Un metodo basati su Micro-CT per la caratterizzazione di lesioni e posizionamento elettrodi nel cervello degli animali piccoli
November 8th, 2018
Questo articolo viene descritto un metodo semplice per preparare piccoli cervelli animali per l'imaging di micro-CT, in quale le lesioni possono essere quantificate ed elettrodi che si trova con alta precisione nel contesto dell'intero cervello.
Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nel campo delle neuroscienze fornendo un metodo più semplice, meno soggetto a errori e più quantitativo per verificare le lesioni e localizzare le posizioni degli elettrodi. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente la verifica di lesioni e siti di elettrodi in tutto il cervello senza la necessità di sessatura. Il prodotto finale è un volume digitale 3D del cervello e più cervelli possono essere elaborati in parallelo.
Anche se questo metodo sarà dimostrato nel ratto, può anche essere applicato ad altri organismi, come topi e fringuelli zebrati. In generale, le persone nuove a questo metodo avranno difficoltà perché alcuni passaggi richiedono particolare attenzione per garantire i migliori risultati. Per iniziare, posizionare un cervello estratto in soluzione di profusione in un tubo conico da 50 millilitri.
Conservare il campione per due o tre giorni con tremori delicati a quattro gradi Celsius. Assicurarsi che l'osmio sia diluito in acqua e non in un tampone. Questo perché l'acqua fungerà da detergente delicato, permettendo all'osmio di penetrare in profondità nel tessuto.
Preparare 50 millilitri di tetrossido di osmio al 2% in acqua distillata doppia. Quindi posizionare il cervello in un nuovo tubo conico da 50 millilitri e aggiungere la soluzione di tetrossido di osmio. Chiudere il tubo e sigillare con pellicola di paraffina per evitare perdite.
Conservare il tubo sigillato a quattro gradi Celsius con tremori delicati per due settimane. Assicurarsi che il tubo sia posizionato orizzontalmente. Il cervello è molto spesso e un lungo modo di viaggiare per diffusione.
Posizionare il tubo orizzontalmente consentirà all'osmio di viaggiare più in profondità nel tessuto. Dopo che il campione si incuba per due settimane, lavarlo con acqua doppia distillata cinque volte per rimuovere tutto il tetrossido di osmio non legato dal campione. Quindi, lavare il campione con acqua doppia distillata per 30 minuti a quattro gradi Celsius.
Sostituire l'acqua a doppia distillazione con quattro diluizioni di etanolo per disidratare il campione. Per iniziare il processo di infiltrazione della resina, spostare il campione attraverso tre diluizioni di acetone e tre diluizioni di resina acetone, quindi immergere il campione in resina al 100% a temperatura ambiente per continuare il processo di infiltrazione. Successivamente, trasferire il campione in uno stampo monouso.
Infondere il campione con resina fresca al 100% per quattro ore a temperatura ambiente. Degasare il campione in un forno a vuoto per 15 minuti a 45 gradi Celsius. Quindi polimerizza il campione in forno per 48 ore a 60 gradi Celsius.
Infine, una volta terminato la polimerizzazione del campione, staccare lo stampo monouso e scansionarlo con la macchina Micro-CT. Nel sessatura tradizionale, l'orientamento del cervello deve essere predeterminato. Utilizzando questo metodo Micro-CT, il volume digitale del cervello campione può essere manipolato in tre dimensioni e praticamente tagliato in qualsiasi direzione.
La microscopia elettronica a scansione del cervello del ratto preparato conferma che il tessuto non è stato significativamente danneggiato ai fini dell'imaging Micro-CT. Un cervello di fringuello zebrato è stato anche preparato e scansionato secondo questo protocollo per testare l'utilità di questo metodo su altri piccoli cervelli animali. Questa tecnica può essere utilizzata per trovare lesioni superficiali nel cervello, così come lesioni in profondità nel cervello.
Questa tecnica può anche essere applicata alla posizione di singoli tetrodi in situ, lesioni elettrolitiche, cingoli di elettrodi, array di tetrodi in situ e sonde di silicio in situ. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di consentire al cervello di incubare abbastanza a lungo e con sufficiente agitazione. Seguendo questa procedura, altri metodi come l'optogenetica e l'imaging a due fotoni possono essere eseguiti al fine di rispondere a domande aggiuntive sul ruolo che le diverse aree cerebrali svolgono nei diversi comportamenti.
Questa tecnica potrebbe consentire ai ricercatori nel campo delle neuroscienze di esplorare meglio le relazioni struttura-funzione tra il cervello e il comportamento in ratti, topi, uccelli canori e altri piccoli animali. Non dimenticare che lavorare con l'osmio può essere estremamente pericoloso e le precauzioni, come indossare guanti e lavorare in un cappuccio sottovuoto dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Panoramica
Questo articolo descrive un metodo per preparare cervelli di piccoli animali, in particolare cervelli di ratti, per l'imaging micro-CT. La tecnica mira a quantificare le lesioni e localizzare con precisione gli elettrodi senza la necessità di sezionare, producendo un volume digitale 3D completo del cervello.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Tecniche di imaging
- Analisi delle lesioni
Contesto
- L'imaging micro-CT permette un'analisi non distruttiva delle strutture cerebrali.
- I metodi di sezionamento tradizionali possono essere soggetti a errori e limitano la flessibilità di orientamento.
- Questo metodo migliora la capacità di analizzare lesioni e posizionamento degli elettrodi.
- Applicabile a diversi piccoli animali come topi e fringuelli zebra.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo di preparazione semplificato e meno soggetto a errori per l'imaging micro-CT.
- Fornire una localizzazione accurata di lesioni ed elettrodi.
- Facilitare la manipolazione 3D dei campioni cerebrali per un'analisi migliorata.
Metodi utilizzati
- La piattaforma principale utilizzata è l'imaging micro-CT di campioni cerebrali preparati.
- Il modello biologico chiave è il cervello del ratto, ma il metodo è adattabile ad altri piccoli animali.
- Il metodo prevede periodi di incubazione specifici e l'uso di ossido di osmio per la preparazione dei tessuti.
- I passaggi critici includono il posizionamento orizzontale del tubo e molteplici passaggi di lavaggio per garantire la penetrazione dell'ossido di osmio.
- La preparazione finale include la polimerizzazione della resina e la scansione con una macchina Micro-CT.
Risultati principali
- Questo metodo permette la visualizzazione sia delle lesioni superficiali che di quelle profonde del cervello.
- Consente l'identificazione accurata dei percorsi degli elettrodi e delle lesioni mantenendo l'integrità del tessuto.
- I campioni scansionati mostrano che il danno tissutale è minimo, confermando l'applicabilità della tecnica.
- La procedura può supportare ulteriori esperimenti come l'optogenetica e l'imaging a due fotoni.
Conclusioni
- Questo studio dimostra un metodo efficace per preparare cervelli animali per un'analisi dettagliata utilizzando l'imaging micro-CT.
- La tecnica permette ai ricercatori di esplorare il comportamento dei neuroni e le relazioni strutturali senza danneggiare i campioni.
- Complessivamente, migliora le capacità della ricerca in neuroscienze nella comprensione della meccanica cerebrale.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Accurate lesion characterization and electrode localization are critical for validating mechanistic hypotheses in neuroscience-driven drug discovery. This micro-CT-based workflow enables high-resolution, quantitative mapping of brain interventions, reducing manual error and supporting reproducible, cross-study comparisons. The approach enhances predictive confidence at the target validation and preclinical model inflection points, directly impacting translational continuity and portfolio decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise verification of lesion placement and electrode localization for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by providing 3D anatomical context for intervention sites.
- Facilitates quantitative comparison of experimental manipulations across studies and models.
Screening & Assay Development
- Prepares validated brain models for downstream functional assays and behavioral studies.
- Standardizes lesion and electrode mapping, improving reproducibility and assay reliability.
- Generates digital volumes suitable for automated or manual segmentation and analysis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns anatomical intervention data with behavioral and functional outcomes in disease-relevant systems.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting multi-modal data integration.
- Reduces biological ambiguity in preclinical models, informing risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
This micro-CT method integrates at the interface of discovery biology and preclinical model validation, bridging anatomical verification with functional and behavioral readouts.
- Discovery Biology: Provides quantitative, 3D verification of experimental manipulations for hypothesis testing and pathway clarification.
- Screening: Delivers reproducible, high-resolution anatomical data to support assay readiness and cross-study standardization.
- Analytics: Enables digital measurement and comparison of lesion volumes and electrode positions across conditions.
- Translational Research: Supports alignment of anatomical and functional data for disease-relevant model validation.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, digital workflow adaptable to multiple small animal models and experimental paradigms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation studies.
- Operational Value: Streamlines verification processes, enabling parallel sample processing and digital archiving.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by standardizing anatomical validation across programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing robust, quantitative anatomical data for model selection and advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue preparation, micro-CT imaging, and digital volume analysis.
- Demands access to micro-CT instrumentation and compatible analysis software (free or proprietary).
- Necessitates rigorous cross-team standardization of sample handling and imaging protocols.
- Adaptable to various small animal models with protocol adjustments for tissue size and composition.
- Safety precautions are essential due to hazardous reagents such as osmium tetroxide.
