Come quantificare la frazione di proteine fluorescenti di fotoattivazione alla rinfusa e in cellule vive
January 7th, 2019
Qui, presentiamo un protocollo che coinvolge fuse spettralmente distinti geneticamente accoppiati e proteine fluorescenti. Queste chimere di proteina fluorescente permettono quantificazione della frazione PA-FP è fotoattivazione di essere fluorescente, cioè, l'efficienza di fotoattivazione. Il protocollo rivela che i diversi modi di fotoattivazione rendimento fotoattivazione diverse efficienze.
Presentiamo qui un protocollo che coinvolge proteine fotoattivabili e fluorescenti geneticamente accoppiate. Questi righelli interni consentono la quantificazione della frazione PAFP che viene foto attivata per essere fluorescente. Finora non è stato disponibile alcun metodo per quantificare alla rinfusa nelle cellule vita quante delle PAFP espresse sono foto attivate per la fluorescenza. La quantificazione presentata dell'efficienza di fotoattivazione è esemplificata per PA-GFP e PA Cherry nelle cellule vive, ma in linea di principio è ampiamente applicabile e può essere utilizzata per qualsiasi proteina fluorescente fotoattivabile in qualsiasi condizione sperimentale. Ogni volta che si lavora con proteine fluorescenti geneticamente codificate, la quantità assoluta di proteine espresse varia da cellula a cellula ed è sconosciuta. Per standardizzare l'espressione tra le cellule, introduciamo righelli interni di proteine fluorescenti geneticamente accoppiate spettralmente distinte. Accoppiando le informazioni genetiche di una proteina florescente fotoattivabile a una spettralmente distinta sempre su proteine fluorescenti vengono creati righelli interni che saranno ancora espressi a una quantità totale sconosciuta ma in una quantità relativa nota fissa di uno a uno. Per iniziare a costruire i plasmidi come descritto nel protocollo di testo di accompagnamento. Inoltre, la coltura nella linea cellulare standard nel suo mezzo prospettica utilizzando la versione senza fenolo rosso. Quando sei pronto per iniziare l'esperimento, raccogli le cellule usando la triptina senza fenolo rosso per ridurre la florescenza di fondo. Dopo il raccolto, riempire una pipetta da 2 ml con la sospensione cellulare da una coltura cellulare confluente coltivata in un pallone da coltura cellulare T 12.5. Aggiungere una goccia in ogni camera di uno scivolo di vetro a otto camere. Incubare lo scivolo in condizioni standard di coltura cellulare per 24 ore. Successivamente trasfetto le celle utilizzando reagenti commerciali seguendo il protocollo distributori. Trasfetto le cellule con le chimere GFP Cherry, PA-GFP Cherry e GFPPA Cherry. Quindi riportare le cellule nell'incubatrice per consentire l'espressione proteica, la piegatura e la maturazione. Dopo un totale di 20 ore dopo la trasfezione, trasferire le cellule allo stadio di un microscopio florescente confocale dotato della camera ambientale umidificata e riscaldata preriscaldata a 37
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo che utilizza proteine fotoattivabili e fluorescenti spettralmente distinte geneticamente accoppiate. Queste chimere permettono la quantificazione dell'efficienza di fotoattivazione della frazione PA-FP che diventa fluorescente, rivelando che diverse modalità di fotoattivazione producono efficienze variabili.
Componenti Principali dello Studio
Area di Scienza
- Neuroscienza
- Tecnologia delle Proteine Fluorescenti
- Tecniche di Fotoattivazione
Sfondo
- Le proteine fluorescenti sono strumenti essenziali nella ricerca biologica.
- Le proteine fluorescenti fotoattivabili consentono il controllo spaziotemporale della fluorescenza.
- Comprendere l'efficienza di fotoattivazione è cruciale per risultati sperimentali accurati.
- Diversi metodi di attivazione possono influenzare le prestazioni di queste proteine.
Scopo dello Studio
- Sviluppare un protocollo per valutare l'efficienza di fotoattivazione.
- Confrontare gli effetti di varie modalità di fotoattivazione.
- Migliorare l'utilità delle chimere di proteine fluorescenti nella ricerca.
Metodi Utilizzati
- Accoppiamento genetico di proteine fotoattivabili e fluorescenti.
- Quantificazione della frazione fotoattivata.
- Confronto di diverse tecniche di fotoattivazione.
- Analisi delle efficienze di fotoattivazione.
Risultati Principali
- Diversi modi di fotoattivazione hanno prodotto efficienze variabili.
- Il protocollo ha quantificato con successo l'efficienza di fotoattivazione.
- Le chimere di proteine fluorescenti hanno dimostrato un significativo potenziale per le applicazioni di ricerca.
- Le intuizioni acquisite possono informare studi futuri che utilizzano proteine fotoattivabili.
Conclusioni
- Lo studio fornisce un protocollo prezioso per i ricercatori.
- Comprendere l'efficienza di fotoattivazione è fondamentale per la progettazione sperimentale.
- La ricerca futura può basarsi su questi risultati per ottimizzare l'uso delle proteine fluorescenti.
Domande Frequenti
Executive Industry Relevance
Quantifying photoactivation efficiency of fluorescent proteins addresses a critical gap in live-cell imaging, enabling more reliable interpretation of dynamic protein behavior. This capability supports target validation and assay development by providing a measurable parameter for photoactivatable probe performance. Improved predictive confidence in probe activation reduces mechanistic ambiguity in downstream applications such as phenotypic screening and translational biomarker studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying the fraction of photoactivatable proteins successfully activated.
- Operational Value: Provides a ratiometric internal control to normalize for cell-to-cell expression variability.
- Predictive Value: Supports lead identification by allowing comparison of photoactivation efficiencies across different protein variants or conditions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative readouts of photoactivation efficiency for assay optimization.
- Reproducibility: Uses genetically coupled internal rulers to ensure consistent relative expression across experimental replicates.
- Scalability: Compatible with bulk and live-cell formats, enabling integration into high-content screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Facilitates mechanistic de-risking by linking photoactivation efficiency to functional readouts in disease-relevant systems.
- Predictive Confidence: Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative photoactivation performance.
- Biomarker Alignment: Supports development of photoactivatable reporters for longitudinal tracking in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through assay development to preclinical evaluation, particularly where spatiotemporal control of protein activity is required.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying the activated fraction of photoactivatable probes in live cells.
- Screening: Enables assay standardization through ratiometric measurement independent of absolute expression levels.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (photoactivation fraction) that allow comparison of activation modes.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling standardized evaluation of photoactivatable reporters in disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating any spectrally distinct photoactivatable fluorescent protein pair.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in photoactivatable probe performance and reduces false negatives in activation-based assays.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across laboratories and experimental setups.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in probe selection by providing quantitative activation efficiency data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of photoactivatable tools based on validated performance metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning to generate genetically coupled fluorescent protein chimeras.
- Dependent on access to confocal or widefield fluorescence microscopy with photoactivation capabilities.
- Necessitates standardization of imaging parameters and photoactivation protocols across users.
- Requires validation of chimera functionality and spectral separation in the target cell line.
- Limited to systems where genetic coupling of fluorophores does not impair protein function or localization.
