Name: Un modello di Mouse controllata per sepsi polimicrobica neonatale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 54 s
Description: Impara a preparare e iniettare sospensione cecale per studiare la sepsi polimicrobica neonatale nel topo. Questo metodo standardizzato consente di identificare i cuccioli moribondi con un approccio basato sui dati.

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Speciale a Claire Harrison e l'Animal Care Facility presso British Columbia bambini Hospital Research Institute (BCCHR) per il loro supporto nel lavoro animale, così come al Dr. Po-Yan Cheng per loro guida e ingresso monitoraggio degli animali e sul benessere.

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<li>Cuenca, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+emergency+myelopoiesis+following+polymicrobial+sepsis+in+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immunity%22%5BJournal%5D)">Delayed emergency myelopoiesis following polymicrobial sepsis in neonates.</a> Innate Immunity. 21 (4), 386-391 (2015).</li>
<li>Gentile, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+emergency+myelopoiesis+and+survival+in+neonatal+sepsis+by+caspase-1%2F11+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Improved emergency myelopoiesis and survival in neonatal sepsis by caspase-1/11 ablation.</a> Immunology. 145 (2), 300-311 (2015).</li>
<li>Wynn, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+IL-17A+attenuates+neonatal+sepsis+mortality+induced+by+IL-18%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Targeting IL-17A attenuates neonatal sepsis mortality induced by IL-18.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), E2627-E2635 (2016).</li>
<li>Fallon, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Program+Cell+Death+Receptor-1-Mediated+Invariant+Natural+Killer+T-Cell+Control+of+Peritoneal+Macrophage+Modulates+Survival+in+Neonatal+Sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Program Cell Death Receptor-1-Mediated Invariant Natural Killer T-Cell Control of Peritoneal Macrophage Modulates Survival in Neonatal Sepsis.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1469(2017).</li>
<li>Young, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+survival+after+induction+of+sepsis+by+cecal+slurry+in+PD-1+knockout+murine+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Improved survival after induction of sepsis by cecal slurry in PD-1 knockout murine neonates.</a> Surgery. 161 (5), 1387-1393 (2017).</li>
<li>Rincon, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjuvant+pretreatment+with+alum+protects+neonatal+mice+in+sepsis+through+myeloid+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Adjuvant pretreatment with alum protects neonatal mice in sepsis through myeloid cell activation.</a> Clinical & Experimental Immunology. 191 (3), 268-278 (2018).</li>
<li>Starr, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+cecal+slurry+preparation+protocol+with+improved+long-term+reproducibility+for+animal+models+of+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A new cecal slurry preparation protocol with improved long-term reproducibility for animal models of sepsis.</a> PLoS ONE. 9 (12), e115705(2014).</li>
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<li>Fujioka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+heme+oxygenase-1+attenuates+the+severity+of+sepsis+in+a+non-surgical+preterm+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22SHOCK%22%5BJournal%5D)">Induction of heme oxygenase-1 attenuates the severity of sepsis in a non-surgical preterm mouse model.</a> SHOCK. 47 (2), 242-250 (2017).</li>
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</ol>

Dr. James Wynn riceve supporto da National Institutes of Health (NIH) / National Istituto delle scienze mediche generali (R01GM128452) e il NIHEunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) ( R01HD089939).

Postnatali topi neonatali hanno molto limitato la mobilità e non riescono a se stessi a destra dopo essere stato messo sulla schiena, anche quando incontrastato. Da 7 DOL, l'età dei topi sfidati in questo modello, una gamma di movimento che spaziano dai diritti-Mobile a FTR-Mobile è stata osservata nei topi incontrastati, con una differenza importante, vale a dire che un mouse incontrastato a questa età non ha visualizzato il comportamento FTR-letargico. Sono stati osservati solo topi sfidati con sepsi polimicrobica diventare FTR-letargico; Pertanto, questa risposta può essere un indicatore della gravità della malattia. Essere attento per il taglio di un angolo di 90° dall'orizzontale per il movimento dell'anca consente l'assegnazione coerenza e preciso del movimento dell'anca letargico o mobile in topi. Il lasso di tempo di 4 s per vedere se un mouse può giusto per sé è stato selezionato perché incontrastati topi sono riusciti a destra costantemente se stessi entro questo lasso di tempo. Ripetuto la misura dello stesso mouse è stato evitato, mentre il tempo a destra se stessi e la misurazione della mobilità dell'anca è stata limitata a 4 s, per non affaticare eccessivamente il mouse, che altrimenti poteva influenzare la sua capacità di ottenere cibo e calore e poteva incidere sui suoi prognosi di stare meglio. Raddrizzamento sé da sinistra e destra sono stati osservati, e il più alto dei punteggi è stato utilizzato per determinare se il mouse è stato a un endpoint di tipo umano, perché alcuni topi sono stati trovati per visualizzare FTR-Nonmobile su un lato ancora hanno una maggiore mobilità da altro lato e b e in grado di recuperare alla fine.
Il sistema di punteggio utilizzato per valutare la salute del mouse invocata l'applicazione di tagli categorici a che cosa è una gamma di movimento e, di conseguenza, potrebbe essere soggetto a pregiudizi individuali. Il personale è stato addestrato insieme per garantire che ogni persona ha ottenuto i topi lo stesso; Tuttavia, probabilmente ci rimarrà un livello di soggettività che conduce alla variazione. La consistenza di punteggio è stata valutata avendo sette ricercatori che non avevano precedentemente effettuato il monitoraggio del mouse neonatale imparare i requisiti descritti in questo protocollo e video e, quindi, in modo indipendente assegnare comportamenti e determinare humane endpoint. Una precisione del 97% è stata osservata con il Punteggio effettuato su 60 topi sfidati, suggerendo che pregiudizi individuali non gioca un ruolo notevole nelle assegnazioni del comportamento di questo modello. Il protocollo di monitoraggio del comportamento presentato si basa su osservazioni di animali sfidati il DOL 7, ancora topi di età inferiore a 6 giorni in uno stato sano incontrastato costantemente non possono proprio essi stessi. Così, i criteri dell'endpoint umano descritto non potevano essere applicati direttamente ai più giovani topi. Se più giovani topi vengono utilizzati in questo modello sperimentale o se viene applicato un modello di sfida diversa con la cinetica di differenti di malattia, quindi i criteri dell'endpoint umano adatto devono essere sviluppati e pilotati per evitare l'eutanasia dei topi che sarebbe altrimenti, alla fine, recuperare. Il sistema di Punteggio Visualizza un metodo affidabile di migliorare la classificazione di endpoint umana che, con test e conferma, potenzialmente potrebbe essere applicato ad altri modelli.
Ogni preparazione di liquami cecal o l'uso di un nuovo ceppo del mouse necessaria la retitration della dose cecal liquami per amministrare per ottenere una simile dose letale. Ogni preparazione è stata standardizzata dalla lettura di interesse, vale a dire sopravvivenza, piuttosto che dare lo stesso conteggio batterico. Concentrazione batterica vitale di ogni preparazione liquami cecal variata leggermente, potenzialmente dovuto le differenze nei batteri commensali del donatore o a causa di variazioni del peso lasciato nel colino cella della postfiltration stock cecal liquami. Durante la titolazione del liquame cecal, le prime due cucciolate sono stati divisi in due gruppi e ogni metà della cucciolata sono stati sfidati con una delle due dosi, affinché ognuna delle dosi sarebbe stato testato in due cucciolate. Se il tasso di sopravvivenza risultante non corrisponde il livello richiesto, quindi la dose di sfida è stata aumentata o diminuita di 5-10% e l'esperimento ripetuto. Cucciolate multipli sono stati utilizzati per tenere conto delle differenze di cucciolata a cucciolata che potrebbero causare resistenza o aumentata suscettibilità alla sepsi attraverso una cucciolata. Era importante accuratamente titolo lo stock di liquami cecal con ogni nuova preparazione per garantire che la nuova titolazione del liquame cecal era paragonabile ai precedenti preparati cecal liquami. Periodi di rumore in eccesso e vibrazioni, in particolare durante la compattazione dell'asfalto e la costruzione di un edificio nelle vicinanze e la strada, sono stati osservati per aumentare lo sforzo nelle dighe. Questo correlato con i tassi aumentati di cannibalizzazione e colpite la mortalità degli esperimenti di sopravvivenza, anche che interessano topi incontrastati, indicando che ci può essere estranei impatti sulla sopravvivenza neonatale che anche bisogno di essere controllato per.
Metodi precedenti per preparazione impasti cecal liquami includevano l'impiego dei liquami cecal fresco o la preparazione di liquami cecal congelati, utilizzando una varietà di metodi, tra cui l'archiviazione in glicerolo che inevitabilmente verrebbero trasferito durante la sfida. Mentre l'impiego dei liquami cecal fresco fornisce il vantaggio di avere una composizione batterica più vicina ai contenuti cecali originali, c'è il rischio di varianza tra topi donatore individuale a causa della variazione di batteri commensali. Mentre questo è stato ridotto al minimo utilizzando cecali donatori dello stesso fornitore con un tempo minimo tra l'arrivo e la progressione dell'esperimento, questo potrebbe diventare un'opzione costo proibitivo per alcuni laboratori e ha presentato un'altra sfida logistica di temporizzazione nell'avere topi di pari età disponibili quando si inizia un impasto cecal esperimento in topi neonatali che erano vecchi di 7 giorni. È stato utilizzato un metodo alternativo all'utilizzo di liquami cecal fresco, dove contenuti cecal più adulto dei donatori sono stati riuniti, risospesi in D5W, congelati a-80 ° C senza glicerolo e scongelati un'aliquota a un tempo per gli esperimenti. L'utilizzazione dei liquami cecal donatori adulti studiare sepsis neonatale potenzialmente potrebbe trasferire la specie di batteri presenti nel liquame cecal che il mouse neonatale non è stato esposto a, ma è una strategia che consente lo studio di sepsis in topi neonatali e è stato utilizzato per studiare biologia del mouse neonatale nel passato13,14,15. Cecal liquami è stato diluito in D5W per fornire nutrimento per i batteri, che ha permesso l'istituzione di un'infezione attiva, una volta che i batteri sono stati iniettati ed è stato fatto per simulare la disponibilità di nutrienti nella cavità peritoneale durante necrotizzante enterocolite. Glicerolo non è stato incluso come un agente di stabilizzazione in batteri di congelamento a causa di potenziali effetti collaterali negativi che possono derivare da iniezione di glicerolo da solo. Se glicerolo era stato incluso nella preparazione cecal liquami, quindi i potenziali danni che glicerolo da solo potrebbe indurre avrebbe bisogno di essere testati per includendo una sola glicerolo (manca cecal liquami) iniezione in topi, che avrebbe aumentato mouse utilizzo. La vitalità di batteri delle scorte cecal liquami è stata testata dopo il congelamento lo stock di liquami cecal senza glicerolo ed è stata trovata per essere costante, con nessun cambiamento nella concentrazione di batteri in aliquote separate della stessa preparazione cecal liquami conservata a-80 ° C sopra un 6 periodo di mesi. Ciò suggerisce che il deposito senza glicerolo è fattibile nel fornire un coerenza risultato biologico. L'uso di una massa-preparato congelato stock cecal liquami anche permesso per l'uso di topi allevati in azienda, riducendo i costi e quindi utilizzando topi maschi che altrimenti sarebbero in eccesso da allevamento, riducendo gli sprechi del mouse.
L'identificazione delle sfide non riuscite in topi era importante evitare l'aggiunta di rumore supplementare al sistema. Dopo aver subito un'iniezione intraperitoneale di liquami cecal, i topi sono stati osservati per la presenza di un rigonfiamento sotto la pelle, che indicava un'iniezione fallito che era effettivamente sottocutaneo. Topi sono stati osservati per perdite al sito di iniezione, sia immediatamente dopo la rimozione dell'ago e dopo permettendo loro di fare un passo dopo l'iniezione, perché topi sarebbero a volte (raramente) una perdita solo dopo aver spostato la parte del sito di iniezione con un passo. La presenza di un rigonfiamento o perdita che segue l'iniezione ha provocato la rimozione del mouse dall'analisi. Dopo tutto, uno di questi potrebbe provocare un risultato diverso a causa della non corretta quantità di liquami cecal iniettato come una differenza di 5% in dose challenge è stata osservata per influenzare la sopravvivenza successiva.
Sfida di liquami cecal esperimenti spesso necessarie dosi letali di destinazione diverse con diverse dosi di peso-regolato. A causa di questo, i volumi di iniezione possono variare da appena 20 µ l e fino a 100 µ l. Errore sperimentale proporzionata associato con ago morto volume cambia anche con il volume di iniezione, aumentando la difficoltà per confrontare direttamente le dosi differenti. Con la semplice modifica di uniformare il volume di iniezione, questa fonte di varianza è rimosso dall'esperimento.
Sistema di monitoraggio del comportamento del mouse neonatale, utilizzata nel presente protocollo è il primo del suo genere. Intento di ricercatori per le ricerche etiche con topi neonati devono spesso affrontare l'impegnativa mancanza di risorse per valutare il benessere dell'animale a questa età. Il sistema di monitoraggio presentato intuitivo e coerenza comincia a colmare questa lacuna di conoscenza. D'importanza, questo approccio basato su prove non solo aumenta la qualità dei dati sperimentali ottenuti ma, allo stesso tempo, riduce anche la sofferenza degli animali da esperimento.

La sepsi è delle principali cause di decessi infettiva neonato umano1. Perché neonato sepsi sono capita male, scarsi progressi compiuti in entrambi l'identificazione dei neonati a rischio presto durante la malattia e lo sviluppo di trattamenti efficaci o profilassi. Ciò richiede l'uso di modelli animali di sepsi per comprendere meglio i processo e test possibili interventi. Inoltre, roditori adulti rispondono in modo diverso alla sepsi, con differenze statisticamente significative nel numero di batteri per amministrare per ottenere la stessa dose mortale (LD) e le differenze nella risposta dell'ospite risultante rispetto ai neonati2. Così, sepsi neonatale deve essere studiato in neonati. Diversi modelli di adulto sepsi sono stati utilizzati nella ricerca di sepsi. Questi includono una sfida endovenosa con specifici organismi implicati nella sepsi umano adulto o legatura e puntura cecal (CLP). CLP è un modello di endogeno sfida dove l'intestino cieco è chirurgicamente isolato, legato e forato per permettere la fuoriuscita del contenuto intestinale nel peritoneo, portando infine alla diffusione sistemica dei microbi e dei loro prodotti3. Tuttavia, la procedura chirurgica necessaria per stabilire CLP è letale per gli animali appena nati; Pertanto, un metodo alternativo è necessario di imitare la sfida polimicrobica della CLP per indurre sepsi neonatale. Il modello cecal liquami per sepsi polimicrobica neonatale è stato sviluppato per soddisfare questa esigenza, per cui il contenuto cecale di animali è raccolte, sospesa in sterile di destrosio 5% in acqua (D5W) e iniettato intraperitonealmente in topi neonati2. Questo è, dal momento che, diventata un modello sempre più popolare per lo studio di sepsi negli animali sia neonati e adulti e sostanzialmente ha avanzato intuizioni meccanicistiche della malattia processo4,5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15.
Dato il crescente utilizzo di questo modello e desiderio di ricercatori di confrontare direttamente i risultati in pubblicazioni, c'è una necessità per gli aspetti tecnici di essere ben descritti e standardizzati attraverso gli studi. Standardizzazione si applica a tre aspetti del modello, vale a dire, i) la preparazione del brodo cecal liquami, ii) la preparazione delle aliquote sfida per iniezione in animali da esperimento e iii) la definizione dell'endpoint umano per cui gli animali sono da considerarsi giormi negli esperimenti di sfida. In particolare, metodi per preparare il brodo di liquami cecal spesso viene fatto riferimento all'articolo originale introducendo il modello2. Un breve riassunto di quel modello è che contenuto cecale da topi adulti era raccolte, sospesa in D5W sterile ad una concentrazione di 80 mg/mL e utilizzato all'interno di 2 h per iniettare gli animali sperimentali. Questo modello originale usato i topi della stessa età, dalla stessa posizione di venditore, che sono stati alloggiati nelle proprie strutture di ricerca rispettivi per meno di 2 settimane prima della raccolta contenuto cecale. L'uso di topi cresciuti in casa, anche se riducendo il costo da fornitore regolare consegna e consentendo l'uso di topi in eccesso di una più vasta gamma di età e sesso, anche sostanzialmente aumentato donatore a donatore variabilità. Questo ha motivato lo sviluppo di una tecnica alternativa, per cui contenuto cecale da topi multipli sono stati riuniti insieme per preparare un grande magazzino, che era poi aliquotati e conservati a-80 ° C13. Questo metodo alternativo è stato adattato da più gruppi14,15. Tuttavia, tale adeguamento ha provocato alcune varianti tecniche, sia il supporto di memorizzazione utilizzato (10% o 15% glicerolo, o D5W da solo) e nella strategia di filtrazione per rimuovere il particolato (filtraggio multistadio attraverso un 860 µm e, quindi, un 190 µm filtro o individuo filtrazioni attraverso 100 µm o 70 µm filtri)13,14,15. L'iniezione di glicerolo da solo potrebbe potenzialmente causare danni, dato che le iniezioni di glicerolo di 25% - 50% sono state usate come un modello del roditore di lesione renale16,17,18,19, 20. Per evitare effetti collaterali indesiderati di glicerolo, la preparazione di impasti cecal liquami per topi in questo studio è congelata nel D5W senza glicerolo, e vengono eseguiti test di vitalità batterica da conservazione a-80 ° C. La strategia di filtrazione utilizzata in questo studio è un passaggio attraverso un filtro 70 µm, che direttamente non è stato paragonato ad altre strategie di filtrazione elencate.
Dosi letali di peso-regolato di liquami cecal iniettata possono variare da struttura a struttura e devono essere titolate fuori per la letalità desiderata per i singoli gruppi. Con le dosi differenti di sfida, i volumi di sfida accompagnamento cambiare dalla necessità. Tuttavia, questo dettaglio metodologico non è stato segnalato prima. Inoltre, strategie per le procedure standard, come ad esempio l'iniezione intraperitoneale, raramente sono elaborate all'interno della letteratura, ma tecniche individuali possono influenzare se topi neonati una perdita quando iniettato e loro risultati finali l'impatto.
Benessere degli animali, tra cui una definizione di endpoint umano, è un aspetto centrale di questo modello e in qualsiasi modello di infezione e infiammazione in roditori21. Nel 1998, il Consiglio canadese su cura (CCAC) ha pubblicato linee guida estese per selezione umana degli endpoint, definendo l'endpoint umano come "qualsiasi effettivo o potenziale dolore, angoscia o disagio dovrebbe essere ridotta a icona o alleviato scegliendo il più in anticipo endpoint che è compatibile con gli obiettivi scientifici della ricerca"22. Altri anche attenzione che deve essere stabilito humane endpoint basati sulla giustificazione scientifica, piuttosto che su un'interpretazione soggettiva dell'animale stato solo21. Mentre c'è una ricchezza di risorse per cliniche, comportamentali e ai criteri basati a segno corpo-condizione per endpoint umano, anche nel contesto dell'infezione e l'infiammazione in particolare21,23,24, nessuno di questi , compresi gli orientamenti CCAC per endpoint humane22, menzionare topi neonati. Così, oggettivamente e scientificamente giustificato humane endpoint sono molto più difficili da stabilire per animali appena nati, dato le loro limitate capacità comportamentali sia la mancanza di prove da criteri, quali la perdita di peso, che è comunemente usato per l'adulto topi. Attualmente, i criteri per l'endpoint umano utilizzato per 5 - a 12-giorno-vecchio topo neonato nella letteratura cecal liquami tutti fanno riferimento al manoscritto originale che ha introdotto il modello2. In questa carta originale, la definizione di endpoint humane per animali neonati era basata su due criteri; vale a dire, la posizione del mouse di fuori del nido (scattering) e la mancanza di macchie di latte era stato visto a causare la morte entro ore. Una questione che complica nell'assegnazione di un endpoint di tipo umano è che latte macchie diventano difficili da vedere in diversi ceppi di topi con pelliccia scura, come ad esempio il ceppo C57BL/6J comunemente impiegato, dopo la prima settimana di vita, mentre gli animali malati vengono monitorati fino al 14 ° giorno di vita (DOL). Ulteriori, morti animali possono trovare postchallenge quando si applicano questi criteri (il proprietario di osservazione; inedito); così, una definizione più rigorosa di endpoint umano è necessaria per alleviare le sofferenze agli animali da esperimento ed evitare la mortalità in situazioni dove il risultato potrebbe essere accuratamente individuato in precedenza.
Tutti i tre aspetti metodologici del modello cecal liquami sono presentati in una procedura operativa standard dettagliare la preparazione dello stock cecal liquami, un metodo per l'iniezione di animali da esperimento che mantiene la costante di volume di iniezione tra le dosi e riduce il rischio di perdite e una definizione di endpoint humane per 7 - a-giorno-topi di 12 basato su un sistema di modellazione comportamentale. Informazioni comportamentali dei punteggi di salute del mouse da oltre 240 animali da esperimento è stato raccolto e raggruppati per risultato finale di sopravvivenza, dimostrando una definizione basata su prove dell'endpoint humane. La sofferenza degli animali da esperimento è ridotto identificando moribondi topi neonatali nel punto più in anticipo di tempo possibile, mentre i risultati biologicamente significativo di sopravvivenza possono dedurre osservando le variabili chiave. La rappresentazione visiva di preparazione cecal liquami e di comportamenti del mouse neonatale servirà come una risorsa eccellente per qualsiasi gruppo studiando sepsi o sfida neonato modello animali.

<table><tbody><tr><td>0,1 - 20 &mu; L puntali per pipette</td><td>VWR</td><td>732-0799</td><td></td></tr><tr><td>1,8 mL Provetta per microcentrifuga</td><td>Costar</td><td>3621</td><td></td></tr><tr><td>100 - 1000 &mu; L puntali per pipette</td><td>VWR</td><td>732-0801</td><td></td></tr><tr><td>1 - 200 &mu; L puntali per pipette</td><td>VWR</td><td>732-0800</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Provetta da centrifuga</td><td>FroggaBio</td><td>TB15-25</td><td></td></tr><tr><td>23G1 aghi</td><td>Becton Dickinson</td><td>305145</td><td>solo l'ago, non la siringa, utilizzata per fissare il topo al polistirolo</td></tr><tr><td>28G 0,5 mL Siringa da insulina</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Fiala criogenica</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Provetta da centrifuga</td><td>Fisher scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>5 mL pipetta</td><td>Costar</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>6 - 10 settimane C57BL/6J topi adulti</td><td>Jackson Laboratories</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>7 + giorno C57BL/6J topi neonatali</td><td>Allevati in casa</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m Filtro cellulare</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Sangue di pecora defibrinato</td><td>Dalynn</td><td>HS30-500</td><td></td></tr><tr><td>Destrosio 5% Acqua (D5W)</td><td>Baxter</td><td>JB0080</td><td></td></tr><tr><td>Pinze da dissezione</td><td>VWR</td><td> 82027-386</td><td></td></tr><tr><td>Forbici da dissezione, punta affilata</td><td>VWR</td><td>&nbsp; 82027-592</td><td></td></tr><tr><td>Forbici da dissezione, punta affilata/smussata</td><td>VWR</td><td>82027-594</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo (HistoPrep 95% alcol etilico denaturato)</td><td>Fisherbrand</td><td>HC11001GL</td><td>diluito al 70% con acqua distillata doppia</td></tr><tr><td>Pennarello a prova di etanolo; Marcatore da laboratorio</td><td>VWR</td><td>52877-310</td><td></td></tr><tr><td>EZ Anestesia Vaporizzatore EZ</td><td>Anesthesia</td><td>EZ-155</td><td></td></tr><tr><td>Germinator 500, Sterilizzare a secco lo strumento chirurgico (Sterilizzatore a perline calde)</td><td>Braintree Scientific</td><td>GER 5287-120V</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Fresenius Kabi</td><td>CP0406V2</td><td></td></tr><tr><td>Micro Spatola</td><td>Chemglass</td><td>CG-1983-12</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta-Aid</td><td>Drummond</td><td>4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta Rainin Classic PR-1000</td><td>Rainin</td><td>17008653</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta Rainin Classic PR-20</td><td>Rainin</td><td>17008650</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta Rainin Classic PR-200</td><td>Rainin</td><td>17008652</td><td></td></tr><tr><td>scala</td><td>Sartorius</td><td>BL 150 S</td><td></td></tr><tr><td>Pinza per campioni</td><td>VWR</td><td>82027-440 / 82027-442</td><td></td></tr><tr><td>Flacone quadrato da 1000 ml</td><td>Corning</td><td>431433</td><td></td></tr><tr><td>Pannello di polistirolo</td><td>Qualsiasi</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Camera di eutanasia per topi/ratti Sure-Seal</td><td>Euthanex</td><td>EZ-178</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Soy Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22091-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>VX-200 Lab Vortex Mixer</td><td>Labnet International</td><td>S0200</td><td></td></tr><tr><td>pesare carta</td><td>Fisherbrand</td><td>09-898-12B</td><td></td></tr></tbody></table>

un modello di mouse controllata per sepsi polimicrobica neonatale

A Controlled Mouse Model for Neonatal Polymicrobial Sepsis

Sepsis neonatale rimane un onere globale. È necessario un modello preclinico di interventi profilattici o terapeutici efficaci dello schermo. La sepsi polimicrobica neonatale del mouse può essere indotta iniettando cecal liquami intraperitonealmente nel giorno della vita 7 topi e loro monitoraggio per la settimana seguente. La procedura dettagliata necessaria per l'attuazione di questo modello di sepsi neonatale sono presentati qui. Questo include fare uno stock di liquame cecal omogeneo, diluirla per una dose di lettiera-regolato e di peso, una struttura del programma di monitoraggio e una definizione delle categorie di salute osservati utilizzato per definire gli endpoint humane. La generazione di uno stock di liquame cecal omogeneo da donatori pool permette l'amministrazione in molte cucciolate nel tempo, riducendo la variazione tra i donatori ed impedendo l'utilizzo di glicerolo potenzialmente tossico. La strategia di monitoraggio utilizzata consente l'anticipazione del risultato di sopravvivenza e l'identificazione dei topi che più tardi sarebbe progresso alla morte, consentendo un'identificazione precoce dell'endpoint humane. Due principali caratteristiche comportamentali vengono utilizzati per definire i punteggi di salute, vale a dire, la capacità dei topi neonatale a destra se stessi quando sono immessi sulla loro schiena e loro livello di mobilità. Questi criteri potenzialmente potrebbero essere applicati per indirizzare gli endpoint humane in altri studi della malattia neonatale nei topi, come uno studio pilota è effettuato per confermare la precisione. In conclusione, questo approccio fornisce un metodo standardizzato per il sepsis neonato modello nei topi, fornendo risorse per valutare il benessere degli animali utilizzati per definire endpoint precoce umano per animali sfidati.

Redditività di liquami cecal conservati a-80 ° C può essere testato nel tempo di diluizione in serie e di placcatura aliquote di stock di liquami cecal su agar soia triptico con sangue di montone al 5% seguita da 24 h di incubazione aerobica a 37 ° C. Successivo conteggio culturable contenuto formanti colonie unit (CFU) di una preparazione di liquami cecal è stato trovato non per cambiare nel corso di un periodo di 6 mesi, e la redditività non è stata colpita da una conservazione prolungata a-80 ° C (Figura 2). Ogni mouse donatore ha provocato, in media, abbastanza cecal liquami per sfidare tre o quattro cucciolate (dati non mostrati).
Topi sfidati a DOL 7 con liquami cecal per indurre la sepsi polimicrobica ha cominciato a raggiungere l'endpoint umano entro 12 h della sfida, e la sepsi polimicrobica principalmente è stato risolto da postchallenge di 48h, come osservato in una curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier combinato da dati di oltre 200 topi sfidati (Figura 1A). La letalità era dipenda dalla dose di sfida amministrato, con una variazione del 5% in dose challenge conseguente un circa 15% di differenza nel tasso di sopravvivenza (Figura 1B). Il peso del corpo del mouse è stato misurato a ogni visita di monitoraggio. Perdita di peso è stata veduta in tutti gli animali sfidati, essendo non discriminatorio tra topi che ha finito per sopravvivere e quelle che non ha fatto durante le prime 24 h postchallenge (Figura 1). Dopo 24 h, gli animali più sopravvissuti cominciarono a riconquistare il loro peso, mentre tutti i giormi ha continuato a perdere peso e si trasferì a loro endpoint humane. Tuttavia, una piccola percentuale di sopravvivenza di animali che avevano mantenuto il loro riflesso di raddrizzamento inoltre ha continuato a perdere peso o è riuscito a guadagnare peso, fino alla fine dell'esperimento, anche perdere tanto quanto il 20% del loro peso corporeo iniziale all'interno di 40 h della sfida. Come c'era una sovrapposizione di perdita di peso fra i topi che ha finito per sopravvivere e coloro che non hanno fatto, variazioni di peso o di una soglia di perdita di peso potrebbero non essere utilizzato come criterio per endpoint umana pur mantenendo l'obiettivo di dividere con precisione i sopravvissuti da giormi.
Il comportamento dei topi è stato monitorato come descritto nel protocollo e nella tabella 2. Istantanee della salute le categorie sono visualizzate (Figura 3A-C). Queste foto mostrano le categorie differenti di salute di topi che non hanno essi stessi a destra dopo essere stato messo sulla loro schiena e delineare la differenza tra FTR-Mobile e FTR-letargico, che è una distinzione importante. Topi sani incontrastati di questa età non visualizzano l'attività FTR-letargico; Pertanto, questa categoria di salute è un marcatore della malattia e una risposta alla sfida. Malato topi visualizzato sintomi FTR-letargico (Figura 3B) e potrebbero regredire verso FTR-Nonmobile (Figura 3), dove la parte superiore della gamba rimane parallelo con fondo gamba, con poca o zero anca a dondolo movimento, che è uno dei criteri per endpoint di umano. I topi potrebbero anche recuperare, aumentato movimento dell'anca, diventando FTR-Mobile (Figura 3A). Il riflesso di raddrizzamento e mobilità punteggi sono stati determinati per il sinistro e il lato destro di ogni mouse, e il punteggio più alto è stato utilizzato per determinare se il mouse aveva raggiunto un endpoint di tipo umano. Comportamentali sono stati raccolti da oltre 240 animali sfidati con una dose letale 60 (LD60) di liquami cecal e 144 humane endpoint sono stati osservati (Figura 3D-F e tabella 1). Questo approccio basato su prove è stato utilizzato per definire e perfezionare l'endpoint umano attraverso quattro fasi di malattia, classificati dagli sperimentatori basati su entrambi differenze di comportamento tra i sopravvissuti e sopravviventi e dalla frazione di endpoint umano raggiunto durante ogni periodo di tempo. Durante i primi esperimenti, topi FTR-Nonmobile che non avevano nessun movimento dell'anca costantemente sono stati trovati morti all'interno di 4-6 h di questo comportamento osservato. Nella raccolta delle informazioni presentate, un punteggio di salute FTR-Nonmobile è stato utilizzato come criterio per un endpoint di tipo umano. Da postchallenge h 12-21, mentre sono stati eutanasizzati topi FTR-Nonmobile, superstiti sia tale in animali visualizzati modelli comportamentali molto simili e non potevano essere distinti in qualsiasi altro modo (Figura 3D). Da postchallenge 21-48 h, la maggior parte della sopravvivenza di topi ha riguadagnato il loro riflesso di raddrizzamento, mentre erano meno dell'1% dei comportamenti FTR osservati in animali che avrebbero continuato a sopravvivere all'esperimento (Figura 3E). Così, i topi che non è riuscito a destra se stessi da entrambi i lati è diventato un ulteriore criterio per endpoint umana durante questo tempo. Tra 12 e 20 h postchallenge, 12,5% del numero totale di endpoint umano sono stati osservati, contro 80,5% tra 20 e 48 h e il 7% dopo 48 h (tabella 1). Una caratteristica distintiva fra i topi che ha finito per sopravvivere e che alla fine ha peggiorato per un endpoint di tipo umano è stata la perdita del riflesso di raddrizzamento, indipendente della mobilità dell'anca (Figura 3F). Infatti, tra 20 e 48 h dopo la sfida, un totale di 121 topi non era riuscito a se stessi proprio da entrambi i lati, con 116 di questi topi, eventualmente procedendo a un endpoint di tipo umano (che rappresenta una precisione del 96% nell'identificare i topi che non avrebbero recuperato). Oltre 48 h dopo la sfida, 11 topi sono stati osservati a fallire a destra se stessi da entrambi i lati e 10 di questi progredito a un endpoint umano (un 91% di precisione). Oltre 20 h dopo la sfida, il numero di topi che perso il riflesso di raddrizzamento per entrambi i lati predice il risultato finale con una precisione di più di 90%; Pertanto, questo è stato aggiunto ai criteri di endpoint umano, per individuare nonrecovering topi prima e ridurre del mouse sofferenza (tabella 1).
La frequenza che topi bisogno monitoraggio cambia nel tempo, a causa dei diversi tassi di postchallenge di morte ed è descritto nella tabella 1. Un mouse è stato considerato come suo endpoint humane in qualsiasi punto, se non era riuscito a giusto per sé e visualizzato il movimento dell'anca mobili su entrambi i lati, o se il mouse è stato trovato sparsi dal nido, è riuscito a giusto per sé e aveva letargico movimento dell'anca. Topi con una di queste condizioni non dovevano essere in grado di ricongiungersi con la lettiera e sono stati osservati come FTR-Nonmobile entro 4-6 h. a partire 20 h dopo la sfida, un nuovo endpoint umano è stato aggiunto perché le informazioni presentate dimostrano che il vasto maggioranza dei topi che FTR da entrambi i lati finisce per soccombere alla malattia.
Il video, tabelle e risorse presentate in questo manoscritto sono una risorsa di insegnamento efficace per l'assegnazione del comportamento corretto dei topi sfidati. Sette sperimentatori furono chiesto di guardare il video di formazione e leggere il protocollo e le tabelle prima di assegnare i comportamenti 60 animali sfidati. L'identificazione di assegnazione humane endpoint era accurata sia per FTR topi dai topi che sono stati in grado di se stessi a destra all'interno del lasso di tempo consentito (e distintivo FTR-Nonmobile topi da topi che visualizzati gli altri comportamenti (Figura 4A) Figura 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58574/58574fig1.jpg"> Figura 1 : Curva di sopravvivenza Kaplan-Meier, titolazione della dose di liquami cecal e variazione di peso dopo la sfida di liquami cecal. (A) risultato di sopravvivenza dei topi C57BL/6J neonatali sfidati con un'iniezione intraperitoneale cecal liquami a DOL 7. Da esperimenti indipendenti utilizzando sfida più dosi, che variano da 0,7 a 1,3 mg di cecal liquami per grammo di peso corporeo è state somministrate a questi topi sono stati combinati i dati per questa figura. (B) neonatale topi sfidati con 0.80-0,95 mg di cecal liquami per grammo di peso corporeo da una preparazione di liquami cecal visualizzare una relazione dose-dipendente tra la quantità di liquame cecal dato e la percentuale di sopravvivenza. (C) la percentuale di cambiamento nel peso rispetto al peso di sfida, con la linea tratteggiata che indica una perdita del 20% di peso dal momento della sfida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58574/58574fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58574/58574fig2.jpg"> Figura 2 : Concentrazione di CFU in magazzino di liquami cecal conservato a-80 ° C non cambia nel corso di un periodo di 6 mesi. L'effetto dell'età cecal liquami sulla concentrazione di CFU è stato testato utilizzando la regressione lineare. Ogni punto rappresenta un'aliquota della stessa preparazione cecal liquami, in serie diluito e placcato su un periodo di 6 mesi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58574/58574fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58574/58574fig3.jpg"> Figura 3 : Hip categorie di mobilità dei topi che non riescono a destra se stessi e dei comportamenti animali varie volte postchallenge. Topi che sono stati sfidati con sepsi, quando posizionato sulla schiena, mostrerà segni di morbosità che può essere misurata dal grado di movimento dell'anca. (A) A fallire a destra (FTR)-Mobile mouse Mostra il movimento dell'anca a dondolo della loro parte superiore della gamba superiore a angolo di 90 ° dalla posizione orizzontale. (B) An FTR-letargico mouse spettacoli anca movimento oscillante ma non superi angolo di 90 ° da orizzontale in qualsiasi momento durante la 4 s di monitoraggio. (C) alcuni FTR-Nonmobile topi estenderanno loro gamba, piegando il ginocchio, ma mostreranno molto poco (meno di angoli di 10 °) a zero anca a dondolo movimento e le gambe rimarranno parallelo a vicenda. (D) i comportamenti animali 12-21 h postchallenge Mostra che solo i comportamenti FTR-Nonmobile separano sopravvissuti da giormi. (E) dal 21 al postchallenge di 48h, solo 4 i 592 comportamenti osservati FTR (0,67%) appartengono ai superstiti, che permette il raddrizzamento riflesso per prevedere l'esito finale ed essere usato come un nuovo criterio per endpoint humane. Un postinfection di (F), di là di 48 h, 6 su 131 topi (4,55%) che avevano un riflesso di raddrizzamento sono diventata parte del gruppo FTR e sono stati sacrificati alla fine dell'esperimento, che giustificano un monitoraggio continuo durante tutto il corso di recupero. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58574/58574fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58574/58574fig4.jpg"> Figura 4 : Risorse didattiche inclusi nella classificazione accurata del comportamento di sperimentatori indipendenti. Gli sperimentatori addestrati guardando il video che accompagna questo protocollo categorizzati video di 60 topi neonatali in salute differenti gruppi. (A) la capacità di distinguere un umano endpoint è stato determinato e una media del 97% dei comportamenti con precisione è stata categorizzata come FTR-Nonmobile o non, mentre solo l'1% dei topi di FTR-Nonmobile sono stati identificati in maniera errata. Due per cento dei topi sono stati falsamente identificati come FTR-Nonmobile. (B) l'identificazione del secondo endpoint humane criterium di distinguere correttamente tra FTR topi o quelli che hanno la capacità di destra se stessi all'interno di 4 s di essere collocato sulla loro parte posteriore è stato assegnato correttamente nel 97% dei punteggi, mentre solo 0.96% dei topi sono stati assegnati in modo non corretto come essi stessi di raddrizzamento e 2% dei topi sono stati assegnati in modo non corretto come FTR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58574/58574fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Stadio di malattia</td>
			<td>R: alta morbosità, nessuna mortalità</td>
			<td>B: alta morbosità, mortalità bassa</td>
			<td>C: alta morbosità, mortalità alta</td>
			<td>D: bassa morbilità, mortalità di basso</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ore dopo la sfida</td>
			<td>0−12</td>
			<td>12−20</td>
			<td>20−48</td>
			<td>&gt; 48</td>
		</tr>
<tr>
<td>Frequenza di monitoraggio</td>
			<td>sfida di post 2 h</td>
			<td>ogni h 4−6</td>
			<td>Ogni 4−6 h, 8 h, incustodito durante la notte</td>
			<td>1 − 2 volte al giorno, più se necessario</td>
		</tr>
<tr>
<td>Proporzione di endpoint umano totale osservato</td>
			<td>0/144</td>
			<td>18/144</td>
			<td>116/144</td>
			<td>10/144</td>
		</tr>
<tr>
<td>Percentuale di endpoint humane osservato</td>
			<td>0%</td>
			<td>12,5%</td>
			<td>80,5%</td>
			<td>7%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Criteri dell'endpoint Humane</td>
			<td colspan="2">1. FTR−Nonmobile su entrambi i lati</td>
			<td colspan="2">1. FTR−Nonmobile su entrambi i lati</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">2. disperso dal nido ed è FTR−Lethargic</td>
			<td colspan="2">2. disperso dal nido ed è FTR−Lethargic</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">3. FTR su sia di sinistra o di destra (con qualsiasi Punteggio di mobilità)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: frequenza di monitoraggio e umano i criteri dell'endpoint nelle diverse fasi della malattia. Monitoraggio frequenza, ha osservato humane endpoint, la percentuale di endpoint umano e i criteri dell'endpoint umana nelle varie fasi della malattia.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Riflesso di raddrizzamento</td>
			<td>Mobilità</td>
			<td>Limite di tempo a destra dopo essere stato messo sul retro</td>
			<td>Limite di tempo per misura di quantità di movimento (mobile / letargico / mobili)</td>
			<td>Criteri di Punteggio di mobilità</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Diritti</td>
			<td>Mobile</td>
			<td rowspan="6">4 s</td>
			<td rowspan="3">Un ulteriore 8 s</td>
			<td>Il mouse richiede più passaggi di fila, mantenere lo slancio in avanti ed Esplora il suo ambiente. Pup non cadrà.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Letargico</td>
			<td>Il mouse può fare un passo ma verrà interrompere e sospendere prima di prendere un altro. Pup possono cadere.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nonmobile</td>
			<td>Il mouse non prendere provvedimenti dopo raddrizzamento sé. Pup possono cadere.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Non riuscire a destra</td>
			<td>Fianchi mobile</td>
			<td rowspan="3">Stesso 4 s usato per misurare il riflesso di raddrizzamento</td>
			<td>Ha energico movimento dell'anca con la parte superiore della gamba rotante oltre i 90° dall'orizzontale, almeno una volta all'interno di 4 s.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Letargici fianchi</td>
			<td>Movimento dell'anca fino a ma non oltre i 90° dalla posizione orizzontale.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fianchi mobili</td>
			<td>Membra può spostare di estensione e di ritiro, ma i fianchi non ruoterà. Pup sembra molto malato.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: monitoraggio tabella e criteri nel determinare il Punteggio di salute dei topi. I criteri forniti sono stati usati per definire gruppi di categorie di salute ai topi e per ridurre la varianza individuale nell'assegnazione di punteggi di salute.

Questo protocollo fornisce i passaggi necessari per stabilire e valutare il sepsis neonatale in 7 giorno-vecchi topi.

Un modello di Mouse controllata per sepsi polimicrobica neonatale

Neonatal sepsis remains a global burden. A preclinical model to screen effective prophylactic or therapeutic interventions is needed. Neonatal mouse ...

Il modello di liquame cecale per la sepsi polimicrobica è un potente strumento per sezionare una fisiopatologia neonatale unica. Può essere variabile e gli endpoint umani non sono ben descritti. Qui presentiamo la nostra procedura altamente standardizzata per preparare un liquame cecale e iniettare in animali da esperimento.Inoltre, utilizziamo un approccio basato sui dati per identificare i cuccioli moribondo al più presto possibile. Iniziamo preparando un calcio di liquame cecal congelato. Questo viene fatto raggruppando il concent cecal da almeno cinque topi adulti, sospendendo in acqua sterile di destrosio e immagazzinando a meno 80 per un uso successivo.Puoi usare maschi o femmine, ma il sesso, l'età e lo sfondo dei topi per i tuoi esperimenti dovrebbero essere mantenuti costanti. Per prima cosa, prepariamo i nostri strumenti per la dissezione. Questi includono un set di forbici e forcep per la pelle e un secondo set per gli organi interni.Accendere lo sterilizzatore di perline calde almeno 30 minuti prima dell'uso. Immergere gli utensili in etanolo al 70% e quindi immergerli nello sterilizzatore di perline calde per almeno un minuto. Spruzzare un tappetino di tovaglioli di carta con 70%etanolo, quindi rimuovere gli strumenti dallo sterilizzatore senza toccare la parte sterilizzata dello strumento alle maniglie non sterili di altri strumenti.Mettili sull'asciugamano di carta per rinfrescarli. Sezionare i topi in un armadietto di sicurezza biologico. Fissare le gambe del mouse a una tavola da polistirolo usando aghi calibro 23 in modo che il mouse sia addome.Spruzzare l'addome con il 70% di etanolo. Usando forcette e forbici sterili, tagliare la pelle, allentare la pelle dal rivestimento peritoneale con le forbici e tagliare una regione rettangolare dall'inguine allo sterno e dal lato sinistro a quello destro. Rimuovere la pelliccia intorno al peritoneo.Passare a un nuovo paio di strumenti sterili per tagliare il peritoneo, rendendo anche un'apertura rettangolare. Identificare il cieco, che dovrebbe correre da sinistra a destra sul corpo. Interrompere il tessuto connettivo per identificare i rami del cieco dall'intestino e tagliare il cieco lontano dall'intestino.Posizionarlo su un foglio di carta di pesata sterilizzato. Utilizzando strumenti sterili, tagliare entrambe le estremità del cieco. Tenere il centro del cieco con le forcelle e utilizzare una spatola metallica piatta per spingere delicatamente il contenuto di cecal fuori dalle estremità usando un movimento di rotolamento.Raccogliere il contenuto e posizionarlo in un tubo di centrifuga pre-pesato da 15 millilitri. Mettere in comune il contenuto di un massimo di cinque topi nello stesso tubo. Pesare nuovamente il tubo una volta aggiunto tutto il contenuto.Per calcolare il volume di acqua di destrosio da aggiungere al contenuto cecale in ogni tubo, dividere il peso del contenuto cecale nel tubo per la concentrazione desiderata in milligrammi per millilitro. Mantenere un'aliquota di acqua di destrosio sul ghiaccio per la riaspensione del contenuto cecale. Aggiungere la quantità richiesta di acqua di destrosio al tubo di centrifuga da 15 millilitri contenente contenuto cecale.Vortice il tubo verticalmente e orizzontalmente per circa 30 secondi. Osservare la presenza di particolato di circa pochi millimetri di diametro e, se presente, continuare a vortice fino a quando tutto il particolato è stato visibilmente scomparso. Posizionare un tubo di centrifuga da 50 millilitri sul ghiaccio per raccogliere il filtrato e installare un filtro cellulare sterile da 70 micrometri sopra la parte superiore.Pipetta quattro millilitri di liquami ri-sospesi da un tubo da 15 millilitri sopra il filtro cellulare e nel tubo di raccolta. Sospendere di nuovo il particolato tubazione su e giù da due a tre volte. Estrudere delicatamente le bolle per aumentare la velocità di filtraggio mescolando il contenuto con la punta della pipetta fino a quando non c'è più liquido filtrato.Questo dovrebbe richiedere circa 30 secondi. Cambiare i filtri cellulari tra ogni tubo di liquame cecale, ma mettere in comune tutto il contenuto nello stesso tubo di raccolta da 50 millilitri. Se il tuo stock supera i 40 millilitri, vortice per 15 secondi e posiziona 20 millilitri in un nuovo tubo di centrifuga.Dividere i liquami in flaconcini criogenici di 500 aliquote microliter ciascuna. Vortice il liquame tra ogni tre fiale. Tieni il magazzino principale in fiale sul ghiaccio.Immagazzinando aliquote a meno 80, la colonia aerobica che forma concentrazione unitaria in una preparazione di liquami cecali non cambia per un periodo di sei mesi. Ora che il liquame cecal è preparato, possiamo usarlo per sfidare una cucciolata di topi vecchi da sette a otto giorni con una dose regolata di peso di liquami cecali. La letalità del liquame dipende dalla dose.Dovrai determinare la dose letale desiderata nella tua struttura per ogni nuovo stock con una nuova titolazione della dose. Per cucciolata viene preparata un'aliquota di iniezione di liquami cecali. Normalizziamo l'inoculo a un volume di 100 microlitri, arrotondando ai 10 microlitri più vicini per ogni animale nella lettiera.La preparazione dell'aliquota di sfida richiede tre calcoli, il volume di scorte di liquami richiesto, il volume aggiuntivo di acqua di destrosio e il volume arrotondato per ogni cucciolo nella lettiera. I dettagli su come eseguire ogni calcolo sono disponibili nella sezione tre del protocollo. Eseguire questi calcoli a mano per ogni esperimento può richiedere molto tempo e contribuirà all'errore sperimentale, quindi è possibile scaricare un foglio di calcolo insieme al protocollo in cui si immette la concentrazione di magazzino, la dose desiderata e il peso della lettiera e la quantità di materiale liquame, il volume di acqua di destrosio e il volume effettivo per cucciolo viene restituito automaticamente.Puoi stampare questo foglio e portarlo con te quando sei pronto a sfidare i tuoi animali. Preparare l'aliquota di iniezione in un armadietto di sicurezza biologico e tenerlo sul ghiaccio. Prima di caricare la siringa, mescolare il tubo di microcentrifugo svolazzando 20 volte.I cuccioli sono sfidati con una siringa per insulina calibro 28. Prima di tagliare i liquami, mescolare l'aliquota ispirando ed espellendo da 300 a 500 microlitri dell'aliquota di sfida all'interno e all'uscita dal tubo di microcentrifugo. Quindi, redigere circa 150 microlitri della sfida aliquota.Questo dovrebbe essere più grande del volume di iniezione per un cucciolo di sette-otto giorni. Premere la siringa per spodestare le bolle dallo stantuffo e tirarsi leggermente indietro sulla siringa per espellere eventuali bolle d'aria. Non toccare l'ago o l'albero dello stantuffo durante questo processo.Erogare il liquame cecal in eccesso nel tubo di microcentrifugo fino a quando la quantità calcolata di liquami cecali per il topo viene caricata nella siringa. I liquami cecali vengono somministrati con un'iniezione intraperitoneale. Esegui questo secondo il protocollo presso il tuo istituto di cura degli animali.Per ridurre al minimo le perdite, inclinare il cucciolo verso il basso e inserire l'ago tra la gamba e i genitali, mantenendo l'ago poco profondo e sottocutaneo. Dopo aver inserito l'ago di circa un centimetro, premere verso il basso e in avanti fino a sentire l'ago forare il peritoneo, quindi deprimere lentamente lo stantuffo. Ritira con cura l'ago seguendo lo stesso percorso in cui sei entrato, rilassando il dito medio mentre lo fai.Prendere nota di eventuali perdite nel notebook da laboratorio e prendere in considerazione l'omissione di animali con perdite sostanziali dal risultato finale. In questa sezione illustreremo i diversi livelli di salute che osserviamo nei topi sfidati con sepsi polimicrobica e il loro corrispondente endpoint umano. Per qualsiasi operazione che coinvolga topi neonatale, trasferiamo il materiale della biancheria da letto in una nuova gabbia.Questo trasferisce l'odore della dama sui guanti e riduce lo stress sulla dama dall'ingresso ripetuto nella sua gabbia. Facciamo un secondo nido nella nuova gabbia per tenere i cuccioli monitorati fino alla fine della procedura o monitoraggio quando l'intera lettiera è pronta per essere restituita alla gabbia della dama. Posizionare un mouse sulla schiena e monitorare la possibilità di destra entro quattro secondi.Se è in grado di farlo, attendere altri otto secondi per determinare il livello di mobilità. Un mouse non contestato o in recupero è più spesso in grado di destra ed esplorare il proprio ambiente facendo più passaggi di seguito. Raggruppa i topi che sono in grado di raddrizzare se stessi e fare alcuni passi per esplorare il suo ambiente come letargico dei diritti.Questi topi possono cadere mentre prendono un passo e sembrano traballanti sui loro piedi. Un mouse che non è in grado di destra e ha un movimento dell'anca che supera i 90 gradi dall'orizzontale, ci raggruppamo come non riescono a destra-mobile. Questo mouse alla fine avrà ragione, ma non può entro quattro secondi.A causa dei suoi movimenti dell'anca, è raggruppato come non riescono a destra-mobile. I cuccioli che non sono stati in grado di destra e hanno un movimento dell'anca inferiore a 90 gradi dall'orizzontale sono raggruppati come non dannosi per il letargico destro. Questo è un altro esempio di un topo i cui fianchi non superano i 90 gradi dall'orizzontale ed è raggruppato come non titolo di letargico destro.Un cucciolo nonmobile destro avrà gambe che possono scuotere o vibrare ma non hanno movimento dell'anca. Gli arti possono estendersi e ritrarsi ma non avranno movimento laterale. Il cucciolo è visibilmente malato e ha raggiunto l'endpoint umano.Questo è un altro esempio di un cucciolo non in grado di destra-nonmobile. I suoi fianchi non tremano da sinistra a destra, ma le sue zampe vibrano. Quando si maneggia la gabbia della dama, i cuccioli possono essere trascinati fuori dal nido se la dama infermieristica corre.Li sostituiamo e poi controlliamo la presenza di altri cuccioli sparsi che sono lontani dai loro compagni di nido. Se quei cuccioli sparsi non riescono a letargici a destra, sono a un punto finale umano. Ecco una curva di sopravvivenza Kaplan-Meier del nostro modello di sepsi.I punti di tempo di monitoraggio sono disponibili nella SOP allegata. In qualsiasi punto lungo la curva di sopravvivenza se si trova che un topo non riesce a destra-nonmobile, è al suo endpoint umano ed eutanasiato. Tra le 12 e le 21 ore dopo la sfida, i topi appariranno malati e circa la metà dei topi sarà in grado di destra da un lato, mentre l'altra metà non riesce a destra su uno dei loro lati.Questo è il periodo di tempo in cui i topi inizieranno a divagare nel punteggio di salute e raggiungere l'endpoint umano di non riuscire a destra-nonmobile. Questi sono risultati rappresentativi dei punteggi di salute osservati in questo lasso di tempo. I gruppi di superstiti e non sopravvissuti non possono essere differenziati a questo punto in base ai loro punteggi di salute.In questa fase della malattia, da 21 a 48 ore dopo la sfida, osserviamo la più alta percentuale di endpoint umani. Abbiamo anche osservato che la stragrande maggioranza dei topi che non sono in grado di destra da entrambe le parti non finirà per riprendersi dalla malattia, che diventa quindi un nuovo criterio per l'endpoint umano oltre ai criteri di non esito destro-non mobili. I punteggi di salute osservati durante questa fase della malattia hanno portato alla separazione dei sopravvissuti dai non sopravvissuti.La stragrande maggioranza dei topi che non erano in grado di destra da entrambe le parti non si sono ripresi dalle malattie. Questi dati supportano che un nuovo criterio per l'endpoint umano a partire da 21 ore dopo la sfida dovrebbe essere quello di eutanasia di tutti i topi che non riescono a destra su entrambi i lati. Oltre 48 ore dopo la sfida molti topi inizieranno a mostrare più attività e un riflesso di giusticamento migliore.Anche se la proporzione di endpoint umani è inferiore in questo periodo, i topi possono ancora divagare e diventare più bassi, e richiedono comunque il monitoraggio per endpoint umani. Durante questo periodo di tempo, alcuni di quei topi che alla fine sono stati raggruppati come non sopravvissuti avevano mostrato un aumento dell'attività ad un certo punto, ma in seguito hanno fatto peggio e hanno raggiunto un endpoint umano. Ciò richiede un monitoraggio continuo degli animali malati con maggiore frequenza se iniziano a mostrare risultati sanitari peggiori.Gli sperimentatori indipendenti che non hanno ricevuto una formazione di persona e che osservano solo questo video didattico sono stati testati nella loro capacità di assegnare lo stesso punteggio degli investigatori utilizzando video di test registrati. Questo video didattico si traduce in una classificazione comportamentale accurata. La capacità di assegnare il punteggio corretto per non riuscire ai topi neonatali destro-non mobili, che è una misura dell'endpoint umano, è stata determinata su 60 topi neonatali e una media del 97% dei comportamenti è stata accuratamente distinta, con solo il 3% che è stato erroneamente identificato.Successivamente, è stata testata la capacità di differenziare i topi neonatali che non avevano ragione o che erano in grado di farlo entro quattro secondi. Questa è un'altra misura dell'endpoint umano ed è stata accuratamente assegnata nel 97% dei topi neonatale, mentre il 3% dei cuccioli è stato erroneamente assegnato come a destra. Ecco i risultati rappresentativi per il cambiamento di peso percentuale dei topi rispetto al loro momento di sfida.Il cambiamento medio di peso tra sopravvissuti e non sopravvissuti ha iniziato a separarsi a 24 ore dopo la sfida, ma c'è molta sovrapposizione tra i gruppi. Ci sono stati alcuni sopravvissuti che hanno perso oltre il 20% di peso ma si sono ancora ripresi dalla malattia. Il cambiamento di peso non è stato così efficiente nel prevedere i risultati rispetto alle differenze nei punteggi di salute, motivo per cui non viene utilizzato come criterio per determinare se i topi si trovano in un endpoint umano.Per concludere, ora dovresti essere in grado di preparare uno stock di liquami cecali congelati, calcolare la dose regolata per il peso. E iniettare e monitorare i topi appena nati alla ricerca di endpoint umani. Speriamo che questa sia una risorsa preziosa per la tua ricerca sul mouse.

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Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

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Qui, una procedura è descritta per la creazione di infezione sistemica nel ratto neonatale con colture di Escherichia coli K1. Questa procedura non invasiva consente colonizzazione del tratto gastrointestinale, traslocazione del patogeno alla circolazione sistemica, e l'invasione del sistema nervoso centrale al plesso coroide.

Non invasiva Modello di neuropatogeno Escherichia coli L'infezione neonatale nel ratto

Questo articolo descrive un metodo per generare una lesione da compressione del midollo spinale (SCI) riproducibile nel topo neonatale. Il modello fornisce una piattaforma vantaggiosa per lo studio dei meccanismi di plasticità adattativa che sono alla base del recupero funzionale spontaneo.

Un neonatale mouse Spinal Cord Injury compressione Modello

Questo studio dettaglia il processo di quantità precisa di gavaging di probiotici per topi neonatali. Il set-up sperimentale è stato ottimizzato per includere ma non è limitato ai probiotici di dosaggio, metodi di somministrazione e la quantificazione dei batteri nell'intestino.

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Abbiamo sviluppato un modello di corioamionite per simulare l'esposizione fetale all'infiammazione materna (FEMI) senza complicazioni di organismi vivi per esaminare gli effetti del FEMI sullo sviluppo del tratto intestinale della prole. Ciò consente lo studio delle cause meccaniche per lo sviluppo di lesioni intestinali a seguito della corioamionite.

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Impara a preparare e iniettare sospensione cecale per studiare la sepsi polimicrobica neonatale nel topo. Questo metodo standardizzato consente di identificare i cuccioli moribondi con un approccio basato sui dati.

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