Come quantificare la frazione di proteine fluorescenti di fotoattivazione alla rinfusa e in cellule vive
7 gennaio 2019
Qui, presentiamo un protocollo che coinvolge fuse spettralmente distinti geneticamente accoppiati e proteine fluorescenti. Queste chimere di proteina fluorescente permettono quantificazione della frazione PA-FP è fotoattivazione di essere fluorescente, cioè, l'efficienza di fotoattivazione. Il protocollo rivela che i diversi modi di fotoattivazione rendimento fotoattivazione diverse efficienze.
Presentiamo qui un protocollo che coinvolge proteine fotoattivabili e fluorescenti geneticamente accoppiate. Questi righelli interni consentono la quantificazione della frazione PAFP che viene foto attivata per essere fluorescente. Finora non è stato disponibile alcun metodo per quantificare alla rinfusa nelle cellule vita quante delle PAFP espresse sono foto attivate per la fluorescenza. La quantificazione presentata dell'efficienza di fotoattivazione è esemplificata per PA-GFP e PA Cherry nelle cellule vive, ma in linea di principio è ampiamente applicabile e può essere utilizzata per qualsiasi proteina fluorescente fotoattivabile in qualsiasi condizione sperimentale. Ogni volta che si lavora con proteine fluorescenti geneticamente codificate, la quantità assoluta di proteine espresse varia da cellula a cellula ed è sconosciuta. Per standardizzare l'espressione tra le cellule, introduciamo righelli interni di proteine fluorescenti geneticamente accoppiate spettralmente distinte. Accoppiando le informazioni genetiche di una proteina florescente fotoattivabile a una spettralmente distinta sempre su proteine fluorescenti vengono creati righelli interni che saranno ancora espressi a una quantità totale sconosciuta ma in una quantità relativa nota fissa di uno a uno. Per iniziare a costruire i plasmidi come descritto nel protocollo di testo di accompagnamento. Inoltre, la coltura nella linea cellulare standard nel suo mezzo prospettica utilizzando la versione senza fenolo rosso. Quando sei pronto per iniziare l'esperimento, raccogli le cellule usando la triptina senza fenolo rosso per ridurre la florescenza di fondo. Dopo il raccolto, riempire una pipetta da 2 ml con la sospensione cellulare da una coltura cellulare confluente coltivata in un pallone da coltura cellulare T 12.5. Aggiungere una goccia in ogni camera di uno scivolo di vetro a otto camere. Incubare lo scivolo in condizioni standard di coltura cellulare per 24 ore. Successivamente trasfetto le celle utilizzando reagenti commerciali seguendo il protocollo distributori. Trasfetto le cellule con le chimere GFP Cherry, PA-GFP Cherry e GFPPA Cherry. Quindi riportare le cellule nell'incubatrice per consentire l'espressione proteica, la piegatura e la maturazione. Dopo un totale di 20 ore dopo la trasfezione, trasferire le cellule allo stadio di un microscopio florescente confocale dotato della camera ambientale umidificata e riscaldata preriscaldata a 37
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Panoramica
In questo articolo viene presentato un protocollo che utilizza proteine fotoattivabili e fluorescenti geneticamente accoppiate e distintamente spettrali. Queste chimere permettono la quantificazione dell'efficienza di fotoattivazione della frazione di PA-FP che diventa fluorescente, rivelando che diversi modi di fotoattivazione producono efficienze variabili.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Tecnologia delle proteine fluorescenti
- Tecniche di fotoattivazione
Sfondo
- Le proteine fluorescenti sono strumenti essenziali nella ricerca biologica.
- Le proteine fluorescenti fotoattivabili permettono un controllo spaziotemporale della fluorescenza.
- Comprendere l'efficienza di fotoattivazione è fondamentale per ottenere risultati sperimentali accurati.
- Diversi metodi di attivazione possono influenzare le prestazioni di queste proteine.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo per la valutazione dell'efficienza di fotoattivazione.
- Confrontare gli effetti di diverse modalità di fotoattivazione.
- Potenziare l'utilizzo delle chimere proteiche fluorescenti nella ricerca.
Metodi Utilizzati
- Accoppiamento genetico di proteine fotoattivabili e fluorescenti.
- Quantificazione della frazione fotoattivata.
- Confronto di diverse tecniche di fotoattivazione.
- Analisi delle efficienze di fotoattivazione.
Risultati principali
- Diverse modalità di fotoattivazione hanno prodotto efficienze variabili.
- Il protocollo ha quantificato con successo l'efficienza di fotoattivazione.
- Le chimere di proteine fluorescenti hanno dimostrato un potenziale significativo per applicazioni nella ricerca.
- Le informazioni ottenute possono guidare futuri studi che utilizzano proteine fotoattivabili.
Conclusioni
- Lo studio fornisce un protocollo prezioso per i ricercatori.
- Comprendere l'efficienza della fotoattivazione è fondamentale per la progettazione sperimentale.
- La ricerca futura può basarsi su questi risultati per ottimizzare l'uso delle proteine fluorescenti.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
La quantificazione dell'efficienza di fotoattivazione delle proteine fluorescenti colma un'importante lacuna nell'immagine di cellule vive, consentendo un'interpretazione più affidabile del comportamento dinamico delle proteine. Questa capacità supporta la validazione degli obiettivi e lo sviluppo di saggi fornendo un parametro misurabile delle prestazioni delle sonde fotoattivabili. Un migliorato livello di confidenza predittivo riguardo all'attivazione della sonda riduce l'ambiguità meccanicistica in applicazioni successive, come lo screening fenotipico e gli studi traslazionali sui biomarcatori.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche quantificando la frazione di proteine fotoattivabili attivate con successo.
- Valore operativo: Fornisce un controllo interno raziometrico per normalizzare la variabilità di espressione tra cellula e cellula.
- Valore predittivo: Supporta l'identificazione di candidati promettenti permettendo il confronto delle efficienze di fotoattivazione tra diverse varianti proteiche o condizioni sperimentali.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera letture quantitative standardizzate dell'efficienza di fotoattivazione per l'ottimizzazione del saggio.
- Riproducibilità: Utilizza indicatori interni accoppiati geneticamente per garantire un'espressione relativa costante tra replicati sperimentali.
- Scalabilità: Compatibile con formati in bulk e cellulari vivi, consentendo l'integrazione in flussi di lavoro di screening ad alto contenuto.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Facilita la riduzione del rischio meccanicistico collegando l'efficienza di fotoattivazione a letture funzionali in sistemi pertinenti alla malattia.
- Conferma predittiva: Permette decisioni di avanzamento corrette per il rischio basate sulle prestazioni quantitative di fotoattivazione.
- Allineamento con biomarcatori: Supporta lo sviluppo di reporter fotoattivabili per il monitoraggio longitudinale in modelli preclinici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione iniziale della proteina bersaglio allo sviluppo del saggio fino alla valutazione preclinica, in particolare nei casi in cui è richiesto un controllo spaziotemporale dell'attività proteica.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi quantificando la frazione attivata di sonde fotoattivabili in cellule vive.
- Screening: Permette la standardizzazione dei saggi attraverso misurazioni raziometriche indipendenti dai livelli assoluti di espressione.
- Analisi: Fornisce misurazioni quantitative di variabili dipendenti (frazione di fotoattivazione) che consentono il confronto tra modalità di attivazione.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica permettendo la valutazione standardizzata di reporter fotoattivabili in modelli di malattia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la valutazione di qualsiasi coppia di proteine fluorescenti fotoattivabili spettralmente distinte.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nelle prestazioni delle sonde fotoattivabili e riduce i falsi negativi nei saggi basati sull'attivazione.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione tra laboratori e configurazioni sperimentali.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione nella selezione delle sonde fornendo dati quantitativi sull'efficienza di attivazione.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione adeguata al rischio degli strumenti fotoattivabili in base a metriche di prestazione validate.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in clonaggio molecolare per generare chimere di proteine fluorescenti accoppiate geneticamente.
- Dipende dall'accesso a microscopia a fluorescenza confocale o a campo ampio con capacità di fotoattivazione.
- Necessita della standardizzazione dei parametri di acquisizione e dei protocolli di fotoattivazione tra diversi utenti.
- Richiede la validazione della funzionalità della chimera e della separazione spettrale nella linea cellulare bersaglio.
- Limitato ai sistemi in cui l'accoppiamento genetico dei fluorofori non compromette la funzione o la localizzazione della proteina.
Domande frequenti sul biopharma
Chapters in this video
0:04
Title
1:20
Cell Culture and Transfection
2:31
Imaging and Photoactivation
5:45
Imaging Analysis and Algorithm for Ratiometric Intensity-based Quantification of Photoactivation Efficiency
9:09
Results: Maximizing Photoactivation Efficiency
9:50
Conclusion
