Cattura e identificazione delle proteine RNA-leganti utilizzando clic chimica-assistita RNA-Interactoma (Castaldi) strategia di acquisizione
19 ottobre 2018
Un protocollo dettagliato per l'applicazione di cattura (CARIC) del RNA-Interactoma di chimica-assistita clicca strategia per identificare proteine leganti alla codificazione di entrambi e non codificanti RNA è presentato.
Questo metodo, CARIC, può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della post-trascrizione della ricreazione genica fornendo un censimento completo delle proteine leganti l'RNA. Il principale vantaggio del CARIC è la sua capacità di catturare proteine legate a vari tipi di RNA come mRNA e RNA non codificanti. Questo metodo può essere utilizzato in vari tipi e nell'organismo per studiare l'interazione della proteina RNA sul lavoro.
In primo luogo, coltura cellule HeLa in DMEM integrato a 37 gradi Celsius in un'atmosfera di CO2 al cinque per cento. Quando le cellule raggiungono circa l'80% di confluenza, sostituire il mezzo di coltura su ogni piatto con 15 millilitri di mezzo fresco prebellito. Aggiungere 15 microlitri da 100 millimolari EU a ciascun piatto a una concentrazione finale di un millimolare.
Per campioni sperimentali e senza controllo UV aggiungere 7,5 microlitri da 100 millimolari quattro SU ad ogni piatto. Coprire i piatti con un foglio e coltura delle cellule per 16 ore utilizzando le condizioni precedenti. Successivamente, aggiungere la metà della quantità precedente di UE e/o quattro SU alle piastre appropriate e continuare a coltivare per altre due ore.
Per iniziare il cross-linking in vivo, rimuovere il mezzo di coltura e lavare ogni piatto tre volte con PBS utilizzando cinque millilitri di PBS per lavaggio. Rimuovere il PBS residuo il più possibile. Per il campione sperimentale e non quattro campioni di controllo SU, posizionare i piatti sul ghiaccio con il coperchio rimosso.
Utilizzare un cross-linker UV per irradiare le cellule con luce UV a 365 nanometri e a due jules per centimetro al quadrato. Per i campioni senza controllo UV, posizionare i piatti sul ghiaccio e proteggerli dalla luce. Quindi, aggiungere un millilitro di tampone di prelisi a ogni piatto.
Utilizzare un sollevatore di celle in gomma per raschiare le celle e raccogliere la sospensione di prelisi in un tubo da 15 millilitri. Aggiungere il tampone di prelisi a un tubo contenente la sospensione da due stoviglie regolando il volume totale a sei millilitri. Quindi aggiungere un volume uguale di buffer di lisi R.
Passare il lysate cellulare attraverso una siringa con un ago stretto più volte fino a quando il lysate è chiaro e omogeneo. Incubare il lisato a quattro gradi Celsius con una rotazione delicata per un'ora. Dopo questo diluire il lisato in 20 volumi di tampone di diluizione e dividerlo in 15 frazioni di millilitro in 15 tubi di nontrafiltrazione millilitro, taglio molecolare di 10 kilodalton.
Utilizzando un rotatore a secchio oscillante, ruotare i tubi a 4000 volte G e quattro gradi Celsius per circa 15 minuti fino a quando ogni frazione è concentrata in un volume inferiore a un millilitro. Aggiungere 14 millilitri di tampone di diluizione a ciascuna frazione di lysate concentrata e ripetere il processo di concentrazione. Quindi unire le frazioni e concentrarle in un volume di sei millilitri utilizzando il processo di concentrazione descritto in precedenza.
Preparare innanzitutto il mix di reazioni come delineato nel protocollo di testo. Aggiungere questa miscela di reazione ai sei millilitri di lysate pre-sgombrato e mescolare bene. Aggiungere 162,5 microlitri di reagente riducente e mescolare bene.
Incubare a temperatura ambiente su uno shaker orbitale a 800 giri/min per due ore. Dopo questo tempra la reazione aggiungendo cinque EDTA millimolare e incubando sullo shaker orbitale a temperatura ambiente per cinque minuti. Successivamente, dividere la miscela di reazione tra due tubi da 50 millilitri, ognuno contenente quattro volumi di metanolo preriffrato e incubare a -30 gradi Celsius per 30 minuti.
Centrifuga a 4000 volte G e quattro gradi Celsius per 15 minuti. Scartare il supernatante e aggiungere tra uno e due millilitri di metanolo pre-refrigerato al pellet. Pipetta su e giù per rompere il pellet assicurandosi che il pellet finisca completamente sospeso senza pezzi visibili.
Ripetere due volte il processo di centrifugazione e sospensione. Successivamente, estraggono con cura il metanolo residuo il più possibile assicurandosi di non disturbare il pellet. Aggiungere 10 millilitri di tampone di ricostituzione e pipetta su e giù per sciogliere il pellet.
Centrifuga a 4000 volte G e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Quindi trasferire il supernatante su un nuovo tubo assicurandosi di raccogliere 20 microlitri del campione per il controllo qualità. Trasferire il campione ripulito e ricostituito nelle perle di agarosio streptavidina preparate.
Incubare a quattro gradi Celsius con una rotazione delicata durante la notte. Fai girare le perline a 4000 volte G per cinque minuti. Trasferire il supernatante su un nuovo tubo assicurandosi di raccogliere 20 microlitri del campione per il controllo qualità.
Lavare le perline con 10 millilitri di tampone di lavaggio A.Incubate con rotazione delicata a 12 giri/min e a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi girare giù le perline a 4000 volte G per cinque minuti. Rimuovere il supernatante e ripetere ancora una volta il processo di lavaggio e centrifugazione.
Ripetere questo processo di lavaggio per il buffer di lavaggio B e il buffer di lavaggio C come indicato nel protocollo di testo. Dopo questo, lavare le perline con 10 millilitri di tricloruro di tris millimolare. Fai girare le perline a 4000 volte G per cinque minuti.
Rimuovere il supernatante e dividere uniformemente le perline tra due tubi a microcentrifugo da 1,5. Per iniziare a eludere gli RRN catturati, aggiungere 400 microlitri di tampone di eluizione di biotina preparato a 400 microlitri di perline lavate e sistemate. Incubare su uno shaker orbitale a 1500 giri/min a temperatura ambiente per 20 minuti.
Quindi incubare su uno shaker orbitale con un blocco di calore a 1500 giri/min e 65 gradi Celsius per 10 minuti. Centrifuga le perline a 7800 volte G per un minuto e raccogli l'RNP eluso. Aggiungere 400 microlitri di tampone fresco di eluizione della biotina alle perline.
Ripetere il processo di incubazione e centrifugazione per raccogliere un secondo eluto e combinare i due eluiti in un unico tubo da 15 millilitri. Successivamente, aggiungere tre volumi di buffer di diluizione agli eluiti RNP combinati per ridurre la concentrazione di SDS. Utilizzando un tubo di ultra filtrazione da 0,5 millilitri, concentrare il campione su circa 40 microlitri come delineato nel protocollo di testo.
Aggiungere 0,5 microgrammi per microlitro RNasi A e incubare a 37 gradi Celsius per due ore per rilasciare RRP dalla RNasi reticate. Raccogli due microlitri di RMP per il controllo qualità. Quando si ottimizzano i protocolli CARIC, le fasi di controllo qualità sono fondamentali.
Il controllo di qualità rappresentativo dei campioni etichettati a clic viene eseguito tramite analisi di fluorescenza in gel. Solo il campione doppiamente etichettato mostra una forte banda di striscio ad alto peso molecolare che rappresenta il segnale degli RRNP incrociati. Il segnale RNP viene abolito omettendo le quattro SU o l'UE. Può anche essere abolito dalla digestione con la RNasi A.In alcuni casi si osserva una forte banda spalmata nel campione di controllo SU n. quattro.
Questa banda rappresenta l'etichetta RNasi non collegata che si degrada durante l'innaturazione del calore nella maggior parte dei casi. Il controllo di qualità della conoscenza dei dati del sondaggio di affinità viene valutato attraverso l'analisi western blot che mostra i segnali di biotina nei campioni sia prima del pulldown che dopo il pulldown. Un'analisi della colorazione d'argento degli RMP catturati rivela che per le cellule HeLa, l'efficienza generale di cattura totale è compresa tra lo 0,05 e lo 0,1% delle proteine di input.
Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare che le RNasi sono sensibili alle ribonucleasi. Mantenere l'ambiente sperimentale il più pulito possibile per ridurre lo sgrassamento della RNasi. Seguendo questa procedura, l'identificazione dell'almake proteico usando la spettrometria di massa può essere preformata per rivelare le proteine che delimitano il ferro.
Dopo il suo sviluppo, la tecnica CARIC spianerà la strada a una comprensione più completa del regolamento OT di trascrizione postale sul lavoro.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per la strategia di cattura dell'interattone RNA assistita dalla chimica click (CARIC), che identifica le proteine che si legano sia agli RNA codificanti che non codificanti. CARIC fornisce un censimento completo delle proteine che si legano all'RNA, contribuendo alla comprensione della regolazione genica post-traduzionale.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Biologia dell'RNA
- Interazioni proteina-RNA
- Regolazione post-traduzionale
Contesto
- Comprendere le proteine che si legano all'RNA è cruciale per la regolazione genica.
- CARIC cattura le proteine legate a vari tipi di RNA, inclusi mRNA e RNA non codificanti.
- Questo metodo può essere applicato a diversi organismi.
- Le cellule HeLa sono comunemente utilizzate per tali studi.
Obiettivo dello studio
- Fornire un protocollo per identificare le proteine che si legano all'RNA.
- Migliorare la comprensione delle interazioni RNA-proteina.
- Facilitare la ricerca sulla regolazione genica post-traduzionale.
Metodi utilizzati
- Coltivazione di cellule HeLa in DMEM integrato.
- Utilizzo di EU 100 millimolare per marcare l'RNA.
- Esecuzione della chimica click per la cattura dell'interattone RNA.
- Analisi delle interazioni proteina-RNA.
Risultati principali
- Identificazione con successo di proteine che si legano all'RNA.
- Dimostrazione della versatilità di CARIC su diversi tipi di RNA.
- Fornitura di informazioni sulle dinamiche delle interazioni RNA-proteina.
- Stabilimento di un metodo affidabile per future ricerche sulla biologia dell'RNA.
Conclusioni
- CARIC è uno strumento potente per studiare le proteine che si legano all'RNA.
- Questo metodo può far progredire la comprensione dei meccanismi di regolazione genica.
- Le applicazioni future possono includere vari contesti biologici e organismi.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is essential for de-risking target validation in post-transcriptional regulatory networks. The CARIC strategy enables transcriptome-wide capture of both poly(A) and non-poly(A) RBPs, expanding the scope of druggable targets beyond mRNA-binding proteins. This approach supports mechanistic de-risking by providing a more complete census of RNA-protein interactions relevant to disease mechanisms and therapeutic intervention.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying RBPs bound to diverse RNA species, including non-coding RNAs implicated in disease pathways.
- Operational Value: Provides a standardized workflow for capturing RNA interactomes, reducing variability in target engagement studies.
- Predictive Value: Enhances confidence in target selection by revealing RBP networks that modulate RNA stability, translation, and localization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative RBP profiles that can be used to develop binding assays for small molecule or nucleic acid therapeutics.
- Operational Value: Produces reproducible, biotin-tagged RNP complexes suitable for streptavidin-based pulldown and downstream proteomic analysis.
- Assay Readiness: Supports screening campaigns by delivering enriched RBP fractions for target validation and hit confirmation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Facilitates biomarker discovery by linking RBP expression or activity to disease-relevant RNA dysregulation.
- Preclinical Modeling: Enables use of CARIC in disease models to assess target modulation and pathway engagement.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by providing mechanistic insights into RBP-mediated RNA regulation in pathophysiological contexts.
Pipeline & Workflow Integration
CARIC fits within the discovery continuum from target identification through lead optimization, particularly for RNA-centric therapeutic strategies. It enables early-stage biological de-risking by mapping the RBP landscape before compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by capturing direct RNA-protein interactions in native cellular contexts.
- Screening: Delivers assay-ready RBP extracts for evaluating compound effects on RNA interactomes.
- Analytics: Generates quantitative mass spectrometry-compatible samples for comparing RBP abundance across conditions.
- Translational Research: Connects RBP capture to preclinical validation by enabling correlation with phenotypic outcomes in disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for profiling RNA interactomes across multiple targets, cell lines, and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by capturing RBPs on both coding and non-coding RNAs, reducing false negatives in target identification.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized metabolic labeling, UV cross-linking, and click chemistry steps.
- Strategic Value: Improves portfolio prioritization by revealing RBP networks that influence RNA-based drug mechanisms and resistance.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by providing mechanistic data on RBP modulation in disease-relevant systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA biology, click chemistry, and mass spectrometry-based proteomics.
- Needs access to UV cross-linkers, metabolic labeling reagents (EU, 4SU), and streptavidin agarose beads.
- Demands cross-team standardization of labeling efficiency, cross-linking duration, and lysis conditions.
- Requires adaptation considerations for primary cells, tissue models, or organisms beyond HeLa.
- Practical limitations include potential background from uncross-linked RNA and RNase sensitivity during sample handling.
