie alla progettazione di una camera sigillata e al monitoraggio in tempo reale dei gas.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo una riduzione precoce dei rischi associati agli adiuvanti alogenati prima di costosi studi in vivo.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sul rischio dei candidati farmacologici polmonari mediante un profilo ben definito di relazione esposizione-risposta.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura cellulare all'interfaccia aria-liquido e nei sistemi di gestione dei gas.
- Necessita dell'accesso a circuiti di macchine anestetiche, analizzatori di gas e spettrometria di massa per la validazione delle concentrazioni nel mezzo.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i protocolli di esposizione, le tecniche di sigillatura e i controlli ambientali (37°C, 5% CO2).
- Comporta considerazioni di adattamento per diversi tipi cellulari, formati di piastre e agenti alogenati diversi da sevoflurano e isoflurano.
- I limiti pratici includono i vincoli sul volume della camera e il tempo di equilibrazione (~1 ora) necessario per raggiungere concentrazioni stabili nel mezzo.
