Name: Ex Vivo modello di cultura di organo corneale per la guarigione delle ferite studi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Impara un modello di cultura di organo corneale ex vivo per studiare la guarigione delle ferite utilizzando occhi di suino. Questo metodo consente di valutare effetti di agenti terapeutici e tossicità farmacologica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Questo lavoro è stato supportato da NIH-nia R01 EY024942, ricerca per prevenire la cecità, Upstate Medical University senza restrizione ricerca fondi, e distretto Lions 20-Y. microscopia e analisi delle immagini di sezioni della paraffina sono state eseguite presso il nucleo di microscopia e preparazione del vetrino istologico è stata eseguita la Biorepository e CORE di patologia presso la scuola di medicina di Icahn al Mount Sinai.

1. organo cultura
<ol><li>
Preparazioni
	<ol>
<li>Preparare la soluzione di agar come segue. In un piccolo pallone, preparare 1% agar e il collagene bovino 1 mg/mL in DMEM-F12 fino a 20 mL. Portare ad ebollizione su un piatto caldo. Mettere la soluzione in una provetta conica da 50 mL. Posizionare il tubo in un bagno di acqua su una piastra calda per mantenere la soluzione da solidificarsi.</li>
		<li>Preparare i supporti senza siero completati (SSFM) secondo la composizione fornito in Tabella materiali. Nota: La quantità necessaria di SSFM essere preparati dipende dal numero delle cornee da elaborare. 30 mL è solitamente abbastanza media per 4 cornee.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dissezione Nota: Eseguire questo passaggio in una cappa di dissezione o una cappa chimica. Gli occhi vengono spediti con coperchi ancora attaccati in singoli sacchetti per proteggere i globi.<ol>
<li>Rimuovere globi da coperchi con una lama chirurgica retti su un tagliere pulito di etanolo. Rimozione di tessuto adiposo in eccesso dall'occhio utilizzando una lama o un piccolo paio di forbici (Figura 3A, 3B).</li>
		<li>Dopo aver rimosso il globo dal coperchio, tenere il mondo posteriormente con il forcipe e immergere immediatamente l'occhio in tampone fosfato salino (PBS). Rapidamente si tuffo 3x in 10% di iodio (in un becher da 100 mL). Immergere rapidamente 2x in PBS (~ 100 mL in un becher da PBS cambia frequentemente).</li>
		<li>Utilizzando un asciugamano pulito o tessuto, avvolgere l'occhio lungo la circonferenza con una pressione sufficiente per avere una superficie cornea tesa a tagliare con il trapano. Nota: fare attenzione per evitare l'asciugamano o tessuto dal contatto con la cornea.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ferendo
	<ol>
<li>Utilizzare un trephine 6mm per ferita al centro della cornea. Penetrare l'epitelio e lo stroma anteriore senza fare una ferita di pieno-spessore attraverso l'intera cornea. Nota: Se è penetrato l'endotelio, una perdita di pressione e liquido sarà visibili. In questo caso l'occhio deve essere eliminata.</li>
		<li>Posizionare il trephine al centro della cornea, ruotarla di 180° in senso orario e antiorario 5 x (ogni volta che il senso è cambiato conterà come una volta) esercitando una leggera pressione per approfondire la ferita. Nota: La ferita dovrebbe essere abbastanza profonda da consentire un lembo di tessuto da sollevare utilizzando un paio di pinze. Se questo non è il caso ripetere il punto 1.3.2.</li>
		<li>Sollevare la linguetta dai bordi. Allo stesso tempo, con l'altra mano o con una seconda persona, utilizzare una lama, taglio parallelo al globo per tagliare il tessuto come il forcipe continuano a sollevare la cornea anteriore all'interno del margine della ferita. A conclusione di questa fase ci dovrebbe essere una ferita circolare situata al centro della cornea (Vedi Figura 3 C, 3D).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Taglio e rimozione di Cornea dal globo
	<ol>
<li>Tenendo l'occhio con il tessuto, praticare una piccola incisione 1 mm dal bordo della cornea con una lama affinché il limbus è incluso nella coltura di organo.</li>
		<li>Utilizzando piccoli, forbici affilate accedere l'incisione creata nel passaggio precedente per tagliare intorno al globo, mantenendo un margine di millimetro in tutta la cornea per mantenere intatto il limbus.</li>
		<li>Posizionare la cornea in un piatto di 60 mm con 1 mL di PBS, ferita laterale verso il basso fino al montaggio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montaggio
	<ol>
<li>Assicurarsi che l'agar è venuto a una temperatura calda (circa 25 ° C).</li>
		<li>Con due paia di pinze, creare una tazza con il sollevare i due lati della cornea con il lato endoteliale. Aggiungere la soluzione di agar riscaldato nella cornea utilizzando una pipetta sterile fino a quando è pieno.</li>
		<li>Dopo l'agar si indurisce (solitamente circa 30-45 s) Capovolgere attentamente la cornea con l'agar nella piastra di 60 mm (Figura 3E). Coprire con un coperchio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Incubazione
	<ol>
<li>Aggiungere 4 mL di SSFM alla piastra, mantenendo le cornee ad un'interfaccia aria-liquido al confine limbal in 5% CO2 a 37 ° C. Aggiornamento media dopo 24 h e da allora in poi ogni altro giorno. Nota: Se si esegue una trasfezione nella ferita, omettere gli antibiotici fino a dopo la trasfezione.</li>
		<li>Bagnare la superficie cornea, una volta al giorno aggiungendo 1 goccia di SSFM dal media condizionati nel piatto per mantenere l'umidità. Per questo, prendere il piatto fuori l'incubatrice, posizionarlo sotto il cofano, togliere il coperchio piatto, bagnare la superficie con i media da piatto utilizzando una pipetta sterile, coprire nuovamente e rimetterlo a posto presso l'incubatore.</li>
		<li>Per atterramento di gene, trattare la ferita con gene-targeting o controllo siRNA che è complessato ad un elemento portante del lipido-mediata seguendo le istruzioni del fornitore (Vedi sotto).</li>
		<li>Mix 5 µ l (50 pmol) di siRNA in 50 µ l di siero ridotto minimo essenziale media (ad es., Opti-MEM). Mescolare 2 µ l di reagente di transfezione in 50 µ l di siero ridotto media. Lasciate che questo sedersi per 5 min e poi mescolare.</li>
		<li>Aggiungere 200 µ l di siero ridotto minimo media alla miscela reagente/siRNA.</li>
		<li>Pipettare goccia a goccia sulla ferita e incubare per 3 h.</li>
		<li>Lavare siRNA dalla superficie corneale con media nel piatto. Modificare i media di incubazione SSFM + antibiotici (Vedi la Tabella materiali). Continuare l'incubazione come accennato in precedenza (punti 1.6.1-1.6.2).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. istologia: Sezioni della paraffina e Immunostaining
<ol><li>
Preparare il tessuto
	<ol>
<li>Dopo un'incubazione di due settimane, se usare il tessuto per quantitativa della polimerasi reazione a catena (qRT-PCR) analisi in tempo reale, prima del fissaggio, tagliata la cornea nella metà attraverso la ferita. Posizionare questa metà o solo ¼ (o è abbastanza tessuto) in RNA-proteggere reagente di stabilizzazione.</li>
		<li>Utilizzando un kit di isolamento standard, RNA di isolare ed eseguire qRT-PCR. Nota: In alternativa, la parte ferita solo può essere isolata e testata per l'espressione genica.</li>
		<li>Inserire l'altra metà della cornea in cassette di patologia di tessuti e immergere nel fissativo (formalina al 10%) per 2-4 giorni a temperatura ambiente (TA).</li>
		<li>Paraffina incorporare questa metà della cornea ferita utilizzando tecniche standard. Nota: Orientare la cornea ferita per garantire che il tessuto sezionamento produrrà una sezione trasversale della cornea.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunostaining usando 3, 3'-diaminobenzidina (DAB)
	<ol>
<li>
1 ° giorno
		<ol>
<li>Etichetta scorre correttamente utilizzando una matita. De-paraffinize il tessuto inserendo diapositive in un barattolo con intermedium (2 cambi, 10 min. ciascuno).</li>
			<li>Reidratare il tessuto trasferendo i vetrini in etanolo a diminuire le concentrazioni (100%, 100%, 70%, 50%, dH2O, dH20, 5 min per ogni modifica).</li>
			<li>Eseguire ricupero dell'antigene di microwaving le diapositive in un barattolo di plastica con tampone citrato (10 mM, pH 6.4) per 5 min. Primo ciclo di 5 min a 50% di potenza. Riempire il vaso con tampone citrato e ripetere. Raffreddare per 10 minuti.</li>
			<li>Lavare 3 volte con PBS, 2 min ciascuno. Permeabilize tessuto con 1% Triton X-100 in PBS 10 min a RT. blocco sezioni con siero di capra normale 3% (NGS) per 1 h a temperatura ambiente in camera umida.</li>
			<li>Incubare il tessuto con l'anticorpo primario (1: 100 o come suggerisce il fornitore) nel 3% NGS durante la notte a 4 ° C (300 µ l per vetrino).</li>
		</ol>
</li>
		<li>
2 ° giorno
		<ol>
<li>Risciacquo diapositive 3 volte con PBST (PBS più 1% Tween 20), 2 min ciascuno. Posizionare le diapositive nel 3% H2O2 per 10 min bloccare perossidasi endogena. Lavare 3 volte con PBST, 2 min ciascuno. Incubare le sezioni con anticorpo secondario HRP (1: 250) nel 3% NGS per 1h a RT (300 µ l per vetrino).</li>
			<li>Lavare i vetrini 3 x PBST, 2 min ciascuno. Trattamento di diapositive con il kit DAB. Aggiungere 300 µ l/scorrevole per 3 min lavaggio degli acquascivoli con dH2O 2 x (rapido DIP).</li>
			<li>Colorante di contrasto con ematossilina per 20 s. lavare il vetrino con dH2O 2 x (rapido DIP). Macchia con agente azzurrante per 20 s. risciacquo in dH2O per 20 s. disidratare tessuto inserendo diapositive in aumento delle concentrazioni di etanolo (50%, 70%, 100%, 100%, tutte le salse rapidi).</li>
			<li>A secco di diapositive su un tovagliolo di carta sotto il cofano per 10-20 min.</li>
			<li>Montare diapositive utilizzando 1 goccia di montanti, coprire con vetrino coprioggetto. Etichetta e memorizzare a TA.</li>
			<li>I vetrini con un microscopio di immagine e quantificare il segnale DAB con ImageJ7 (vedere paragrafo 4).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunostaining: fluorescenza
	<ol>
<li>Il giorno 1 seguire la procedura descritta al punto 2.2.1. Il giorno 2procedere come segue.</li>
		<li>Risciacquo diapositive 3x in PBST per 2 minuti ciascuno. Incubare le sezioni con anticorpo secondario fluorophore-etichetta in 3% NGS (1: 200) per 1 h a TA.</li>
		<li>Lavare 3x in PBST, 2 min ciascuno. Montare diapositive utilizzando 1 goccia di 4 ′, mezzi di montaggio 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e coprire con un vetrino coprioggetti. Asciugare su carta assorbente sotto il cofano per 30 min. Store al buio a 4 ° C fino a fluorescenza.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Quantificazione mediante immagine J
	<ol>
<li>Scaricare la versione di "Fiji" di ImageJ, che include i plugin necessari per quantificazione di colorazione DAB.</li>
		<li>Aprire un'immagine in Fiji e selezionare immagine → colore → deconvoluzione di colore.</li>
		<li>Selezionare "H DAB" come la macchia e quindi fare clic su OK. Tre nuove immagini appariranno. Selezionare l'immagine che contiene solo DAB macchiatura.</li>
		<li>Per quantificare stromal macchiatura solo, è necessario utilizzare la funzione di gomma ImageJ per rimuovere l'epitelio dall'immagine DAB.</li>
		<li>Selezionare analizzare → misura (o Ctrl + M) e registrare il valore.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Questo protocollo descrive un modello di studio della guarigione della ferita in un ambiente naturale di 3D stratificato. Uso della cultura di organo come intermedio tra coltura cellulare e gli studi in vivo riduce significativamente i costi, nonché riducendo le procedure sugli animali vivi. Altri modelli 3D sono stati di grande beneficio per il campo tra cui self-sintetizzazione gel di collagene in fibroblasti corneali umano primario2 o queste stesse cellule incorporati in gel fatto da collageni ...

Cicatrici nella cornea derivanti da lesioni, traumi o infezione può portare a debilitante opacità e perdita permanente della vista. Così, c'è una necessità critica di individuare percorsi che possono essere oggetto di intervento terapeutico. Opzioni correnti di trattamento sono limitate e sono costituiti principalmente di trapianti corneali, che non sono accessibili ai pazienti in tutto il mondo. Sia umani (Figura 1) e cornee animale possono essere utilizzate per il 2D e coltura cellulare 3D studi1,2. Non adatto per il trapianto di cornee cadavere umano possono essere ottenute da banche degli occhi o le banche di tessuti centralizzata (nazionale malattia ricerca Interchange (NDRI)), e gli occhi degli animali possono essere ottenuti da un mattatoio. Primarie di cellule epiteliali corneale e più recentemente, le cellule endoteliali, fibroblasti stromal può essere isolato e coltivato da questi tessuti per la guarigione della ferita e tossicologia studi3,4,5. Oltre all'importanza di comprendere le basi molecolari di malattia dell'occhio di accecante, l'accessibilità del tessuto e la capacità di cellule primarie di cultura ha reso la cornea un importante sistema modello per lo studio. La cornea è ideale per testare gli effetti di agenti su cicatrici come la cornea normale è trasparente e certi tipi di ferite creano opacità o cicatrici fibrotiche (rivisto in6). Diversi in vivo della ferita corneale guarigione modelli inoltre sono stati utilizzati estesamente per cicatrici studi1. Meno utilizzati è stato l'ex vivo cornea ferita guarigione modello7,8 che è descrivere in dettaglio qui. L'obiettivo di questo metodo è quello di quantificare i risultati sfregio caratterizzati dai creatori fibrotiche in un 3D multicellulari corneale ex vivo modello di sistema.
Ferendo epiteliale corneale che non violano la membrana basale epiteliale normalmente si chiude entro 24-72 h9. Presto dopo la ferita, le cellule al bordo dell'epitelio iniziare la diffusione e la migrazione in superficie epiteliale libera, per ristabilire la funzione di barriera epiteliale. Questa attività in sequenza è seguita dall'attivazione di proliferazione delle cellule basali corneale prima e, in una fase successiva, di cellule precursori situato presso la zona limbal esterna per ottenere il recupero di cellule epiteliali massa10,11. Queste ferite spesso guariscono senza lasciare cicatrici. Tuttavia, una ferita che penetra la membrana dello scantinato dello stroma spesso comporta cicatrice formazione1. Dopo la ferita corneale stromale, lo stroma è popolato con cellule di origini multiple tra cui differenziate cellule stromale residenti così come derivate da midollo osseo fibrociti12,13,14. Cicatrici fibrotiche è caratterizzata dalla persistenza di myofibroblasts in una guarigione della ferita. Questi myofibroblasts patologico dimostrare adesione aumentata attraverso l'accumulo delle integrine nell'adesioni focali, fibre contrattili α-liscia del muscolo actina (α-SMA) stress e attivazione locale della matrice extracellulare (ECM)-sequestrato trasformazione di latente crescita fattore-beta (TGFβ). La differenziazione delle cellule epiteliali derivate, noto come epiteliale di transizione mesenchimale (EMT), può anche contribuire per cicatrice formazione6.
C'è un delicato equilibrio tra differenziazione cellulare e l'apoptosi dopo la ferita. A causa della violazione nella membrana dello scantinato, fattori di crescita come il fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) e TGFβ da lacrime e l'epitelio si bagnano lo stroma, inducendo la differenziazione dei miofibroblasti, un loop autocrino sostenuta di attivazione del TGFβ e la secrezione di disorganizzato fibrotica ECM15,16. La persistenza dei miofibroblasti nella ferita guarita promuove haze e cicatrici nella cornea (Figura 2). Tuttavia, in regeneratively guarito ferita anche se sviluppano miofibroblasti, essi apoptose e così sono assenti o significativamente ridotto in numero nel tessuto guarito (rivisto in riferimento6,10). Così, ricerca su cicatrici fibrotiche si è concentrata, almeno in parte sul targeting molecole che impediscono lo sviluppo eccessivo dei miofibroblasti o myofibroblast persistenza17,18. Perché myofibroblast persistenza caratterizza la malattia sia sfregio e fibrotica in tutti tessuti19, la cornea può essere utile come sistema modello per lo studio dei meccanismi cellulari generali di fibrosi.
Nel nostro sistema di modello, la cornea è ferita con una lama cilindrica chiamata un trephine mentre ancora nel globo. Umano e cornee di maiale possono essere ferite con entrambi un trephine 6 o 7 mm; per le cornee coniglio un trephine 6mm è preferito. La cornea di maiale è simile a quello della cornea umana. Perché essi sono efficaci e prontamente disponibili in gran numero, cornee di maiale sono abitualmente utilizzate per la coltura di organo. Inoltre, gli anticorpi e siRNA fatti reagire con umani hanno costantemente traversa-ha reagito con maiale7. Dopo il ferimento, cornee sono tagliate dal globo con il limbus intatte e montato su un base di agar/collagene. Le cornee sono coltivate in terreni privi di siero più stabilizzata di vitamina C per simulare la proliferazione dei fibroblasti e la deposizione di ECM20. L'aggiunta di siero né fattori di crescita sono necessari per indurre myofibroblast formazione7. Le cornee sono ordinariamente fissa e trattate per istologia dopo due settimane di cultura. Per atterramento di gene, o per testare gli effetti di un agente sulla guarigione delle ferite, la ferita può essere trattata con siRNA nella ferita dopo che7 o un agente di purificazione può essere aggiunto ai media, rispettivamente8.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10-010-023</td><td></td></tr><tr><td>Penna streptografa&nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>91670049</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di collagene bovino</td><td>Advance Biomatrix</td><td>5005</td><td></td></tr><tr><td>Occhi di maiale con palpebre attaccate&nbsp;</td><td>Pel-freeze, Arkansas</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>6,0 mm di trefina&nbsp;</td><td>Katena</td><td>K28014</td><td></td></tr><tr><td>Lama chirurgica&nbsp;</td><td>Personna</td><td>0.009</td><td></td></tr><tr><td>Forbice piccola</td><td>Fisher</td><td>895110</td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td>Fisher</td><td>08953-F</td><td></td></tr><tr><td>Kim Wipes&nbsp;</td><td>Kimberly-Clark&trade; 34120</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari da 60 mm&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>08-772B</td><td></td></tr><tr><td>Sierino integrato- Terreni liberi (SSFM)</td><td></td><td></td><td>Aggiungi tutti i seguenti componenti a DMEM/F-12:&nbsp; ITS, RPMI, Glutatione, L-Glutammina, MEM Aminoacidi non essenziali, MEM Piruvato di Sodio, ABAM, Gentamicina, Vitamina C. </td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>ITS Integratore per mezzi liquidi&nbsp;</td><td>Soluzione di vitamine Sigma</td><td>I3146</td><td>100X</td></tr><tr><td>RPMI 1640&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R7256</td><td>100x</td></tr><tr><td>Glutatione</td><td>Sigma</td><td>G6013</td><td>Utilizzare a 1 &micro; g/mL. Congelare le aliquote; Non riutilizzare dopo lo scongelamento.</td></tr><tr><td>Soluzione di L-glutammina all'1%&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>100x</td></tr><tr><td>MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140</td><td>100x</td></tr><tr><td>MEM Soluzione di piruvato di sodio&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11360</td><td>1 M Scorte (1.000x) e congelare in aliquits monouso. Utilizzare dal congelatore ogni volta che si preparano i supporti.</td></tr><tr><td>ABAM&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7292</td><td>100x</td></tr><tr><td>Gentamicina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>30-005-CR</td><td>200x</td></tr><tr><td>Vitamina C</td><td>Wako</td><td>070-0483</td><td>2-0-aD Acido glucopiranosil-ascorbico. 1 mM azioni (1000x)</td></tr><tr><td>10% Iodio&nbsp;</td><td>Fisher Chemical</td><td>SI86-1</td><td></td></tr><tr><td>Cassette per percorso tissutale&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>22-272416</td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra normale (NGS)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>005-000-121</td><td>Utilizziamo il 3%</td></tr><tr><td>di mezzi di montaggio NGS&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>TA-030-FM</td><td></td></tr><tr><td>Trasparente sicuro&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>314-629</td><td></td></tr><tr><td>Alcool etilico</td><td>ultra puro</td><td>200CSGP</td><td>200 Proof, diluito al 100%, 70%, 50%)&nbsp;</td></tr><tr><td>Citrato di sodio&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP327</td><td>10 mM, pH 6.4</td></tr><tr><td>Ematossilina</td><td>EMD Millipore</td><td>M10742500</td><td></td></tr><tr><td>Agente bluzzante&nbsp;</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>220-106</td><td></td></tr><tr><td>1% Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>9002-93-1</td><td>diluito in PBS</td></tr><tr><td>0,1% Tween 20&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP337</td><td>diluito in PBS</td></tr><tr><td>3% perossido di idrogeno&nbsp;</td><td>Kit</td> DAB Fisher <td>H324</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Laboratori vettoriali</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>agar</td><td>Pescatore</td><td>BP1423-500</td><td>Soluzione di agar: preparare l'1% di agar e 1 mg/mL di collagene bovino in DMEM-F12 fino a 20 mL di</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bermis</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td></td><td></td> umida <td>Utilizzare qualsiasi camera, coprirla con un panno umido e poi applicare uno strato di Parafilm su di essa.</td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qiagen RNAprotect Reagente cellulare</td><td>Qiagen</td><td> 76104</td><td></td></tr><tr><td>Ambion PureLink RNA Mini Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>12183018A</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-Fibronectina-EDA Sigma</td><td></td><td>F6140</td><td>1:200 Diluito in&nbsp; 3% siero di capra normale</td></tr><tr><td>Anti-alfa actina muscolare liscia Anticorpo</td><td>Sigma</td><td>A2547 o C6198 (cy3 coniugato)</td><td>1:200 Diluito in siero di capra normale al 3%</td></tr><tr><td>Permafluor&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>TA-030-FM</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Gt anti-MS IgG (H+L) Anticorpo secondario, HRP&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>62-6520</td><td>1:100 diluito in siero di capra normale al 3% (per colorazione a-SMA, DAB)</td></tr><tr><td>Anticorpo secondario Gt anti -MS IgM (H+L), HRP&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>PA1-85999</td><td>1:100 diluito in siero di capra normale al 3% (per Fn-EDA, colorazione DAB)</td></tr><tr><td>Gt anti -MS IgG (H+L) Anticorpo secondario, Cy3&nbsp;</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>115-165-146</td><td>1:200 Diluito in&nbsp; 3% siero di capra normale (per a-SMA, colorazione a fluorescenza)</td></tr><tr><td>&nbsp; Zeiss Axioplan2&nbsp;</td>Strumenti diagnostici <td>Zeiss</td><td></td><td>Microscope</td></tr><tr><td>SPOT-2</td><td>, Sterling Heights, telecamera</td><td></td> <td>CCD</td> Michigan</tr></tbody></table>

ex vivo modello di cultura di organo corneale per la guarigione delle ferite studi

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

La cornea è stata utilizzata ampiamente come sistema modello per studiare la guarigione della ferita. La capacità di generare ed utilizzare le cellule di mammifero primarie in due dimensioni (2D) e tridimensionali (3D) tre cultura ha generato una ricchezza di informazioni non solo sulla biologia della cornea, ma anche sulla ferita guarigione, biologia dei miofibroblasti e cicatrici in generale . L'obiettivo del protocollo è un sistema di test per quantificare lo sviluppo dei miofibroblasti, che caratterizza lo sfregio. Dimostriamo un organo corneale cultura ex vivo modello utilizzando maiale occhi. In questo keratectomy anteriore ferita, cornee ancora nel globo sono ferite con una lama circolare chiamata un trephine. Una spina di circa 1/3 della cornea anteriore viene rimosso compreso l'epitelio, la membrana dello scantinato e la parte anteriore dello stroma. Dopo il ferimento, cornee sono tagliate dal globo, montate su una base di collagene/agar e coltivate per due settimane in mezzo libero siero integrato con vitamina C stabilizzata per aumentare la proliferazione delle cellule e la secrezione extracellulare dai fibroblasti residente. Attivazione dei miofibroblasti nello stroma anteriore è evidente nella cornea guarita. Questo modello può essere utilizzato di saggiare la chiusura della ferita, lo sviluppo di miofibroblasti e fibrotici marcatori e per gli studi di tossicologia. Inoltre, gli effetti di piccole molecole inibitrici, come pure la transfezione di siRNA del lipido-mediata per atterramento di gene possono essere analizzati in questo sistema.

Immunohistochemistry è il test primario utilizzato per analizzare il successo dell'ex vivo ferita guarigione esperimento. Figura 4 raffigura l'epitelio e stroma anteriore in tessuto di controllo (Figura 4A, 4B). Sei ore dopo la ferita, l'epitelio era assente (Figura 4, 4D). Sei giorni dopo la ferita come previsto, l'epitelio aveva ricresciuti (Fi...

Un protocollo per un ex vivo modello di cultura di organo corneale utile per studi di guarigione della ferita è descritto. Questo sistema modello può essere utilizzato per valutare gli effetti degli agenti per promuovere la guarigione rigenerativa o tossicità della droga in un ambiente organizzato di pluricellulare 3D.

Ex Vivo modello di cultura di organo corneale per la guarigione delle ferite studi

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Questo articolo descriveva un metodo semplice per saggiare le ferite in un sistema tridimensionale di coltura di organi multicellulare. Lo facciamo usando gli occhi di maiale, ma anche se non hai familiarità con gli occhi, puoi fare questo saggio. Come panoramica, abbiamo ricevuto occhi suini, tagliato i globi, fatto una ferita circolare nella cornea che passa attraverso l'epitelio e circa un terzo dello stroma.Tagliamo la cornea, la montamo su una base di Agar, e mettiamo questo costrutto nell'incubatrice. Il tessuto riempirà creando una cicatrice nella cornea. Non è necessario aggiungere fattori di crescita, o anche siero.Questo viene fatto su supporti senza siero. Sebbene questo venga eseguito nella cornea, può essere utilizzato come sistema modello per la guarigione fibrotica in generale. Poiché molte delle vie cellulari che vengono attivate durante le cicatrici sono simili tra i sistemi.In un cappuccio di biosicurezza, utilizzare una lama chirurgica a bordo dritto per rimuovere il globo dal coperchio su un tagliere pulito con etanolo e rimuovere il tessuto adiposo in eccesso da ogni occhio. Tenendo il globo pulito posteriormente con le forcep immergere immediatamente l'occhio

ex-vivo-corneal-organ-culture-model-for-wound-healing-studies

Research

Ricerca

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Riportiamo una tecnica per la realizzazione di micropockets all'interno membrane elettrofilate in cui studiare il comportamento delle cellule. In particolare, si descrive una combinazione di microstereolithography e elettrofilatura per la produzione di PLGA (Poly (lattide-co-glicolico)) dispositivi biomateriale corneali dotati microfeatures.

Combinazione di Microstereolithography e Electrospinning per la Produzione di Membrane Equipaggiato con nicchie per la rigenerazione della cornea

Qui viene descritta la creazione di un modello di chirurgia della cataratta simulata ex vivo clinicamente rilevante che può essere utilizzato per studiare i meccanismi della risposta al danno dei tessuti epiteliali all'interno del loro microambiente nativo.

Istituzione di un clinicamente rilevanti<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mock chirurgia della cataratta modello per indagare epiteliale Wound Repair in un microambiente Native

Questo protocollo descrive un metodo per infliggere un'abrasione sulla superficie oculare del mouse e a seguire da allora in poi il processo di cicatrizzazione. Il protocollo si avvale di un oculare burr parzialmente rimuovere l'epitelio di superficie dell'occhio nei topi anestetizzati.

Guarigione delle ferite di abrasione epiteliale corneale con oculare Burr come un modello per Cornea

Qui, viene presentato un protocollo passo-passo per la preparazione e la coltivazione di bottoni corneali divisi su porcini. Poiché questo modello di coltura organo-tipicamente coltivata mostra i tassi di mortalità cellulare entro 15 giorni, paragonabili alle cornee dei donatori umani, rappresenta il primo modello che consente la coltivazione a lungo termine di cornee non umane senza aggiungere dextran tossico.

Un modello di cultura dell'organo endoteliale porcina utilizzando i pulsanti corneali divisi

Qui, presentiamo un protocollo per staccare le cellule endoteliali corneali (CEC) dalla membrana di Descemet (DM) utilizzando un laser neodymium:YAG (Nd:YAG) come modello di malattia ex vivo per la cherata toropatia (BK).

Sviluppo di un modello sperimentale non invasivo e assistito dal laser della perdita di cellule endoteliali corneale

Questo articolo descrive un protocollo passo-passo per impostare un modello suino ex vivo di cheratite batterica. Pseudomonas aeruginosa è usato come organismo prototipico. Questo modello innovativo imita l'infezione in vivo in quanto la proliferazione batterica dipende dalla capacità del batterio di danneggiare il tessuto corneale.

Stabilire un modello di Cornea ex vivo suina per lo studio dei trattamenti farmacologici contro la cheratite batterica

Qui, viene descritto un protocollo per la creazione di una ferita da abrasione epiteliale corneale centrale nel topo usando una trefina e uno spud smussato della mazza da golf. Questo modello di guarigione delle ferite corneali è altamente riproducibile e viene ora utilizzato per valutare la guarigione delle ferite corneali compromesse nel contesto delle malattie.

Un modello di abrasione epiteliale per lo studio della guarigione delle ferite corneali

Qui, vengono sviluppati modelli animali basati su topo e coniglio per il danno meccanico e chimico dell'epitelio corneale per lo screening di nuove terapie e del meccanismo sottostante.

Modelli animali ex vivo e in vivo per lesioni meccaniche e chimiche dell'epitelio corneale

Descemet's Stripping Only è una procedura sperimentale in cui i pazienti con guttae corneale centrale derivanti dalla distrofia corneale endoteliale di Fuchs hanno la membrana di Descemet spogliata per le cellule periferiche per rigenerare lo strato endoteliale. Presentiamo una nuova metodologia che simula il DSO nelle cornee umane distrofiche ex vivo con guarigione accelerata stimolata da eFGF1 (NM141).

Un modello di coltura di organi corneali umani dello stripping di Descemet solo con guarigione accelerata stimolata dal fattore di crescita dei fibroblasti ingegnerizzato 1

Il presente protocollo dimostra i diversi passaggi coinvolti nella ferita della cornea di un pulcino embrionale in ovo. Le cornee rigeneranti o completamente restaurate possono essere analizzate per il potenziale rigenerativo utilizzando varie tecniche cellulari e molecolari seguendo la procedura di ferita.

Studiare la rigenerazione dei tessuti senza cicatrici nelle cornee embrionali dei pulcini feriti

La coltura di organi corneali suini ex vivo e la guarigione delle ferite epiteliali forniscono un mezzo economico, etico, riproducibile e quantitativo per testare la tossicità oculare delle sostanze chimiche. Aiutano anche a chiarire i meccanismi alla base della regolazione dell'epitelizzazione e della riparazione dei tessuti e a valutare le terapie per il trattamento della cheratopatia diabetica e della guarigione ritardata delle ferite.

Valutazione della tossicità terapeutica e chimica mediante cornee suine coltivate in organo e guarigione delle ferite epiteliali

Impara un modello di cultura di organo corneale ex vivo per studiare la guarigione delle ferite utilizzando occhi di suino. Questo metodo consente di valutare effetti di agenti terapeutici e tossicità farmacologica.

Ex Vivo modello di cultura di organo corneale per la guarigione delle ferite studi

Esplora altri video