Un metodo basati su Micro-CT per la caratterizzazione di lesioni e posizionamento elettrodi nel cervello degli animali piccoli
8 novembre 2018
Questo articolo viene descritto un metodo semplice per preparare piccoli cervelli animali per l'imaging di micro-CT, in quale le lesioni possono essere quantificate ed elettrodi che si trova con alta precisione nel contesto dell'intero cervello.
Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nel campo delle neuroscienze fornendo un metodo più semplice, meno soggetto a errori e più quantitativo per verificare le lesioni e localizzare le posizioni degli elettrodi. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente la verifica di lesioni e siti di elettrodi in tutto il cervello senza la necessità di sessatura. Il prodotto finale è un volume digitale 3D del cervello e più cervelli possono essere elaborati in parallelo.
Anche se questo metodo sarà dimostrato nel ratto, può anche essere applicato ad altri organismi, come topi e fringuelli zebrati. In generale, le persone nuove a questo metodo avranno difficoltà perché alcuni passaggi richiedono particolare attenzione per garantire i migliori risultati. Per iniziare, posizionare un cervello estratto in soluzione di profusione in un tubo conico da 50 millilitri.
Conservare il campione per due o tre giorni con tremori delicati a quattro gradi Celsius. Assicurarsi che l'osmio sia diluito in acqua e non in un tampone. Questo perché l'acqua fungerà da detergente delicato, permettendo all'osmio di penetrare in profondità nel tessuto.
Preparare 50 millilitri di tetrossido di osmio al 2% in acqua distillata doppia. Quindi posizionare il cervello in un nuovo tubo conico da 50 millilitri e aggiungere la soluzione di tetrossido di osmio. Chiudere il tubo e sigillare con pellicola di paraffina per evitare perdite.
Conservare il tubo sigillato a quattro gradi Celsius con tremori delicati per due settimane. Assicurarsi che il tubo sia posizionato orizzontalmente. Il cervello è molto spesso e un lungo modo di viaggiare per diffusione.
Posizionare il tubo orizzontalmente consentirà all'osmio di viaggiare più in profondità nel tessuto. Dopo che il campione si incuba per due settimane, lavarlo con acqua doppia distillata cinque volte per rimuovere tutto il tetrossido di osmio non legato dal campione. Quindi, lavare il campione con acqua doppia distillata per 30 minuti a quattro gradi Celsius.
Sostituire l'acqua a doppia distillazione con quattro diluizioni di etanolo per disidratare il campione. Per iniziare il processo di infiltrazione della resina, spostare il campione attraverso tre diluizioni di acetone e tre diluizioni di resina acetone, quindi immergere il campione in resina al 100% a temperatura ambiente per continuare il processo di infiltrazione. Successivamente, trasferire il campione in uno stampo monouso.
Infondere il campione con resina fresca al 100% per quattro ore a temperatura ambiente. Degasare il campione in un forno a vuoto per 15 minuti a 45 gradi Celsius. Quindi polimerizza il campione in forno per 48 ore a 60 gradi Celsius.
Infine, una volta terminato la polimerizzazione del campione, staccare lo stampo monouso e scansionarlo con la macchina Micro-CT. Nel sessatura tradizionale, l'orientamento del cervello deve essere predeterminato. Utilizzando questo metodo Micro-CT, il volume digitale del cervello campione può essere manipolato in tre dimensioni e praticamente tagliato in qualsiasi direzione.
La microscopia elettronica a scansione del cervello del ratto preparato conferma che il tessuto non è stato significativamente danneggiato ai fini dell'imaging Micro-CT. Un cervello di fringuello zebrato è stato anche preparato e scansionato secondo questo protocollo per testare l'utilità di questo metodo su altri piccoli cervelli animali. Questa tecnica può essere utilizzata per trovare lesioni superficiali nel cervello, così come lesioni in profondità nel cervello.
Questa tecnica può anche essere applicata alla posizione di singoli tetrodi in situ, lesioni elettrolitiche, cingoli di elettrodi, array di tetrodi in situ e sonde di silicio in situ. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di consentire al cervello di incubare abbastanza a lungo e con sufficiente agitazione. Seguendo questa procedura, altri metodi come l'optogenetica e l'imaging a due fotoni possono essere eseguiti al fine di rispondere a domande aggiuntive sul ruolo che le diverse aree cerebrali svolgono nei diversi comportamenti.
Questa tecnica potrebbe consentire ai ricercatori nel campo delle neuroscienze di esplorare meglio le relazioni struttura-funzione tra il cervello e il comportamento in ratti, topi, uccelli canori e altri piccoli animali. Non dimenticare che lavorare con l'osmio può essere estremamente pericoloso e le precauzioni, come indossare guanti e lavorare in un cappuccio sottovuoto dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.
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Panoramica
Questo articolo descrive un metodo per la preparazione di cervelli di piccoli animali, in particolare di ratti, per l'imaging con micro-TC. La tecnica mira a quantificare lesioni e localizzare con precisione gli elettrodi senza la necessità di effettuare sezioni, producendo un volume digitale tridimensionale completo del cervello.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Tecniche di Imaging
- Analisi delle Lesioni
Sfondo
- L'immagine micro-CT consente l'analisi non distruttiva delle strutture cerebrali.
- I metodi tradizionali di sezionamento possono essere soggetti a errori e limitano la flessibilità di orientamento.
- Questo metodo migliora la capacità di analizzare lesioni e posizionamento degli elettrodi.
- Applicabile a diversi animali di piccola taglia come topi e fringuelli zegretti.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo di preparazione semplificato e meno soggetto a errori per l'immagine in micro-TC.
- Fornire una localizzazione accurata delle lesioni e degli elettrodi.
- Facilitare la manipolazione tridimensionale dei campioni cerebrali per un'analisi migliorata.
Metodi Utilizzati
- La piattaforma principale utilizzata è l'imaging micro-CT di campioni cerebrali preparati.
- Il modello biologico chiave è il cervello del ratto, ma il metodo è adattabile ad altri piccoli animali.
- Il metodo prevede specifici periodi di incubazione e l'uso di tetrossido di osmio per la preparazione del tessuto.
- I passaggi critici includono il posizionamento orizzontale del tubo e diversi passaggi di lavaggio per garantire la penetrazione dell'osmio.
- La preparazione finale comprende la polimerizzazione della resina e la scansione mediante un apparecchio micro-CT.
Risultati principali
- Questo metodo consente la visualizzazione di lesioni cerebrali sia superficiali che profonde.
- Permette l'identificazione precisa dei tracciati degli elettrodi e delle lesioni, mantenendo l'integrità del tessuto.
- L'analisi dei campioni scansionati mostra che il danno tissutale è minimo, confermando l'applicabilità della tecnica.
- La procedura può supportare ulteriori esperimenti come l'optogenetica e l'immagine a due fotoni.
Conclusioni
- Questo studio dimostra un metodo efficace per preparare cervelli animali per analisi dettagliate mediante micro-TC.
- La tecnica consente ai ricercatori di esplorare il comportamento dei neuroni e le relazioni strutturali senza danneggiare i campioni.
- Nel complesso, potenzia le capacità della ricerca in neuroscienze per comprendere la meccanica cerebrale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Una caratterizzazione accurata delle lesioni e una localizzazione precisa degli elettrodi sono fondamentali per validare ipotesi meccanicistiche nella scoperta di farmaci guidata dalle neuroscienze. Questo flusso di lavoro basato sulla micro-TC consente una mappatura quantitativa ad alta risoluzione degli interventi cerebrali, riducendo gli errori manuali e favorendo confronti riproducibili tra diversi studi. L'approccio migliora la fiducia predittiva nei punti critici di validazione del bersaglio e del modello preclinico, influenzando direttamente la continuità traslazionale e le decisioni relative al portafoglio.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette una verifica precisa del posizionamento della lesione e della localizzazione dell'elettrodo per la riduzione del rischio meccanicistico.
- Supporta la validazione del bersaglio funzionale fornendo un contesto anatomico tridimensionale per i siti di intervento.
- Facilita il confronto quantitativo delle manipolazioni sperimentali tra studi e modelli.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara modelli cerebrali validati per saggi funzionali successivi e studi comportamentali.
- Standardizza la mappatura di lesioni ed elettrodi, migliorando la riproducibilità e l'affidabilità dei saggi.
- Genera volumi digitali adatti per segmentazione e analisi automatizzate o manuali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i dati di intervento anatomico con esiti comportamentali e funzionali in sistemi pertinenti alla malattia.
- Permette una continuità dalla scoperta alla validazione preclinica, supportando l'integrazione di dati multimodali.
- Riduce l'ambiguità biologica nei modelli preclinici, informando decisioni di avanzamento con valutazione del rischio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo di micro-TC si integra all'interfaccia tra biologia della scoperta e validazione di modelli preclinici, collegando la verifica anatomica con letture funzionali e comportamentali.
- Biologia della Scoperta: Fornisce verifica quantitativa e tridimensionale delle manipolazioni sperimentali per la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi biologici.
- Screening: Offre dati anatomici riproducibili ad alta risoluzione per supportare la prontezza dei saggi e la standardizzazione tra studi.
- Analisi: Permette la misurazione e il confronto digitali dei volumi delle lesioni e delle posizioni degli elettrodi in diverse condizioni.
- Ricerca Translazionale: Supporta l'allineamento di dati anatomici e funzionali per la validazione di modelli pertinenti alle malattie.
- Riutilizzo Aziendale: Offre un flusso di lavoro digitale scalabile, adattabile a diversi modelli di piccoli animali e paradigmi sperimentali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi di validazione del target.
- Valore operativo: Ottimizza i processi di verifica, consentendo l'elaborazione parallela dei campioni e l'archiviazione digitale.
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento o interruzione standardizzando la validazione anatomica tra diversi programmi.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sul rischio fornendo dati anatomici robusti e quantitativi per la selezione e l' avanzamento dei modelli.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze nella preparazione dei tessuti, nell'immagine micro-CT e nell'analisi digitale del volume.
- Richiede l'accesso a strumentazione micro-CT e a software di analisi compatibili (gratuiti o proprietari).
- Necessita di una rigorosa standardizzazione tra i gruppi di lavoro per la gestione dei campioni e i protocolli di imaging.
- È adattabile a diversi modelli di piccoli animali, con adeguamenti del protocollo in base alle dimensioni e alla composizione dei tessuti.
- È essenziale adottare precauzioni di sicurezza a causa di reagenti pericolosi come l'osmio tetraossido.
