Name: Struttura di cristallo del dominio N-terminale del recettore Ryanodine da Plutella xylostella (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Esplora la cristallografia a raggi X per determinare la struttura del dominio N-terminale del recettore della ryanodina di Plutella xylostella. Questo metodo computazionale rivela i meccanismi di apertura del canale e supporta la progettazione di insetticidi specifici.

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Finanziamenti per questa ricerca è stata fornita da: nazionali chiave di ricerca e sviluppo programma della Cina (2017YFD0201400, 2017YFD0201403), National Nature Science Foundation of China (31320103922, 31230061) e programma di progetto di ricerca base nazionale (973) di Cina (2015CB856500, 2015CB856504). Siamo grati al personale la beamline BL17U1 a Shanghai Synchrotron Radiation Facility (SSRF).

1. clonazione di Gene, l'espressione della proteina e la purificazione
<ol><li>PCR amplificare il DNA corrispondente alla proteina di interesse (residui 1-205 di DBM RyR, Genbank ACC. n. AFW97408) e clone in animali-28a-HMT vettore di clonazione di legatura-indipendente (LIC)25. Questo vettore contiene un tag di istidina, MBP tag e un sito di clivaggio della proteasi TEV al N-terminale15.
	<ol>
<li>Progettazione LIC primer per l'amplificazione del gene bersaglio con LIC-compatibile 5' le estensioni: Forward primer LIC: 5' TACTTCCAATCCAATGCAATGGCGGAAGCGGAAGGGG 3' Reverse primer LIC: 5' TTATCCACTTCCAATGTTATTATATGCCGGTCCCGTACGGC 3'</li>
		<li>Combinare i componenti di reazione (50 μL): 1 μL di modelli di DNA (100 ng/μL), 1 μL di forward primer (10 μM), 1 μL di reverse primer (10 μM), 0,5 µ l di DNA polimerasi (NEB), 5 μL di reazione 10X tampone, 1 μL di dNTP (25 mM) , 40,5 μL della RNasi free ddH2O.<ol>
<li>Inserire la miscela di reazione in una macchina PCR ed eseguire il seguente programma.</li>
			<li>Incubare a 95 ° C per 3 min, e quindi eseguire 30 cicli di (95 ° C per 30 s, 58 ° C per 15 s, 72 ° C per 1 min). Incubare a 72 ° C per 5 min e quindi tenere a 4 ° C.</li>
			<li>Eseguire il mix di reazione intera (50 μL) su un gel di agarosio al 2% ed estrarre con un Kit di estrazione del Gel. Seguire il protocollo del produttore.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Legatura-indipendente clonazione (LIC)<ol>
<li>Eseguire SspI digestione (60 µ l): 20 μL di DNA di vettore (50 ng/μL), 6 μL di tampone di reazione, 4 μL di SspI e 30 μL di ddH2O. Incubare a 37 ° C per 3 h. eseguire l'intera reazione: 10x mescolare su gel di agarosio 1% ed estrarre con un Kit di estrazione del Gel. Seguire il protocollo del produttore.</li>
			<li>Eseguire trattamento T4 DNA polimerasi del vettore e inserire il DNA. Combinare i seguenti: 5 μL di DNA vettore o insert (50 ng/μL), 2 μL di tampone di 10 x T4 DNA polimerasi, 1 μL del dGTP (25 mM) per vettore o 1 μL di dCTP (25 mM) per inserimento del DNA, 1 μL di DTT (100 mM), 0,4 μL di T4 DNA polimerasi (LIC-qualificato) e 9.6 μL di reazioni di ddH2O. Incubare a temperatura ambiente per 40 min. inattivare con il calore enzima a 75 ° C per 20 min. Nota: Il vettore LIC e inserimento del DNA devono essere trattati in reazioni separate.</li>
			<li>Eseguire la reazione di ricottura di LIC. Combinare i seguenti: 2 µ l di DNA di T4-trattati inserto, 2 μL di LIC T4-trattati di vettore del DNA. Incubare la reazione a temperatura ambiente per 10 min.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trasformare BL21 (DE3) Escherichia coli cellule con questo plasmide ricombinante.<ol>
<li>Scongelare le cellule competenti (50 μL in micro-provetta) sul ghiaccio.</li>
		<li>Aggiungere circa 1 μL (50 ng) del plasmide nel tubo. Mescolare le cellule e DNA scorrendo delicatamente il tubo 2 – 3 volte. Porre la provetta in ghiaccio per 20 min.</li>
		<li>Riscaldare shock a 42 ° C per 40 s. posto il tubo sul ghiaccio ancora per 2 min. aggiungere 1 mL di LB di temperatura media per il tubo.</li>
		<li>Posto il tubo miscela nello shaker 250 giri/min a 37 ° C per 45 min. sviluppa 150 – 200 µ l della miscela nei piatti di selezione. Capovolgere la piastra e incubare per una notte a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Scegli una singola Colonia e cultura le cellule in 100 mL di terreno di 2YT contenente 50 kanamicina µ g/mL a 37 ° C durante la notte. Mattina successiva, inoculare medio 2YT 1 L contenente 50 kanamicina µ g/mL 10 ml di coltura durante la notte e incubare in incubatore a 37 ° C agitatore a 250 giri/min, fino a quando raggiunge il OD600 ~ 0.6. Da allora in poi indurre la cultura con IPTG ad una concentrazione finale di 0,4 mM e crescere per un altro 5 h a 30 ° C.</li>
	<li>Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 8.000 x g per 10 min a 4 ° C, raccogliere le cellule e risospendere ogni cellule di 10 g in 40 mL di tampone di lisi (10 mM HEPES pH 7.4, 250 mM KCl, 10mm β-mercaptoetanolo, lisozima di 25 μg/mL, 25 μg/mL dnasi 1 mM PMSF).<ol>
<li>Interromperla tramite sonicazione ad ampiezza di 65% per 8 min con 1 s s on e 1 fuori. Rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione a 40.000 x g per 30 min a 4 ° C. Filtrare il surnatante passando attraverso il filtro di 0,22 μm e caricarlo nel loop del campione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purificare la proteina di fusione, fendere il tag e ri-purificare la proteina bersaglio.<ol>
<li>Purificare la proteina di fusione utilizzando colonna Ni-NTA (buffer obbligatorio: 10 mM a pH 7.4, 250 mM KCl HEPES; tampone di eluizione: 10 mM a pH 7.4, 250 mM KCl, imidazolo 500 mM HEPES) e purificare da un sistema di depurazione, con una sfumatura lineare di imidazolo 20 – 250 mM.</li>
		<li>Fendere la proteina bersaglio eluiti con proteasi TEV (01:50 rapporto) overnight a 4 ° C.</li>
		<li>Purificare la miscela di reazione di scissione tramite colonna di resina di amilosio (buffer obbligatorio: 10 mM a pH 7.4, 250 mM KCl HEPES; tampone di eluizione: 10 mM a pH 7.4, 250 mM KCl, maltosio 10 mM HEPES) e colonna Ni-NTA per rimuovere il tag e proteasi TEV. La proteina dell'obiettivo sarà nella frazione del flusso continuo di queste due colonne.</li>
		<li>Dializzare il campione contro il buffer di dialisi (10 mM Tris-HCl pH 8,8, 50 mM KCl, 10mm β-mercaptoetanolo per ridurre la concentrazione di sale. Purificare il campione su una colonna di scambio anionico (buffer obbligatorio: 10 mM Tris-HCl a pH 8.8, 10mm β-mercaptoetanolo; tampone di eluizione: 10 mM Tris-HCl a pH 8.8, 1m KCl, 10mm β-mercaptoetanolo) da una sfumatura lineare di 20 – 500 mM KCl nel buffer di eluizione.</li>
		<li>Come ultimo passo nel processo di purificazione, concentrare la proteina utilizzando concentratore centrifugo (10 kDa MWCO) e iniettare in una colonna di gel-filtrazione Superdex 200 26/600 per verificare l'omogeneità.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Esaminare la purezza della proteina in esecuzione su un 15% SDS pagina. Nota: Tutte le colonne sono in esecuzione su un sistema di purificazione della proteina con una portata di associazione di 2 mL/min e un tasso di flusso di eluizione di 4 mL/min ad eccezione di gel-filtrazione a 1 mL/min.</li>
</ol>2. proteina preparazione e cristallizzazione
<ol><li>Concentrare il campione proteico purificato a 10 mg/mL utilizzando concentratore centrifugo (10 kDa MWCO) e lo scambio di buffer buffer cristallizzazione prima della conservazione a-80 ° C.</li>
	<li>Eseguire lo screening di cristallizzazione (rapporto 1:1, 200 nL di proteina e 200 nL del buffer serbatoio) di seduta drop metodo di diffusione del vapore a 295 K con diversi kit di cristallizzazione utilizzando un liquido automatico movimentazione robotizzata in un formato a 96 pozzetti. Nota: Abbiamo utilizzato i kit da ricerca dimensioni molecolari e Hampton e il Grifone automatizzato sistema di gestione dei liquidi.</li>
	<li>Sigillare la piastra 96 pozzetti cristallizzazione per evitare l'evaporazione e abilitare l'equilibrazione della proteina goccia con il buffer di serbatoio. Quindi tenere le piastre nell'incubatore cristallo a 18 ° C.</li>
	<li>Controllare le piastre da 96 pozzetti periodicamente utilizzando un microscopio ottico per monitorare la crescita e la formazione di cristalli.</li>
	<li>Per distinguere i cristalli della proteina da cristalli di sale, usare un colorante di proteina. Aggiungere 1 µ l di colorante per il drop di destinazione. Attendere circa 1 h e osservare al microscopio. I cristalli della proteina diventerà blu.</li>
	<li>Utilizzare le condizioni di cristallizzazione positivo (solfato di ammonio di 1,5 M, 0.1 M Tris-HCl pH 8.0) per ottimizzare ulteriormente i cristalli con impiccagione vapor-diffusione metodo drop in piastre da 24 pozzetti.<ol>
<li>Ottimizzare pH da 7.0 a 8.5 con intervallo di unità di pH 0,5 ogni passo. Ottimizzare la concentrazione di solfato di ammonio da 1,2 M a 1,7 M con intervallo di 0,1 M ogni passo. (Nel nostro caso la migliore condizione producendo grandi cristalli a forma di piastra era solfato dell'ammonio 0,1 M HEPES pH 7.0 e 1.6 M)</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Crystal montaggio, raccolta di dati di raggi x e determinazione della struttura
<ol><li>Montare i cristalli in un cryoloop e flash-cool in azoto liquido con serbatoio soluzione contenente 20% glicerolo come cryo-protectant. Posizionare i cristalli in unipuck per immagazzinaggio e trasporto.</li>
	<li>Pre-schermo cristalli della proteina usando un diffractor di raggi x in-House Verian. Scegliere i migliori con le risoluzioni più alte per la raccolta di dati presso sincrotrone (nostro dataset è stato raccolto da BL17U1 presso Shanghai Synchrotron Radiation Facility).<ol>
<li>Utilizzare il software di controllo beamline BluIce26 per montare e centrare i cristalli dalla funzione di centraggio automatica o manuale. Eseguire le esposizioni di prova per determinare la strategia di raccolta dei dati, compreso l'avvio di angolo, tempo di esposizione, distanza rivelatore, Larghezza telaio e numeri.</li>
		<li>Raccogliere il dataset di conseguenza (abbiamo raccolto 180 telai con 1 tempo di esposizione di s, Larghezza telaio 1° e la distanza di rivelatore di 350 mm).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Indice, integrare e scalare il dataset utilizzando HKL2000 suite27. Prima di svolgere la funzione di ricerca di picco per trovare i punti di diffrazione e quindi i punti di indice e selezionare il gruppo giusto spazio. Dopo l'integrazione del picco, scala il dataset con il modello corretto errore e salvare il file di output. SCA.</li>
	<li>Risolvere il problema di fase di rimontaggio molecolare usando Phaser28 PHENIX29.<ol>
<li>Calcolare il numero di possibili copia di molecole proteiche nell'unità asimmetrica di Xtriage30.</li>
		<li>Cercare i modelli di struttura adeguata con la somiglianza strutturale e di identità in sequenza ad alta come la proteina dell'obiettivo utilizzando strutture note dalla letteratura o i modelli generati da server di predizione di struttura come Phyre231 (abbiamo usato coniglio RyR1 NTD come un modello di ricerca, PDB ID 2XOA).</li>
		<li>Eseguire Phaser utilizzando il file di dati di diffrazione, il file di struttura del modello e il file di sequenza della proteina per trovare la soluzione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire AutoBuild32 PHENIX29 per generare il modello iniziale utilizzando il file di output da Phaser e il file di sequenza da proteina bersaglio.</li>
	<li>Costruire la struttura nella densità dell'elettrone sperimentale modificate utilizzando folaga33 e perfezionare usando phenix.refine34 in cicli iterativi manualmente.</li>
	<li>Convalidare il modello finale utilizzando gli strumenti di convalida di PHENIX18.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In questo articolo, descriviamo la procedura per recombinantly esprimere, purificare, cristallizzare e determinare la struttura di DBM RyR NTD. Per cristallizzazione, un requisito fondamentale è quello di ottenere proteine con omogeneità, purezza e solubilità alta. Nel nostro protocollo, abbiamo scelto di utilizzare animali-28a-HMT vettoriale in quanto contiene un tag hexahistidine e MBP, entrambi i quali potrebbero essere utilizzati per la purificazione ottenere una maggiore purezza di piega. Inoltre, gli aiuti di tag M...

Recettori della rianodina (RyRs) sono canali ionici specifici, che mediano la permeazione degli ioni Ca2 + attraverso le membrane del reticolo sarcoplasmatico (SR) nelle cellule muscolari. Di conseguenza, giocano un ruolo importante nel processo di accoppiamento eccitazione contrazione. Nella sua forma funzionale, RyR monta come un homo-tetramero con una massa molecolare di > 2 MDa, con ogni unità secondaria che contengono residui dell'amminoacido ~ 5000. Nei mammiferi, ci sono tre isoforme: RyR1 - tipo di muscolo scheletrico, muscolo cardiaco tipo di RyR2 - e RyR3-ubiquitariamente espressa in diversi tessuti1.
Negli insetti c'è un solo tipo di RyR, che si esprime nel tessuto muscolare e nervoso2. Insetto RyR è più simile a mammiferi RyR2 con un'identità di sequenza di circa il 47%3. Insetticidi di diammide targeting RyR di lepidotteri e coleotteri sono stati sviluppati e commercializzati da importanti aziende come Bayer (flubendiamide), DuPont (chlorantraniliprole) e Syngenta (cyantraniliprole). Dal suo lancio relativamente recente, diammide insetticidi sono diventati uno della più rapida crescita classe di insetticidi. Attualmente, le vendite di questi tre insetticidi annualmente hanno attraversato 2 miliardi di dollari con un tasso di crescita di oltre il 50% dal 2009 (Agranova).
Gli studi recenti hanno segnalato lo sviluppo di resistenza negli insetti dopo poche generazioni di utilizzo di questi insetticidi4,5,6,7,8. Le mutazioni di resistenza nel dominio del transmembrane di RyRs dal diamondback moth (DBM), Plutella xylostella (G4946E, I4790M) e le corrispondenti posizioni in pomodoro minatrice, Tuta absoluta (G4903E, I4746M) mostrano che la regione potrebbe essere coinvolto nel legame di insetticida diammide come questa regione è conosciuta per essere critico per gating del canale4,8,9. Nonostante approfondite ricerche in questo settore, i meccanismi molecolari esatti di insetticidi diammide rimangono evasivi. Inoltre, non è chiaro se le mutazioni di resistenza riguardano le interazioni con diamides direttamente o allosterico.
Precedenti studi hanno segnalato la struttura dei diversi domini di RyR da specie di mammiferi e la struttura del full-length dei mammiferi RyR1 e RyR2 di cristallografia a raggi x e microscopia crio-elettronica, rispettivamente10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Ma finora, nessuna struttura di insetto RyR è stata segnalata, che ci impedisce di comprendere le complessità molecolare della funzione del ricevitore come pure i meccanismi molecolari di azione insetticida e lo sviluppo della resistenza agli insetticidi.
In questo manoscritto, presentiamo un protocollo generalizzato per la caratterizzazione strutturale del dominio β-trifoglio N-terminale del recettore rianodinico dal diamondback moth, un parassita distruttivo infettare crocifere colture in tutto il mondo22. Il costrutto è stato progettato secondo il coniglio pubblicati RyR1 NTD cristallo strutture23,24e cryo-EM modelli strutturali16,17,18,19, 20 , 21. Questa è la prima struttura ad alta risoluzione segnalata per insetto RyR, che rivela il meccanismo per canale gating e fornisce un modello importante per lo sviluppo di specie-insetticidi utilizzando Progettazione di farmaci basati su struttura. Per delucidazione della struttura, abbiamo impiegato la cristallografia a raggi x, che è considerato come il 'gold standard' per la determinazione della struttura della proteina a vicino a risoluzione atomica. Anche se il processo di cristallizzazione è imprevedibile e alta intensità di manodopera, questo protocollo passo-passo vi aiuterà i ricercatori di esprimere, purificare e caratterizzare altri domini di insetto RyR o qualsiasi altre proteine in generale.

<table><tbody><tr>Vettore <td></td><td></td><td>pET-28a-HMT</td><td>Questo vettore pET modificato contiene un tag esaistidina, una proteina di fusione MBP e un sito di scissione della proteasi TEV all'N-terminale (Lobo e Van Petegem, 2009)</td></tr><tr><td>E. coli BL21 (DE3) ceppo</td><td>Novagen</td><td>69450-3CN</td><td></td></tr><tr><td>Colonna HisTrapHP (5 mL)</td><td>GE Healthcare</td><td>45-000-325</td><td></td></tr><tr><td>Colonna in resina di amilosio</td><td>New England Biolabs</td><td>E8021S</td><td></td></tr><tr><td>Colonna ad alte prestazioni Q Sepharose&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1154-01</td><td></td></tr><tr><td>Concentratori Amicon (10 kDa MWCO)</td><td>Millipore</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Colonna di filtrazione su gel Superdex 200 26/600</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9893-36</td><td></td></tr><tr><td>Sistema robotizzato automatizzato per la manipolazione dei liquidi&nbsp;</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>Gryphon</td><td></td></tr><tr><td>96 Well CrystalQuick</td><td>Greiner bio-one</td><td>82050-494</td><td></td></tr><tr><td>Uni-Puck</td><td>Dimensioni molecolari</td><td>MD7-601</td><td></td></tr><tr><td>Montato CryoLoop - 20 micron</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-955</td><td></td></tr><tr><td>CryoWand</td><td>Dimensioni molecolari</td><td>MD7-411</td><td></td></tr><tr><td>Puck strumento di caricamento dewar</td><td>Molecolare Dimensioni</td><td>MD7-607</td><td></td></tr><tr><td>Nano drop</td><td>Thermo Scientific NanoDrop</td><td>One</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore a cristalli</td><td>Dimensioni molecolari</td><td>MD5-605</td><td></td></tr><tr><td>Diffrattore a raggi X</td><td>Rigaku</td><td>FRX</td><td></td></tr><tr><td>Macchina PCR</td><td>Eppendorf</td><td>Nexus GX2</td><td></td></tr><tr><td>Kit di mini-preparazione del plasmide</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Estrazione del gel kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>SspI restrizione endonucleasi</td><td>NEB</td><td>R0132S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA polimerasi</td><td>Novagen</td><td>2868713</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Scientific Chemical</td><td>25389940</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Genview</td><td>367931</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Genview</td><td>7365459</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo</td><td>Genview</td><td>60242</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall LYNX 6000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sonnicator</td><td>Scientz</td><td>II-D</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di purificazione delle proteine</td><td>GE Healthcare</td><td>Akta Microscopio a luce pura</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>IzIt colorante a cristalli</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-710</td><td></td></tr><tr><td>Unità di elettroforesi</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005EDU</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore agitatore</td><td>Zhicheng</td><td>ZWYR-D2401</td><td></td></tr><tr><td>Schermo di cristallo indice</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-144</td><td></td></tr><tr><td>Struttura schermo di cristallo</td><td>Dimensioni molecolari</td><td>MD1-01</td><td></td></tr><tr><td>Schermo di cristallo ProPlex</td><td>Dimensioni molecolari</td><td>MD1-38</td><td></td></tr><tr><td>Schermo di cristallo premier PACT</td><td>Dimensioni molecolari</td><td>MD1-29</td><td></td></tr><tr><td>Schermo di cristallo JCSG-plus</td><td>Molecolare Dimensioni</td><td>MD1-37</td><td></td></tr></tbody></table>

struttura di cristallo del dominio n-terminale del recettore ryanodine da plutella xylostella

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Sviluppo di insetticidi potenti ed efficienti targeting recettori della rianodina insetto (RyRs) è stato di grande interesse nella zona di controllo dei parassiti agricoli. Ad oggi, diversi insetticidi diammide targeting dei parassiti che RyRs sono stati commercializzati, che generano un fatturato annuo di 2 miliardi di dollari. Ma la comprensione del modo di azione degli insetticidi RyR-targeting è limitata dalla mancanza di informazioni strutturali per quanto riguarda insetto RyR. Questo a sua volta limita la comprensione dello sviluppo della resistenza agli insetticidi in parassiti. Il diamondback moth (DBM) è un parassita devastante distruggendo crocifere raccolti in tutto il mondo, che inoltre è stato segnalato per mostrare resistenza agli insetticidi diammide. Pertanto, è di grande importanza pratica per sviluppare nuovi insetticidi il RyR DBM, targeting soprattutto per una regione diversa dal sito di legame tradizionale diammide di targeting. Qui, presentiamo un protocollo per caratterizzare strutturalmente il dominio N-terminale di RyR da DBM. La struttura di cristallo dei raggi x è stato risolto da sostituzione molecolare ad una risoluzione di 2,84 Å, che mostra un motivo di beta-trefoil pieghevole e un accompagnamento alfa elica. Questo protocollo può essere adattato per l'espressione, purificazione e caratterizzazione strutturale di altri domini o proteine in generale.

Purificazione
Il dominio N-terminale di RyR DBM è stato espresso come proteina di fusione con un tag di hexahistidine, un tag MBP e un sito di clivaggio della proteasi TEV. Abbiamo seguito una strategia di cinque fasi di purificazione per ottenere una proteina altamente pura, adatta a scopo di cristallizzazione. In un primo momento, la proteina di fusione è stata purificata dalla frazione solubile del lysate delle cellule di colonn...

In questo articolo, descriviamo i protocolli della determinazione di espressione, purificazione, cristallizzazione e struttura della proteina del dominio N-terminale del recettore rianodinico da diamondback moth (Plutella xylostella).

Struttura di cristallo del dominio N-terminale del recettore Ryanodine da Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Risolvere la struttura del dominio del recettore della ryanodina può aiutare con la nostra comprensione del meccanismo molecolare della funzione proteica, dell'azione insetticida e dello sviluppo della resistenza agli insetticidi. Questa misura implica l'uso della cristallografia a raggi X per l'illustrazione della struttura, che è considerata un gold standard per la determinazione della struttura proteica a risoluzione quasi atomica. Questa struttura ad alta risoluzione del dominio del recettore della ryanodina degli insetti rivela il meccanismo di canalizzazione e fornisce un modello importante per lo sviluppo di insetticidi specifici per specie utilizzando approcci di progettazione di farmaci basati sulla struttura.Generalmente, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà, perché i potenziali cristallografi proteici devono essere esperti di biochimica, biofisica, informatica e matematica. Inizia amplificando il DNA corrispondente alla proteina di interesse per reazione a catena della polimerasi. Al termine della reazione, eseguire tutti i 50 microlitri di miscela di reazione su un gel di agarosio al 2% ed estrarre il DNA con un kit di estrazione del gel secondo protocolli standard.Successivamente, linearizzare il DNA vettoriale LIC mescolando 20 microlitri del DNA vettoriale con 6 microlitri di tampone di reazione 10X e 4 microlitri dell'enzima di restrizione SspI in 30 microlitri di acqua doppia distillata. Incubare questa miscela di reazione per tre ore a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, eseguire l'intero mix di reazione su un gel di agarosio dell'1%, seguito dall'estrazione del DNA vettoriale linearizzato con un kit di estrazione del gel secondo le istruzioni del produttore.Successivamente, eseguire trattamenti separati T4 DNA polimerasi su 5 microlitri del DNA vettoriale linearizzato e del DNA dell'inserto amplificato PCR, secondo protocolli standard. Incubare per 40 minuti a temperatura ambiente, seguito da 20 minuti di inattivazione del calore enzimatico a 75 gradi Celsius. Eseguire la reazione di ricottura della clonazione indipendente dalla legazione combinando 2 microlitri del DNA inserto trattato con T4 con 2 microlitri del DNA vettoriale LICA trattato con T4 per un'incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente.Per trasformare le cellule BL21(DE3)E. Coli con il plasmide ricombinante, scongelare 50 microlitri di cellule competenti sul ghiaccio e aggiungere circa 1 microlitro del plasmide ricotto al tubo. Far scorrere delicatamente il tubo da due a tre volte per mescolare le cellule e il DNA e riposizionare il tubo sul ghiaccio per 20 minuti.Alla fine dell'incubazione, shock termico le cellule a 42 gradi Celsius per 40 secondi, seguite da due minuti di nuovo sul ghiaccio. Quindi, aggiungere un millilitro di mezzo LB a temperatura ambiente al tubo e posizionare le celle su uno shaker da 250 giri/min per 45 minuti a 37 gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione tremante, piastra da 150 a 200 microlitri di questa miscela su piastre di selezione e invertire le piastre durante la notte a 37 gradi Celsius.Il giorno dopo, cultura una singola colonia in 100 millilitri di mezzo 2-YT, integrata con kanamicina, in un incubatore shaker a 37 gradi Celsius durante la notte. La mattina seguente, inoculare un litro di mezzo 2-YT, integrato con kanamicina, con 10 millilitri di coltura notturna, e incubare a 37 gradi Celsius con scuotimento fino a quando la lettura OD600 raggiunge circa 0,6. Quindi, indurre la coltura con IPTG a una concentrazione finale di 0,4 millimolare e far crescere le cellule per cinque ore a 30 gradi Celsius.Alla fine dell'incubazione, raccogliere le cellule per centrifugazione e sospendere di nuovo il pellet a 10 grammi di batteri per 40 millilitri di concentrazione tampone di lisi. Interrompere le pareti cellulari per sonicazione con un'ampiezza del 65% e un secondo su un secondo di riposo, per otto minuti. Rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione.Quindi, filtrare il supernatante attraverso un filtro da 22 micrometri e caricare la soluzione in un ciclo campione. Per purificare la proteina di fusione, iniettare il supernatante filtrato dal ciclo del campione in una colonna nichel-nitrolotriacetica a cinque millilitri su un sistema di purificazione con un gradiente lineare da 20 a 250 millimolare imidazolo. Scindere la proteina bersaglio eluita con la proteasi del virus dell'incisione del tabacco, con un rapporto da 1 a 50, durante la notte a 4 gradi Celsius, e purificare la miscela di reazione di scissione su una colonna di resina amilosio e una colonna nichel-nitrolotriacetica, per rimuovere l'etichetta e la proteasi del virus dell'incisione del tabacco.Dializzare il flusso dalla colonna nichel-nitrolotriacetica contro il tampone di dialisi per ridurre la concentrazione di sale e purificare il campione su una colonna di scambio di anione di un gradiente lineare di cloruro di potassio da 20 a 500 millimolare nel tampone di eluizione. Quindi, concentrare la proteina in un concentratore centrifugo. Iniettare la proteina concentrata in una colonna di filtrazione in gel Superdex 200 26/600 per verificare l'omogeneità e valutare la purezza della proteina del 15%SDS-PAGE.Per preparare la proteina alla cristallizzazione, concentrare il campione proteico purificato a 10 milligrammi per millilitro nel concentratore centrifugo e scambiare tampone nel tampone di cristallizzazione prima dello stoccaggio di 80 gradi Celsius. Per eseguire lo screening di cristallizzazione, utilizzare il metodo di diffusione del vapore a goccia seduta a 295 Kelvin, con diversi kit di cristallizzazione, e un sistema automatizzato di movimentazione dei liquidi in formato 96-well. Al termine dell'impostazione di caduta, sigillare la piastra di cristallizzazione a 96 pozzi per prevenire l'evaporazione e consentire l'equilibrazione della goccia proteica all'interno del tampone del serbatoio.Posizionare le piastre in un incubatore di cristallo a 18 gradi Celsius. Controllare periodicamente le piastre al microscopio luminoso per monitorare la formazione e la crescita del cristallo. Per differenziare i cristalli proteici dai cristalli di sale, aggiungere un microlitro di colorante cristallino proteico alla goccia bersaglio e osservare i cristalli al microscopio dopo un'ora.I cristalli proteici appariranno blu. Per ottimizzare ulteriormente i cristalli, utilizzare le condizioni di cristallizzazione positiva e il metodo di diffusione del vapore goccia appeso in piastre a 24 pozzi, seguito dall'incubazione nell'incubatore di cristalli a 18 gradi Celsius. Per determinare la struttura proteica, montare i cristalli su un criopo al microscopio leggero per il raffreddamento flash in azoto liquido e posizionare i cristalli in un unibuck per lo stoccaggio e il trasporto.Pre-schermare i cristalli in un diffrattore a raggi X interno, utilizzando la funzione di centraggio manuale per montare e centrare i cristalli. Quindi, utilizzare il software di diffrazione a raggi X per raccogliere i dati. Per indicizzare, integrare e ridimensionare il set di dati utilizzando la suite HKL-2000, selezionare innanzitutto il rilevatore e caricare il set di dati.Quindi, eseguire la funzione di ricerca di picco per trovare i punti di diffrazione. Indicizza le macchie, seleziona il gruppo di spazio giusto ed esegui l'integrazione di picco. Quindi, ridimensionare il set di dati.Regolare il modello di errore e ridimensionare di nuovo. Salvare il file sca di output. Per determinare la struttura utilizzando la suite software Phenix, creare un nuovo progetto.In primo luogo, eseguire Extriage con il file sca per calcolare il possibile numero di copie di molecole proteiche nell'unità asimmetrica. Successivamente, per risolvere il problema di fase con la sostituzione molecolare, eseguire Phaser, utilizzando il file di dati di diffrazione, il file di struttura del modello con identità ad alta sequenza e somiglianza strutturale come proteina bersaglio, e il file di sequenza proteica, per trovare la soluzione. Eseguire la compilazione automatica in Phenix per generare il modello iniziale, utilizzando il file di output di Phaser e il file di sequenza dalla proteina di destinazione.Costruisci manualmente la struttura nella densità elettronica sperimentale modificata usando il COOT e affina usando Phenix affinare nei cicli iterativi. Convalidare il modello finale utilizzando gli strumenti di convalida in Phenix. In questo esperimento rappresentativo, la purificazione del dominio terminale finale della proteina del recettore della falena diamondback ryanodine, come dimostrato, ha prodotto una singola banda a circa 21 kilodalton dall'analisi STS-PAGE.Il volume di eluizione dalla colonna di filtrazione del gel ha confermato che il dominio terminale del recettore della ryanodina purificato è un monomero. Per la cristallizzazione, le condizioni più ottimali in cui sono stati formati cristalli a forma di piastra di alta qualità erano in presenza di 1 HEPES molare di un pH di 7 e 1,6 solfato di ammonio molare. La determinazione della struttura proteica dal set di dati di diffrazione utilizzando software come dimostrato ha rivelato il dominio terminale terminale del recettore della falena diamondback ryanodine che copre i residui da 1 a 205.Le proteine con grande disturbo, regioni flessibili o con affinità deboli sono difficili da cristallizzare. In questi scenari, le strategie di ingegneria proteica come la riduzione dell'entropia superficiale, il troncamento ad anello e il cross-linking, possono aumentare la probabilità di ottenere cristalli proteici migliori. Oltre a rivelare strutture proteiche ad alta risoluzione, la cristallografia a raggi X può anche essere utilizzata per studiare le interazioni proteina-pesticida, che potrebbero aiutare con la progettazione di pesticidi a base di struttura.

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