Diretto iniezione intratecale di ricombinanti Virus Adeno-associato in topi adulti

Questo metodo facilita l'efficiente somministrazione intratecale di transgeni virali adeno-associati in piccoli animali svegli per il trattamento sperimentale di malattie del sistema nervoso centrale come la SLA. Il principale vantaggio di questo metodo è che la soluzione virale include l'1%di cloridrato di lidocaina che induce una paralisi transitoria dopo un'iniezione riuscita. Sebbene questo metodo fornisca un indicatore visivo per giudicare il successo della situazione automatizzata intrateca, è essenziale una pratica sufficiente per migliorare il tasso di successo della consegna.

Prima di iniziare la procedura, attaccare un ago calibro 27 a una siringa Hamilton da 25 microliter e allineare la punta smussata dell'ago con la scala volumetrica sulla siringa. Quindi caricare con cura 8 microlitri da 4 x 10 al 10 ° genoma copie della soluzione virale nella siringa, facendo attenzione ad evitare bolle. Quindi, posizionare un topo sveglio di 30-70 giorni da 12 a 30 grammi su un pezzo del letto in posizione incline in un cappuccio di biosicurezza e coprire la parte superiore del corpo con garza sterile per calmare il mouse ed evitare di essere morso.

Afferra saldamente il mouse sulla cintura pelvica con il pollice su un lato e l'indice e il dito medio dall'altro lato mantenendo la pelle tra le cinghie pelviche bilaterali tate con un pollice e un indice. Quindi radere la pelliccia tra le cinghie pelviche bilaterali e sterilizzare la pelle esposta con uno scrub a base di iodio e 70% di etanolo. Per la consegna intratecale diretta della soluzione virale adeno-associata, palpare lo spazio intervertebrale lungo la linea mediana tra le cinghie pelviche bilaterali e utilizzare un'unghia per deprimere un'indentazione nella pelle per indicare lo spazio intervertebrale da L5 a L6.

Ruotare leggermente e delicatamente la base della coda per rivelare la linea mediana della colonna vertebrale e regolare la smussatura dell'ago verso la testa dell'animale. Con il mouse fissato saldamente in posizione, allineare l'ago lungo la linea mediana della colonna vertebrale e inserire l'ago delicatamente e verticalmente al centro dell'indentazione mantenendo la siringa in un piano sagittale centrale. Quando l'ago entra in contatto con l'osso, diminuire lentamente l'angolo a circa 30 gradi e infilare l'ago nello spazio intervertebrale.

Un colpo di coda improvviso è il segno di un ingresso riuscito nello spazio intradurale. Quando l'ago entra nello spazio intervertebrale, la punta si sentirà saldamente bloccata. Iniettare la soluzione vettoriale e mantenere l'ago all'interno dello spazio intradurale per un minuto.

Quindi ritirare lentamente l'ago con rotazione per ridurre al minimo le perdite. Segna immediatamente la debolezza transitoria degli arti del topo per valutare la qualità dell'iniezione e riportare il topo nella sua gabbia per il recupero dalla paralisi. All'endpoint sperimentale appropriato, fissare gli arti e la testa del topo iniettato nella posizione prona su un coperchio della scatola di schiuma e utilizzare le forbici per spogliare e rimuovere la pelle dalla testa all'osso sacro.

Ritagliare il cranio tra gli occhi, tagliare lungo la linea mediana del cranio e la linea orizzontale sopra il cervelletto e aprire il cranio su ciascun lato. Utilizzare una pinzetta per rimuovere l'osso occipitale e utilizzare forbici oftalmiche per aprire il canale spinale bilateralmente. Tagliare le costole su entrambi i lati e rimuovere con cura la sezione superiore delle vertebre.

Usa una pinzetta curva per sollevare il cervello e erta i nervi della base del cranio. Quindi estrarre accuratamente l'intero cervello e il midollo spinale e fissare i tessuti in paraformaldeide al 4% per 24 ore. Alla fine del periodo di fissazione, crioproteggere il cervello e il midollo spinale cervicale e lombare in soluzione di saccarosio al 30% durante la notte a 4 gradi Celsius seguita dall'incorporamento in un composto ottimale della temperatura di taglio prima di scattare il congelamento nell'azoto liquido.

Quindi utilizzare un criostato per ottenere sezioni spesse 25 micrometri di ciascun tessuto, immagazzinando le sezioni congelate in PBS molare 0,01 a 4 gradi Celsius man mano che vengono ottenute. Per l'analisi immunoistochimica dei tessuti, pretrattare le sezioni galleggianti libere con perossido di idrogeno dell'1% per 10 minuti seguito da un lavaggio di 10 minuti in PBS. Successivamente incubare i campioni in soluzione di blocco contenente il 5% di siero e lo 0,3% di detergente non ionico in PBS per 1 ora seguito da un'etichettatura notturna a 4 gradi Celsius con gli anticorpi primari appropriati di interesse.

Il giorno successivo, lavare le sezioni con lavaggi di 3 10 minuti in PBS più Tween e incubare i vetrini con gli anticorpi secondari biotinilati appropriati corrispondenti a temperatura ambiente per 1 ora dopo l'ultimo lavaggio. Al termine dell'incubazione, lavare le sezioni 3 volte in PBST fresco come appena dimostrato e incubare i campioni con complesso di perossidasi di biotina a sfioro per 40 minuti seguito da colorazione con un agente cromogenico appropriato. Montare le sezioni etichettate su vetrini al microscopio e immergere gli scivoli in etanolo anidro per 5 minuti una volta che le sezioni montate si sono completamente asciugate.

Successivamente immergere gli scivoli in xilene per 10 minuti e sigillarli con un mezzo di montaggio appropriato. Quindi immagini le diapositive con un microscopio a luce dotato di un dispositivo accoppiato a carica a 100, 200 e 400 volte gli ingrandimenti. L'immunostaining eGFP delle sezioni del tessuto del midollo spinale cervicale e lombare rivela una trasduzione scarsa o nessuna nel midollo spinale lombare dei topi con un punteggio di debolezza di 0, una trasduzione leggermente migliorata nei topi con un punteggio di debolezza di 1 e trasduzioni forti e diffuse nei topi con un punteggio di debolezza di 4 o 5.

La quantificazione dell'intensità di colorazione GFP delle sezioni del tessuto del midollo spinale da topi che mostrano vari gradi di debolezza degli arti transitori indica che la gravità della debolezza dopo l'iniezione della soluzione virale è strettamente correlata con l'estensione della trasduzione del midollo spinale. Nel cervello, vengono rilevati robusti segnali eGFP nel bulbo olfattivo, nella corteccia prefrontale dorsolaterale, nel giro dentato e nella zona CA3 dell'ippocampo, nella corteccia cerebellare e nelle aree marginali del tronco encefalico, tra cui il nucleo facciale, il plesso coroideo e le cellule epiteliali ependimali. I motoneuroni nelle corna anteriori sono anche fortemente trasdotti in diversi livelli del midollo spinale.

Inoltre, nella corteccia, vengono rilevati neuroni positivi alla GFP tra cui cellule piramidali e vari tipi di cellule gliali tra cui microglia, astrociti e oligodendrociti. Questa tecnica consente ai ricercatori nel campo della neurologia di esplorare gli effetti terapeutici del parto intratecale diretto in piccoli animali svegli sulle malattie del sistema nervoso centrale.