Name: Cattura e identificazione delle proteine RNA-leganti utilizzando clic chimica-assistita RNA-Interactoma (Castaldi) strategia di acquisizione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Scopri la strategia CARIC per catturare e identificare proteine leganti RNA in cellule HeLa. Questo metodo avanzato consente di studiare le interazioni RNA-proteina e la regolazione post-trascrizionale.

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Questo lavoro è supportato dalla National Natural Science Foundation di Cina sovvenzioni 91753206, 21425204 e 21521003 e di National Key Research and Development Project 2016YFA0501500.

<ol><li>Djebali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+of+transcription+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Landscape of transcription in human cells.</a> Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).</li>
<li>Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+census+of+human+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">A census of human RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).</li>
<li>Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+in+Mendelian+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins in Mendelian disease.</a> Trends in Genetics. 29 (5), 318-327 (2013).</li>
<li>Nussbacher, J. K., Batra, R., Lagier-Tourenne, C., Yeo, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+in+neurodegeneration%3A+Seq+and+you+shall+receive%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins in neurodegeneration: Seq and you shall receive.</a> Trends in Neuroscience. 38 (4), 226-236 (2015).</li>
<li>Jazurek, M., Ciesiolka, A., Starega-Roslan, J., Bilinska, K., Krzyzosiak, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+proteins+that+bind+to+specific+RNAs+-+focus+on+simple+repeat+expansion+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Identifying proteins that bind to specific RNAs - focus on simple repeat expansion diseases.</a> Nucleic Acids Research. 44 (19), 9050-9070 (2016).</li>
<li>Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brave+new+world+of+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A brave new world of RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 327-341 (2018).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).</li>
<li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Molecular Cell. 46 (5), 674-690 (2012).</li>
<li>Beckmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+proteomes+from+yeast+to+man+harbour+conserved+enigmRBPs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs.</a> Nature Communications. 6, 10127-10135 (2015).</li>
<li>Conrad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+interactome+capture+of+the+human+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Serial interactome capture of the human cell nucleus.</a> Nature Communications. 7, 11212-11222 (2016).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+identification+of+RNA-binding+domains+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive identification of RNA-binding domains in human cells.</a> Molecular Cell. 63 (4), 696-710 (2016).</li>
<li>Kwon, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+repertoire+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 20 (9), 1122-1130 (2013).</li>
<li>Liepelt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+RNA-binding+proteins+in+macrophages+by+interactome+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of RNA-binding proteins in macrophages by interactome capture.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 15 (8), 2699-2714 (2016).</li>
<li>Liao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cardiomyocyte+RNA-binding+proteome%3A+Links+to+intermediary+metabolism+and+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The cardiomyocyte RNA-binding proteome: Links to intermediary metabolism and heart disease.</a> Cell Reports. 16 (5), 1456-1469 (2016).</li>
<li>Mitchell, S. F., Jain, S., She, M. P., Parker, R. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nsmb/journal/v20/n1/abs/nsmb.2468.html">Global analysis of yeast mRNPs.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 127-133 (2013).</li>
<li>Matia-González, A. M., Laing, E. E., Gerber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+mRNA-binding+proteomes+in+eukaryotic+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Conserved mRNA-binding proteomes in eukaryotic organisms.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 22 (12), 1027-1033 (2015).</li>
<li>Despic, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+RNA-protein+interactions+underlie+the+zebrafish+maternal-to-zygotic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Dynamic RNA-protein interactions underlie the zebrafish maternal-to-zygotic transition.</a> Genome Research. 27 (7), 1184-1194 (2017).</li>
<li>Wessels, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+of+the+early+fly+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome of the early fly embryo.</a> Genome Research. 26 (7), 1000-1009 (2016).</li>
<li>Sysoev, V. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+changes+of+the+RNA-bound+proteome+during+the+maternal-to-zygotic+transition+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Global changes of the RNA-bound proteome during the maternal-to-zygotic transition in Drosophila.</a> Nature Communications. 7, 12128(2016).</li>
<li>Reichel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+planta+determination+of+the+mRNA-binding+proteome+of+Arabidopsis+etiolated+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">In planta determination of the mRNA-binding proteome of Arabidopsis etiolated seedlings.</a> Plant Cell. 28 (10), 2435-2452 (2016).</li>
<li>Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+repertoire+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana.</a> Scientific Reports. 6, 29766-29778 (2016).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV+crosslinked+mRNA-binding+proteins+captured+from+leaf+mesophyll+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts.</a> Plant Methods. 12, 42-53 (2016).</li>
<li>Bunnik, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+of+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome of the human malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Genome Biology. 17, 147-164 (2016).</li>
<li>Lueong, S., Merce, C., Fischer, B., Hoheisel, J. D., Erben, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+regulatory+networks+in+Trypanosoma+brucei%3A+insights+into+the+role+of+the+mRNA-binding+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Gene expression regulatory networks in Trypanosoma brucei: insights into the role of the mRNA-binding proteome.</a> Molecular Microbiology. 100 (3), 457-471 (2016).</li>
<li>Nandan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+identification+of+mRNA-binding+proteins+of+Leishmania+donovani+by+interactome+capture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comprehensive identification of mRNA-binding proteins of Leishmania donovani by interactome capture.</a> PLoS ONE. 12 (1), e0170068(2017).</li>
<li>Jankowsky, E., Harris, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+nonspecificity+in+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).</li>
<li>Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+discovery+of+coding+and+noncoding+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide discovery of coding and noncoding RNA-binding proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (17), E3879-E3887 (2018).</li>
<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li>
<li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).</li>
<li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+micro-purification%2C+enrichment%2C+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), e47(2015).</li>
<li>Grammel, M., Hang, H., Conrad, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+reporters+for+monitoring+RNA+synthesis+and+poly%28A%29+tail+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Chemical reporters for monitoring RNA synthesis and poly(A) tail dynamics.</a> ChemBioChem. 13 (8), 1112-1115 (2012).</li>
<li>Curanovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+profiling+of+stimulus-induced+polyadenylation+in+cells+using+a+poly%28A%29+trap%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Global profiling of stimulus-induced polyadenylation in cells using a poly(A) trap.</a> Nature Chemical Biology. 9 (11), 671-673 (2013).</li>
<li>Zheng, Y. X., Beal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+evaluation+of+an+alkyne-modified+ATP+analog+for+enzymatic+incorporation+into+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Synthesis and evaluation of an alkyne-modified ATP analog for enzymatic incorporation into RNA.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (7), 1799-1802 (2016).</li>
<li>Nainar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+incorporation+of+azide+functionality+into+cellular+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Metabolic incorporation of azide functionality into cellular RNA.</a> ChemBioChem. 17 (22), 2149-2152 (2016).</li>
<li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+the+interactome+of+newly+transcribed+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Capturing the interactome of newly transcribed RNA.</a> Nature Methods. 15 (3), 213-220 (2018).</li>
<li>Holmqvist, E., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins in bacteria.</a> Nature Reviews Microbiology. , Published online (2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il mantenimento dell'integrità di RNA fiera è una delle chiavi del successo esperimenti CARIC. Con appropriati ligandi di Cu (i) e funzionamento attento, degradazione del RNA può essere significativamente ridotto, sebbene degradazione parziale è stata osservata. I rapporti di sostituzione dell'UE e 4SU in campioni sperimentali sono 1,18% e 0,46%, rispettivamente (dati non mostrati). Per RNA intatto con una lunghezza di 2.000 nt, ~ 90% di RNA contengono almeno un UE e uno 4SU. Per RNAs parzialmente degradato con una lungh...

Il genoma umano è trascritto in vari tipi di RNA codificanti e non codificanti (ncRNAs), tra cui mRNA, rRNA, tRNA, piccole molecole di RNA nucleare (snRNAs), piccole molecole di RNA nucleolare (snoRNAs) e lungo non-codificazione RNAs (lncRNAs)1. La maggior parte di questi RNA possiedono abbigliamento di RBPs e funzionare come ribonucleoproteina particelle (RNP)2. Pertanto, una completa identificazione di RBPs è un prerequisito per la comprensione della rete regolamentare tra RNAs e RBPs, che è implicata in varie malattie umane3,4,5.
Ultimi anni hanno testimoniato una grande spinta di RBPs scoperto in vari sistemi eucariotici2,6, compresi umano7,8,9,10,11, del mouse12,13,14, lievito9,15,16, zebrafish17, Drosophila melanogaster18,19 , Caenorhabditis elegans16, Arabidopsis thaliana20,21,22e parassiti umani23,24,25 . Questi progressi hanno stati facilitati da una strategia di acquisizione RBP sviluppata da Castello et al. 7 e Baltz et al. 8 nel 2012, che combina in vivo UV cross-linking di RNA e di proteine interagenti, oligo (distacco) acquisizione di poli (a) RNAs e spettrometria di massa (MS)-base di analisi proteomica. Tuttavia, dato il fatto che poli (a) principalmente esiste il mRNA maturo, che rappresentano solo ~ 3% - 5% del trascrittoma eucariotiche26, questa strategia ampiamente utilizzata non è in grado di catturare RBPs interagendo con non-poly(A) RNAs, tra cui la maggior parte dei ncRNAs e pre-mRNA.
Qui, segnaliamo le procedure dettagliate di una strategia sviluppata di recente per la cattura di tutto il trascrittoma di poli (a) sia non-poly(A) RBPs27. Definito CARIC, questa strategia combina in vivo UV cross-linking ed etichettatura metabolica di RNA con fuse e "cliccabili" analoghi nucleosidici (che contengono un gruppo funzionale di bioorthogonal che possono partecipare clicca reazione), 4 - thiouridine (4SU) e 5-ethynyluridine (UE). Passaggi chiave per ottenere risultati ideali con la strategia di CARIC sono efficienti etichettatura metabolica, reazione di cross-linking e fare clic su UV e il mantenimento dell'integrità di RNA. Perché cu (i) usato come catalizzatore nella reazione di clic può causare la frammentazione degli RNA, un ligando di Cu (i) che può ridurre la frammentazione di RNA è essenziale. Descriviamo come eseguire clic efficienti reazioni in lisati cellulari senza causare grave degradazione del RNA.
Anche se catturare RBP e identificazione in cellule HeLa è descritto solo in questo protocollo, la strategia di CARIC può essere applicata a vari tipi di cellule e possibilmente agli organismi viventi. Oltre alla cattura RBP, questo protocollo fornisce anche razionalizzato le procedure dettagliate per la preparazione del campione di MS e proteina identificazione e quantificazione, che può essere utile per coloro che non hanno familiarità con gli esperimenti di proteomica.

<table><tbody><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Siero fetale bovino)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina & Streptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>EU (5-etiniluridina)</td><td>Wuhu Huaren Co.</td><td>CAS: 69075-42-9</td><td></td></tr><tr><td>4SU (4-tiouridina)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>T4509</td><td></td></tr><tr><td>10 volte PBS (soluzione salina tamponata con fosfato)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>reticolante UV</td><td>UVP</td><td>CL-1000</td><td>Dotato di lampada UV da 365 nm</td></tr><tr><td>DEPC (pirocarbonato di dietile)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5758</td><td>Per trattare l'acqua. Altamente tossico!</td></tr><tr><td>Tris&middot; HCl, pH 7,5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>62476</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Biodee</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi senza EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88265</td><td>Una compressa per tampone di lisi da 50 mL.</td></tr><tr><td>LDS (Litio dodecil solfato)</td>Tubo per ultrafiltrazione <td>Sigma Aldrich</td><td>L9781</td><td></td></tr><tr><td>da 15 ml (cutoff 10 kDa)</td>Tubo per ultrafiltrazione <td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mL (cutoff 10 kDa)</td><td>Millipore</td><td>UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>Perle magnetiche di streptavidina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88816</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (Dimetilsolfossido)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>41639</td><td></td></tr><tr><td>Azide-biotina</td><td>Clicca Strumenti di Chimica</td><td>AZ104</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di Rame (II)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1297</td><td></td></tr><tr><td>THPTA [Tris (3-idrossipropiltriazolilmetil)ammina]</td><td>Sigma Aldrich</td><td>762342</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbato di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Azide-Cy5</td><td>Clicca Strumenti di Chimica</td><td>AZ118</td><td></td></tr><tr><td>Tampone campione LDS (4 volte)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>10% bis-Tris gel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0301BOX</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific AM9260G</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNasi A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R6513</td><td></td></tr><tr><td>SDS (Sodio dodecil solfato)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15525017</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Brij-97 [Poliossietilene (20) oleil etere]</td><td>J& K</td><td>315442</td><td></td></tr><tr><td>Trietanolammina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V900257</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina agarosio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20353</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Sarkosyl (N-Lauroilsarcosina sale sodico)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>61743</td><td></td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Desossicolato di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td></td><td></td><td>Versione: 1.5.5.1</td></tr></tbody></table>

cattura e identificazione delle proteine rna-leganti utilizzando clic chimica-assistita rna-interactoma (castaldi) strategia di acquisizione

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Una completa identificazione di RNA-binding proteins (RBPs) è la chiave per comprendere la rete di regolamentazione post-trascrizionale in cellule. Una strategia ampiamente utilizzata per la cattura RBP sfrutta la poliadenilazione [poli (a)] di RNA bersaglio, che si verifica principalmente su mRNA maturo eucariotico, lasciando la maggior parte delle proteine leganti di non-poly(A) RNA non identificato. Qui descriviamo le procedure dettagliate di un metodo recentemente segnalato chiamato click chimica-assistita RNA-Interactoma acquisire (CARIC), che consente di acquisire tutto il trascrittoma RBPs sia poli (a) e non-poly(A) combinando l'etichettatura metabolica del RNA, in vivo UV cross-linking e bioorthogonal tagging.

Vengono presentati i risultati rappresentativi dei passaggi di controllo di qualità. I risultati includono figure dell'analisi di fluorescenza in gel descritto al punto 2.3.2 (Figura 1), l'analisi di western blot descritto al punto 4.1.3 (Figura 2A) e l'analisi di macchiatura d'argento descritto al punto 4.2.2 (Figura 2B). La procedura di controllo di qualità è fondamentale per l'ottimizzazione dei p...

Un protocollo dettagliato per l'applicazione di cattura (CARIC) del RNA-Interactoma di chimica-assistita clicca strategia per identificare proteine leganti alla codificazione di entrambi e non codificanti RNA è presentato.

Cattura e identificazione delle proteine RNA-leganti utilizzando clic chimica-assistita RNA-Interactoma (Castaldi) strategia di acquisizione

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Questo metodo, CARIC, può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della post-trascrizione della ricreazione genica fornendo un censimento completo delle proteine leganti l'RNA. Il principale vantaggio del CARIC è la sua capacità di catturare proteine legate a vari tipi di RNA come mRNA e RNA non codificanti. Questo metodo può essere utilizzato in vari tipi e nell'organismo per studiare l'interazione della proteina RNA sul lavoro.In primo luogo, coltura cellule HeLa in DMEM integrato a 37 gradi Celsius in un'atmosfera di CO2 al cinque per cento. Quando le cellule raggiungono circa l'80% di confluenza, sostituire il mezzo di coltura su ogni piatto con 15 millilitri di mezzo fresco prebellito. Aggiungere 15 microlitri da 100 millimolari EU a ciascun piatto a una concentrazione finale di un millimolare.Per campioni sperimentali e senza controllo UV aggiungere 7,5 microlitri da 100 millimolari quattro SU ad ogni piatto. Coprire i piatti con un foglio e coltura delle cellule per 16 ore utilizzando le condizioni precedenti. Successivamente, aggiungere la metà della quantità precedente di UE e/o quattro SU alle piastre appropriate e continuare a coltivare per altre due ore.Per iniziare il cross-linking in vivo, rimuovere il mezzo di coltura e lavare ogni piatto tre volte con PBS utilizzando cinque millilitri di PBS per lavaggio. Rimuovere il PBS residuo il più possibile. Per il campione sperimentale e non quattro campioni di controllo SU, posizionare i piatti sul ghiaccio con il coperchio rimosso.Utilizzare un cross-linker UV per irradiare le cellule con luce UV a 365 nanometri e a due jules per centimetro al quadrato. Per i campioni senza controllo UV, posizionare i piatti sul ghiaccio e proteggerli dalla luce. Quindi, aggiungere un millilitro di tampone di prelisi a ogni piatto.Utilizzare un sollevatore di celle in gomma per raschiare le celle e raccogliere la sospensione di prelisi in un tubo da 15 millilitri. Aggiungere il tampone di prelisi a un tubo contenente la sospensione da due stoviglie regolando il volume totale a sei millilitri. Quindi aggiungere un volume uguale di buffer di lisi R.Passare il lysate cellulare attraverso una siringa con un ago stretto più volte fino a quando il lysate è chiaro e omogeneo. Incubare il lisato a quattro gradi Celsius con una rotazione delicata per un'ora. Dopo questo diluire il lisato in 20 volumi di tampone di diluizione e dividerlo in 15 frazioni di millilitro in 15 tubi di nontrafiltrazione millilitro, taglio molecolare di 10 kilodalton.Utilizzando un rotatore a secchio oscillante, ruotare i tubi a 4000 volte G e quattro gradi Celsius per circa 15 minuti fino a quando ogni frazione è concentrata in un volume inferiore a un millilitro. Aggiungere 14 millilitri di tampone di diluizione a ciascuna frazione di lysate concentrata e ripetere il processo di concentrazione. Quindi unire le frazioni e concentrarle in un volume di sei millilitri utilizzando il processo di concentrazione descritto in precedenza.Preparare innanzitutto il mix di reazioni come delineato nel protocollo di testo. Aggiungere questa miscela di reazione ai sei millilitri di lysate pre-sgombrato e mescolare bene. Aggiungere 162,5 microlitri di reagente riducente e mescolare bene.Incubare a temperatura ambiente su uno shaker orbitale a 800 giri/min per due ore. Dopo questo tempra la reazione aggiungendo cinque EDTA millimolare e incubando sullo shaker orbitale a temperatura ambiente per cinque minuti. Successivamente, dividere la miscela di reazione tra due tubi da 50 millilitri, ognuno contenente quattro volumi di metanolo preriffrato e incubare a -30 gradi Celsius per 30 minuti.Centrifuga a 4000 volte G e quattro gradi Celsius per 15 minuti. Scartare il supernatante e aggiungere tra uno e due millilitri di metanolo pre-refrigerato al pellet. Pipetta su e giù per rompere il pellet assicurandosi che il pellet finisca completamente sospeso senza pezzi visibili.Ripetere due volte il processo di centrifugazione e sospensione. Successivamente, estraggono con cura il metanolo residuo il più possibile assicurandosi di non disturbare il pellet. Aggiungere 10 millilitri di tampone di ricostituzione e pipetta su e giù per sciogliere il pellet.Centrifuga a 4000 volte G e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Quindi trasferire il supernatante su un nuovo tubo assicurandosi di raccogliere 20 microlitri del campione per il controllo qualità. Trasferire il campione ripulito e ricostituito nelle perle di agarosio streptavidina preparate.Incubare a quattro gradi Celsius con una rotazione delicata durante la notte. Fai girare le perline a 4000 volte G per cinque minuti. Trasferire il supernatante su un nuovo tubo assicurandosi di raccogliere 20 microlitri del campione per il controllo qualità.Lavare le perline con 10 millilitri di tampone di lavaggio A.Incubate con rotazione delicata a 12 giri/min e a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi girare giù le perline a 4000 volte G per cinque minuti. Rimuovere il supernatante e ripetere ancora una volta il processo di lavaggio e centrifugazione.Ripetere questo processo di lavaggio per il buffer di lavaggio B e il buffer di lavaggio C come indicato nel protocollo di testo. Dopo questo, lavare le perline con 10 millilitri di tricloruro di tris millimolare. Fai girare le perline a 4000 volte G per cinque minuti.Rimuovere il supernatante e dividere uniformemente le perline tra due tubi a microcentrifugo da 1,5. Per iniziare a eludere gli RRN catturati, aggiungere 400 microlitri di tampone di eluizione di biotina preparato a 400 microlitri di perline lavate e sistemate. Incubare su uno shaker orbitale a 1500 giri/min a temperatura ambiente per 20 minuti.Quindi incubare su uno shaker orbitale con un blocco di calore a 1500 giri/min e 65 gradi Celsius per 10 minuti. Centrifuga le perline a 7800 volte G per un minuto e raccogli l'RNP eluso. Aggiungere 400 microlitri di tampone fresco di eluizione della biotina alle perline.Ripetere il processo di incubazione e centrifugazione per raccogliere un secondo eluto e combinare i due eluiti in un unico tubo da 15 millilitri. Successivamente, aggiungere tre volumi di buffer di diluizione agli eluiti RNP combinati per ridurre la concentrazione di SDS. Utilizzando un tubo di ultra filtrazione da 0,5 millilitri, concentrare il campione su circa 40 microlitri come delineato nel protocollo di testo.Aggiungere 0,5 microgrammi per microlitro RNasi A e incubare a 37 gradi Celsius per due ore per rilasciare RRP dalla RNasi reticate. Raccogli due microlitri di RMP per il controllo qualità. Quando si ottimizzano i protocolli CARIC, le fasi di controllo qualità sono fondamentali.Il controllo di qualità rappresentativo dei campioni etichettati a clic viene eseguito tramite analisi di fluorescenza in gel. Solo il campione doppiamente etichettato mostra una forte banda di striscio ad alto peso molecolare che rappresenta il segnale degli RRNP incrociati. Il segnale RNP viene abolito omettendo le quattro SU o l'UE. Può anche essere abolito dalla digestione con la RNasi A.In alcuni casi si osserva una forte banda spalmata nel campione di controllo SU n. quattro.Questa banda rappresenta l'etichetta RNasi non collegata che si degrada durante l'innaturazione del calore nella maggior parte dei casi. Il controllo di qualità della conoscenza dei dati del sondaggio di affinità viene valutato attraverso l'analisi western blot che mostra i segnali di biotina nei campioni sia prima del pulldown che dopo il pulldown. Un'analisi della colorazione d'argento degli RMP catturati rivela che per le cellule HeLa, l'efficienza generale di cattura totale è compresa tra lo 0,05 e lo 0,1% delle proteine di input.Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare che le RNasi sono sensibili alle ribonucleasi. Mantenere l'ambiente sperimentale il più pulito possibile per ridurre lo sgrassamento della RNasi. Seguendo questa procedura, l'identificazione dell'almake proteico usando la spettrometria di massa può essere preformata per rivelare le proteine che delimitano il ferro.Dopo il suo sviluppo, la tecnica CARIC spianerà la strada a una comprensione più completa del regolamento OT di trascrizione postale sul lavoro.

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PAR-Clip - un metodo per identificare trascrittoma livello i siti di legame delle proteine ​​RNA binding

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Saggio pull-down RNA-proteina per isolare le proteine leganti l'RNA tramite estrazione per affinità

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Saggio di legame in vitro basato su SELEX per identificare le interazioni RNA-proteina

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Rilevamento di RNA-binding proteins by<em&gt; In Vitro</em&gt; RNA a tendina nella cultura degli adipociti

Le interazioni RNA-proteina sono al centro di molti processi cellulari. Qui, descriviamo un metodo in vivo per isolare RNA specifico e identificare nuove proteine ad esso associate. Questo potrebbe gettare nuova luce su come gli RNA sono regolati nella cellula.

Novel RNA-Proteine ​​leganti isolamento dalla rapida Metodologia

Descriviamo un protocollo per identificare le proteine RNA-leganti e mappare loro regioni di RNA-binding in cellule vive utilizzando photocrosslinking UV-mediati e spettrometria di massa.

Preparazione dei campioni per l'identificazione basati sulla spettrometria di massa di RNA-binding Regions

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Identificazione delle impronte di RNA:Complessi proteici tramite l'immunoprecipitazioni dell'RNA in Tandem seguita dal sequenziamento (RIPiT-Seq)

Qui presentiamo un protocollo CLIP-seq modificato chiamato FbioCLIP-seq con purificazione tandem FLAG-biotina per determinare gli obiettivi di RNA delle proteine leganti l'RNA (RRP) nelle cellule dei mammiferi.

Profilazione a livello di trascrizione delle interazioni proteina-RNA attraverso il cross-linking e l'immunoprecipitazione mediata dalla purificazione tandem FLAG-Biotina

Il cross-linking cinetico e l'analisi del cDNA è un metodo che consente di studiare la dinamica delle interazioni proteina-RNA nelle cellule viventi ad alta risoluzione temporale. Qui il protocollo è descritto in dettaglio, compresa la crescita delle cellule di lievito, la reticolazione UV, la raccolta, la purificazione delle proteine e le fasi di preparazione della libreria di sequenziamento di prossima generazione.

Monitoraggio delle dinamiche di interazione proteina-RNA in vivo ad alta risoluzione temporale utilizzando χCRAC

Qui, presentiamo un metodo in vitro ottimizzato per scoprire, quantificare e convalidare gli interattori proteici di specifiche sequenze di RNA, utilizzando estratto proteico totale da cellule umane, perle di streptavidina rivestite con RNA biotinilato e analisi di spettrometria di massa.

Un'analisi pull-down quantitativa ottimizzata delle proteine leganti l'RNA utilizzando RNA biotinilato corto

Scopri la strategia CARIC per catturare e identificare proteine leganti RNA in cellule HeLa. Questo metodo avanzato consente di studiare le interazioni RNA-proteina e la regolazione post-trascrizionale.

Cattura e identificazione delle proteine RNA-leganti utilizzando clic chimica-assistita RNA-Interactoma (Castaldi) strategia di acquisizione (Video) | JoVE Journal

Cattura e identificazione delle proteine RNA-leganti utilizzando clic chimica-assistita RNA-Interactoma (Castaldi) strategia di acquisizione

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