Name: Recupero di biocitina e ricostruzioni 3D di interneuroni riempito Hippocampal CA2 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Scopri il recupero di biocitina e le ricostruzioni 3D di interneuroni ippocampali CA2. Questo metodo combina registrazioni elettrofisiologiche e immunofluorescenza per preservare l'ultrastruttura neuronale e ottenere ricostruzioni morfologiche di alta qualità.

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Questa ricerca ha ricevuto un finanziamento da Novartis Pharma (Basilea) e del Medical Research Council assegnato a Prof Alex Thomson, la biotecnologia e di Biological Sciences Research Council (BBSRC-BB/G008639/1), la società fisiologica, l'Unione europea Orizzonte 2020 programma quadro per la ricerca e l'innovazione sotto l'accordo di sovvenzione specifiche n ° 720270 (Human Brain Project SGA1) e sotto l'accordo di sovvenzione specifiche n ° 785907 (Human Brain Project SGA2). Siamo estremamente grati al Prof Alex Thomson per la configurazione del protocollo in altre regioni corticali, garantire il finanziamento e per il suo continuo sostegno per questo progetto. Contributi dei membri di laboratorio che hanno contribuito a ottimizzare il protocollo di recupero e ricostruito CA2 neuroni sono ringraziano: J. Deuchars, D. I. Hughes e H. Pawelzik, A. P. Bannister, K. Eastlake, H. Trigg, N. A. Botcher.

<ol><li>Klausberger, T., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+diversity+and+temporal+dynamics%3A+the+unity+of+hippocampal+circuit+operations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations.</a> Science. 321, 53-57 (2008).</li>
<li>DeFelipe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+classification+and+nomenclature+of+cortical+GABAergic+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).</li>
<li>Bezaire, M. J., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+CA1+local+circuits%3A+knowledge+base+for+interneuron-pyramidal+cell+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of CA1 local circuits: knowledge base for interneuron-pyramidal cell connectivity.</a> Hippocampus. 23, 751-785 (2013).</li>
<li>Katona, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior-dependent+activity+patterns+of+GABAergic+long-range+projecting+neurons+in+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Behavior-dependent activity patterns of GABAergic long-range projecting neurons in the rat hippocampus.</a> Hippocampus. 27, 359-377 (2017).</li>
<li>Ali, A. B., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitating+pyramid+to+horizontal+oriens-alveus+interneurone+inputs%3A+dual+intracellular+recordings+in+slices+of+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Facilitating pyramid to horizontal oriens-alveus interneurone inputs: dual intracellular recordings in slices of rat hippocampus.</a> Journal of Physiology. 507, 185-199 (1998).</li>
<li>Ali, A. B., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+alpha+5+subunit-containing+GABAA+receptors+mediate+IPSPs+elicited+by+dendrite-preferring+cells+in+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Synaptic alpha 5 subunit-containing GABAA receptors mediate IPSPs elicited by dendrite-preferring cells in rat neocortex.</a> Cerebral Cortex. 18, 1260-1271 (2008).</li>
<li>Ali, A. B., Bannister, A. P., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+correlations+between+action+potential+duration+and+the+properties+of+synaptic+connections+in+layer+4+interneurones+in+neocortical+slices+from+juvenile+rats+and+adult+rat+and+cat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Robust correlations between action potential duration and the properties of synaptic connections in layer 4 interneurones in neocortical slices from juvenile rats and adult rat and cat.</a> Journal of Physiology. 580, 149-169 (2007).</li>
<li>Pawelzik, H., Bannister, A. P., Deuchars, J., Ilia, M., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+bistratified+cell+IPSPs+and+basket+cell+IPSPs+by+pentobarbitone+sodium%2C+diazepam+and+Zn2%2B%3A+dual+recordings+in+slices+of+adult+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modulation of bistratified cell IPSPs and basket cell IPSPs by pentobarbitone sodium, diazepam and Zn2+: dual recordings in slices of adult rat hippocampus.</a> European Journal of Neuroscience. 11, 3552-3564 (1999).</li>
<li>Pawelzik, H., Hughes, D. I., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4176080/">Physiological and morphological diversity of immunocytochemically defined parvalbumin-and cholecystokinin-positive interneurones in CA1 of the adult rat hippocampus.</a> Journal of Comparative Neurology. 443, 346-367 (2002).</li>
<li>Thomson, A. M., Lamy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maps+of+neocortical+local+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional maps of neocortical local circuitry.</a> Frontiers of Neuroscience. 1, 19-42 (2007).</li>
<li>Kepecs, A., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+cell+types+are+fit+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interneuron cell types are fit to function.</a> Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).</li>
<li>Wilent, W. B., Nitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrete+Place+Fields+of+Hippocampal+Formation+Interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Discrete Place Fields of Hippocampal Formation Interneurons.</a> Journal of Neurophysiology. 97, 4152-4161 (2007).</li>
<li>Hirsch, J. A., Martinez, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+processing+in+the+visual+cortical+column%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Laminar processing in the visual cortical column.</a> Current Opinion in Neurobiology. 16 (4), 377-384 (2006).</li>
<li>Kay, K., Sosa, M., Chung, J. E., Karlsson, M. P., Larkin, M. C., Frank, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hippocampal+network+for+spatial+coding+during+immobility+and+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A hippocampal network for spatial coding during immobility and sleep.</a> Nature. 531, 185-190 (2016).</li>
<li>Yu, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+hippocampal-cortical+memory+representations+for+experiences+associated+with+movement+versus+immobility%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Distinct hippocampal-cortical memory representations for experiences associated with movement versus immobility.</a> eLife. 6, e27621(2017).</li>
<li>Markram, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+and+Simulation+of+Neocortical+Microcircuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reconstruction and Simulation of Neocortical Microcircuitry.</a> Cell. 163, 456-492 (2015).</li>
<li>Van Geit, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BluePyOpt%3A+Leveraging+Open+Source+Software+and+Cloud+Infrastructure+to+Optimise+Model+Parameters+in+Neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroinformatics%22%5BJournal%5D)">BluePyOpt: Leveraging Open Source Software and Cloud Infrastructure to Optimise Model Parameters in Neuroscience.</a> Frontiers in Neuroinformatics. 10, 17(2016).</li>
<li>Gal, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rich+cell-type-specific+network+topology+in+neocortical+microcircuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rich cell-type-specific network topology in neocortical microcircuitry.</a> Nature Neuroscience. 20, 1004-1013 (2017).</li>
<li>Thomson, A. M., West, D. C., Wang, Y., Bannister, A. P. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/cercor/article/12/9/936/383201">Synaptic connections and small circuits involving excitatory and inhibitory neurons in layers 2-5 of adult rat and cat neocortex: triple intracellular recordings and biocytin labeling in vitro.</a> Cerebral Cortex. 12, 936-953 (2002).</li>
<li>Mercer, A., West, D. C., Morris, O. T., Kirchhecker, S., Kerkhoff, J. E., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+connections+made+by+presynaptic+cortico-cortical+pyramidal+cells+in+layer+6+of+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Excitatory connections made by presynaptic cortico-cortical pyramidal cells in layer 6 of the neocortex.</a> Cerebral Cortex. 15, 1485-1496 (2005).</li>
<li>West, D. C., Mercer, A., Kirchhecker, S., Morris, O. T., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer+6+cortico-thalamic+pyramidal+cells+preferentially+innervate+interneurons+and+generate+facilitating+EPSPs%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Layer 6 cortico-thalamic pyramidal cells preferentially innervate interneurons and generate facilitating EPSPs.</a> Cerebral Cortex. 16, 200-211 (2006).</li>
<li>Bannister, A. P., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+properties+of+excitatory+synaptic+connections+involving+layer+4+pyramidal+cells+in+adult+rat+and+cat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Dynamic properties of excitatory synaptic connections involving layer 4 pyramidal cells in adult rat and cat neocortex.</a> Cerebral Cortex. 17, 2190-2203 (2007).</li>
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<li>Mercer, A., Botcher, N. A., Eastlake, K., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SP-SR+interneurones%3A+a+novel+class+of+neurones+of+the+CA2+region+of+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">SP-SR interneurones: a novel class of neurones of the CA2 region of the hippocampus.</a> Hippocampus. 22 (8), 1758-1769 (2012).</li>
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<li>Somogyi, P., Takagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+note+on+the+use+of+picric+acid-paraformaldehyde-glutaraldehyde+fixative+for+correlated+light+and+electron+microscopic+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A note on the use of picric acid-paraformaldehyde-glutaraldehyde fixative for correlated light and electron microscopic immunocytochemistry.</a> Neuroscience. 7, 1779-1783 (1982).</li>
<li>Hughes, D. I., Bannister, A. P., Pawelzik, H., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+immunofluorescence%2C+peroxidase+labelling+and+ultrastructural+analysis+of+interneurones+following+prolonged+electrophysiological+recordings+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Double immunofluorescence, peroxidase labelling and ultrastructural analysis of interneurones following prolonged electrophysiological recordings in vitro.</a> Journal of Neuroscience Methods. 101, 107-116 (2000).</li>
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<li>Blackman, A. V., Grabuschnig, S., Legenstein, R., Sjöström, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+manual+neuronal+reconstruction+from+biocytin+histology+or+2-photon+imaging%3A+morphometry+and+computer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">A comparison of manual neuronal reconstruction from biocytin histology or 2-photon imaging: morphometry and computer modeling.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 8, 65(2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Le registrazioni elettrofisiologiche in vitro (Figura 1 Ac,d e Bc, d) combinato con istochimiche e immunohistochemical le procedure consentono la morfologia dettagliata, il contenuto proteico di calcio associazione e identità di adulti interneuroni corticali registrata per essere rivelato. Nella regione CA2, questa tecnica ha permesso lo studio dei circuiti locali per la prima volta e ha rivelato le sottoclassi di interneuroni che precedentemente non erano stato descritto in CA1 o CA3: cellule di arbor ampio dentritici ed axonal Cestino (Figura 1B), le cellule bistratified e interneuroni SP-SR.
Il protocollo descritto qui è stato ottimizzato per preservare l'ultrastruttura dei neuroni e ottenere eccellente recupero di entrambi (tra cui delle spine dendritiche) e pergole assonale. Fasi critiche include l'uso della tecnica doppia fissazione per aumentare il contrasto per microscopia chiara26 e l'aggiunta di glutaraldeide e acido picrico soluzione alla soluzione fissante per migliorare la penetrazione dell'anticorpo e preservare il neuronale ultrastruttura27. Dolce gelo-disgelo permeabilizzazione dà migliore conservazione della struttura fine, mentre osmicate e resina incorporamento ridurre il restringimento del piano z28. Inoltre, la visualizzazione di strutture molto belle (belle ad esempio gli assoni con piccolo boutons) è migliorata incubando le sezioni con H2O2 e NaBH4 per ridurre la colorazione di fondo. Contrasto può essere aumentato anche con l'aggiunta di Burundi,2 per la reazione di HRP.
La procedura istologica dettagliata qui offre ottimi risultati in termini di riproducibilità e affidabilità. Tuttavia, la durata delle registrazioni elettrofisiologiche determinerà la qualità della colorazione, con brevi registrazioni connesse solitamente con scarsa colorazione axonal biocitina/fluorescenza. La scelta di registrazione protocolli (registrazioni intracellulari usando degli elettrodi affilati vs cellule intere patch di bloccaggio) può anche influenzare biocitina conservazione e preservazione dell'anatomia bene.
Mentre le difficoltà incontrate nel preservare la struttura fine durante la lavorazione istologiche descritte qui e il tempo necessario per ricostruire a 100 ingrandimenti (1-4 settimane a seconda della complessità dell'assone) sono apprezzate, questo metodo dà un rappresentazione accurata dei diametri dentritici ed axonal. L'uso di meno esigenti protocolli per rivelare l'etichettatura biocitina è comprensibile, tuttavia, questi spesso preclude visualizzazione chiara dei rami axonal bene. Detergenti, per favorire l'ingresso di avidina-HRP a rivelare la biocitina e anticorpi, sono spesso necessari in sezioni spesse, ma possono interferire con struttura fine. Neuroscienziati cerca costantemente per semiautomatiche metodi di ricostruzione, ma, per ora e per gli assoni soprattutto, biocitina-HRP con ricostruzione manuale rimane il gold standard31.
Altamente dettagliate ricostruzioni neuronale, soprattutto i disegni precisi dei boutons axonal e nodi, la presenza o assenza di mielina e più in generale, il disegno di arbor axonal completa, con la rappresentazione di assone-diametro preciso cambia lungo il lunghezza, fornire ulteriori informazioni per l'identificazione precisa di un tipo distinto di interneurone. Anche se molti interneuroni non rientrano esattamente in una determinata classe, la tecnica sopra descritta fornisce dati correlati sulle proprietà elettrofisiologiche neuronale, la plasticità a breve termine associato a un tipo specifico di connessione e dettagliate ricostruzioni di un neurone, permettendo lo schema elettrico, nella regione CA2, ad esempio, di essere studiato in dettaglio.
Struttura bella, dettagliata è spesso semplificata in modelli computazionali. Mentre è comprensibile, questo comporta la perdita delle informazioni che potrebbero rivelarsi fondamentale in futuro. Analisi di dettagliate ricostruzioni 3D con paralleli sinaptici dati permetterà l'aggiunta di ulteriori criteri di classificazione interneuronale. Dati possono essere depositati in archivi pubblici e utilizzati dai modellisti per esplorare il risultato dei cambiamenti sporadici di diametro dell'assone e myelination sulla propagazione del potenziale d'azione informaticamente.

La corteccia e nell'ippocampo sono strutture di tale complessità che la classificazione di un neurone sottotipi1,2,3,4, mappe delle connessioni tra loro5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 e come questo circuito supporta funzioni cognitive12,13,14,15 sono ancora in fase di intenso studio e oggetto di continuo dibattito. Ad esempio, per capire i dettagli e le complessità dei circuiti e di coordinare i dati ottenuti da diversi studi, è estremamente utile essere in grado di definire e descrivere i componenti, ma rimane una questione di dibattito come molti differenti classi di neuroni esiste, o anche se è possibile definire tutti i neuroni come appartenenti a una classe specifica. Strumenti di calcolo che possono costruire e collaudare i circuiti con diversi gradi di complessità sono essendo sviluppato16,17,18, ma centrale di questi sforzi è la necessità di studi dettagliati dei tipi cellulari e delle proprietà delle connessioni tra loro. Una grande quantità di informazioni sui circuiti locali della neocorteccia dei ratti adulti sono già stati raccolti utilizzando il protocollo descritto qui10,19,20,21, 22. anche se lo "schema elettrico" è lungi dall'essere completo, alcuni chiari schemi o regole sono emerse. Inoltre, anche se alcuni dettagli possono variare, queste regole sono comuni due specie di mammiferi (gatto e topo) e da altra parte parecchie regioni neocorticali, permettendo lo sviluppo di blocchi predefiniti di base che sono suscettibili di essere ugualmente applicabile a neocortex umano. La tecnica qui descritta è utilizzata per estendere la nostra comprensione della mappa funzionale dei circuiti corticali identificando i neuroni presinaptici e postsinaptici coinvolti nelle connessioni nelle regioni che non sono state studiate in dettaglio prima, utilizzando un protocollo che permette di tessuto eccellente conservazione e recupero notevole colorazione nel tessuto del cervello adulto. Dati sulle proprietà neuronali in questo sottocampo e il circuito di locale in CA2 sono stati raccolti con questo metodo combinando le registrazioni elettrofisiologiche intracellulari (registrazioni accoppiate con taglienti microelettrodi) con biocitina riempimento, immunofluorescenza, procedure istologiche e altamente dettagliate ricostruzioni neuronale, permettendo un confronto diretto con le vicine CA regioni23,24,25.
La tecnica descritta in questo articolo è stata sviluppata nel corso degli anni per ottenere dettagliata anatomia di un neurone permettendo la corretta classificazione delle cellule e di alta qualità e accurate ricostruzioni di entrambi loro dentritici ed axonal pergole, dati che possono essere correlato con dati elettrofisiologici raccolti da registrazioni accoppiate usando degli elettrodi affilati. Il protocollo istologico è stato ottimizzato per preservare l'ultrastruttura dei neuroni e ottenere eccellente recupero di entrambi (tra cui delle spine dendritiche) e pergole assonale. Ad esempio, il principio della tecnica doppia fissazione in primo luogo immergendo in una soluzione fissante e in secondo luogo post-fissazione in tetrossido di osmio dà un buon contrasto per microscopia chiara26. Una piccola quantità di soluzione di acido picrico e glutaraldeide vengono aggiunti alla soluzione fissante per migliorare la penetrazione dell'anticorpo e preservare l'ultrastruttura delle cellule come suggerito in un precedente studio27. La permeabilizzazione delle fette del cervello utilizzando il metodo di congelamento-scongelamento combinato con cryo-protezione con saccarosio, piuttosto che un detersivo tradizionale, fornisce anche una conservazione ottimale dei tessuti per dettagliate analisi morfologica delle cellule registrate. Inoltre, la visualizzazione in particolare di strutture molto belle è migliorata riducendo la colorazione di fondo, con le incubazioni con perossido di idrogeno (H2O2) e sodio boroidruro (NaBH4). L'aggiunta di cloruro di nichel (Burundi2) per la perossidasi di rafano (HRP) reazione per ottenere un prodotto di reazione di pigmento nero aumenta anche il contrasto.
Il seguente protocollo descrive le procedure per accertare la conservazione dei tessuti eccellenti e altamente dettagliate ricostruzioni 3D neuronale dopo registrazioni intracellulari in vitro. La descrizione della preparazione fetta, intracellulare accoppiate registrazioni utilizzando sharp elettrodi e successive procedure istologiche utilizzate nel nostro laboratorio sono stati precedentemente segnalati28. Sebbene il protocollo si applica alla celle riempite intracellulare con biocitina in fette spesse di 450 – 500 μm, può essere utilizzato lo stesso protocollo seguito cellule intere registrazioni. Tuttavia, l'uso delle fette più sottili si tradurrà in meno complete ricostruzioni delle cellule.

<table><tbody><tr><td>Anticorpo dell'acido avidina-7-ammino-4-metilcumarina-3-acetico (Avidin-AMCA) - 20,8 mg/mL&nbsp;</td><td>Laboratori vettoriali</td><td>A2008</td><td></td></tr><tr><td>Biocitina&nbsp; &ge; 98% (TLC)</td><td>Sigma</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>3,5 diaminobenzidina (DAB) compresse, Per preparare 5 mL</td> di resina epossidica <td>Sigma</td><td>D4293</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan A</td><td>Sigma</td><td>44611</td><td></td></tr><tr><td>Resina epossidica Durcupan B</td><td>Sigma</td><td>44612</td><td></td></tr><tr><td>Resina epossidica Durcupan C</td><td>Sigma</td><td>44613</td><td></td></tr><tr><td>Resina epossidica Durcupan D</td><td>Sigma</td><td>44614</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo, purizzato. p.a., assoluto, &ge; 99,8%</td> <td>Sigma</td><td>32221</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma</td><td>48723</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di glutaraldeide, grado I, 25 % in H2O</td><td>Sigma</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo, &ge; 99%&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Isotiocianato di fluoresceina anti-topo di capra (FITC)- 14,3 mg/mL</td><td>Sigma</td><td>F2653</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-coniglio Texas Red (TR)- 3,3 mg/mL</td><td>Invitrogen</td><td>T2767</td><td></td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno, soluzione al 30%</td><td>Sigma</td><td>H-1009</td><td></td></tr><tr><td>Olio da immersione, viscosità 1.250 cSt (lett.)</td><td>Sigma</td><td>I0890</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di nichel (NiCl2 . 6H2O)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>N5756</td><td></td></tr><tr><td>Tetrossido di osmio, per microscopia elettronica, 4% in H2O&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide, grado reagente, cristallino&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Acido picrico, inumidito con acqua, &ge; 98%</td><td>Sigma</td><td>197378</td><td></td></tr><tr><td>Tampone fosfato 1 M</td><td>Sigma</td><td>P3619</td><td></td></tr><tr><td>Ossido di propilene (C3H6O), 99%</td><td>Alfa Aesar&nbsp;</td><td>30765</td><td></td></tr><tr><td>Tetraidroborato di sodio</td><td>VWR</td><td>27885.134</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Fisher scientific</td><td>S/8600/53</td><td></td></tr><tr><td>Trizma cloridrato, &ge; 99.0%</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base, &ge; 99,9%</td> <td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Antifade Montaggio Medio, , indice di rifrazione 1,45&nbsp;</td><td>Vector laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC HRP kit</td><td>Vector laboratories</td><td>PK6100</td><td></td></tr><tr><td>Attrezzatura utilizzata&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Agar Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C4A Planchette in alluminio a coppa&nbsp;</td><td>GA-MA & ASSOCIATI, INC.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Leica DMR&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-Cite 120PC Q Sorgente luminosa a fluorescenza</td><td>Excelitas Technologies&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera per microscopio digitale Leica DFC450&nbsp;</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penna da disegno tecnica Rapidograph 0,18 mm&nbsp;</td><td>London graphics centre</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pennino rapidograph da 0,18 mm</td><td>London graphics centre</td><td></td><td></td></tr><tr><td>penna da disegno tecnico Rapidograph 0,25 mm&nbsp;</td>Centro <td></td><td></td><td>grafico di Londra</td></tr><tr><td>Pennino rapidograph da 0,25 mm</td><td>Centro</td><td></td><td></td>grafico di Londra</tr><tr><td>Sistema Neurolucida che include workstation PC, palco, telecamera e joystic per il controllo di scena XYZ</td><td>Microbrighfield (MBF) Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida versione software 2017</td><td>Microbrighfield (MBF) Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CorelDRAW graphics Suite X5</td><td>Corel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software di editing video&nbsp;</td><td>Adobe Premiere Pro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiale di vetro 14 ml</td><td>Fisher scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

recupero di biocitina e ricostruzioni 3d di interneuroni riempito hippocampal ca2

Biocytin Recovery and 3D Reconstructions of Filled Hippocampal CA2 Interneurons

Come attività di rete corticale elabora informazioni sono di importanza per un gran numero di domande scientifiche di base e cliniche. Il protocollo descritto qui identifica i componenti di base di questo circuito. Studi approfonditi di regioni corticali in definitiva fornirà altri scienziati con i componenti del circuito necessaria per la comprensione di come il cervello acquisisce, elabora e memorizza le informazioni e ciò che va storto nella malattia, mentre l'elettrofisiologici e sui dati morfologici sono ampiamente utilizzati dai neuroscienziati computazionali nella costruzione di reti di modello che esplorano l'elaborazione delle informazioni. Il protocollo descritto qui descrive come cellule piene di biocitina registrate nella regione CA2 dell'ippocampo sono recuperate e poi ricostruite in 3D. Inoltre, il protocollo descrive la dimostrazione della proteina obbligatoria del calcio o peptide contenuto in interneuroni registrati.

Neuroni hippocampal CA2 erano pieni di biocitina seguito registrazioni elettrofisiologiche (figure 1Ac, annuncio e 1Bc, Bd). Le fette sono state fissate a seguito durante la notte le registrazioni e la neurochimica e caratterizzazione morfologica dei neuroni sono stati rivelati seguendo il protocollo descritto qui.
La proteina obbligatoria del calcio o il contenuto proteico di interneuroni riempiti è stata determinata incubando le fette prima con gli anticorpi primari e poi con gli anticorpi secondari coniugati fluorescente. Le caratteristiche di cottura di interneuroni durante le registrazioni a dettare la scelta di anticorpi primari utilizzati. Avidina-AMCA è stato usato per prevedere l'interneurone biocitina-riempito e anti-topo isotiocianato di fluoresceina (FITC) e capra anti-coniglio Texas Red (TR) era usate per caratterizzare la neurochimica interneuronale (Figura 1 BB).
Dopo la visualizzazione di fluorescenza, un protocollo HRP è stato usato per rivelare la biocitina (Figura 1Ab). Anatomia dettagliata bene di interneuroni CA2 quindi è stato disegnato in 3D utilizzando un software di ricostruzione del neurone (Figura 2 e Figura 3a). Un video di una ricostruzione 3D di una cellula di cesto registrata e riempito in CA2 viene visualizzato a Video. Ricostruzioni di un neurone sono stati considerati come completa se entrambe le pergole dentritici ed axonal furono confinati all'interno della profondità della fetta 450-500 μm. Povero arbor axonal macchiatura è stata valutata la presenza di rami troncati con finali aperti nella parte superiore o parte inferiore della sezione o da una colorazione che è stata limitata al segmento iniziale dell'assone e rami molto prossimale. Figura 4 rappresenta gli esempi di una buona e una povera HRP colorazione seguente visualizzazione biocitina.
L'analisi morfometrica di ricostruzioni 3D (Figura 3) possono essere effettuata per dimostrare la complessità di ramo, soma superficie e la superficie e il volume delle pergole dentritici ed axonal.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58592/58592fig1.jpg"> Figura 1 : Un neurone ricostruzioni di due tipi di cellule del cestino registrata e riempito nella regione hippocampal CA2 e correlato dati elettrofisiologici ottenuti seguendo le registrazioni intracellulari in vitro. Questa figura è stata modificata da precedenti studi23,24. COSÌ Stratum Oriens, SP Stratum Pyramidale, SR strato radiato, SLM Stratum Lacunosum molecolare. (A), Aa: ricostruzione di una cella di cesto CA2 con limitato arbor dentritici ed axonal, utilizzando un tubo di disegno (1000 X). I dendriti sono in nero, e l'assone è in rosso. AB: Immagine della cella cesto pieno di biocitina seguendo il protocollo di avidina-HRP descritto qui. AC: Rappresentanza traccia delle risposte di tensione a hyperpolarizing e depolarizzando iniezione corrente di una cella di cesto CA2 con limitato arbor dentritici ed axonal. Annuncio: Esempio di una piramide di CA2 per restringere le connessioni arbor canestro cella registrato utilizzando degli elettrodi affilati. Composito potenziale post-sinaptico eccitatorio (EPSP) medie mostrano treno breve depressione apparente durante le risposte ai treni di tre punte. (B) Ba: ricostruzione 2D di una cella di cesto CA2 con ampia dentritici ed axonal pergole utilizzando un tubo di disegno (1000 X). L'albero dendritico di questa cella cesto (in nero) esteso radialmente attraverso tutti gli strati della regione CA2 e orizzontalmente in SO e SP delle regioni CA2 e CA3. Un dendrite orizzontale raggiunto anche la regione CA1. L'assone (in rosso) esteso alle regioni CA3 e CA1. BB: La piena di biocitina (AMCA macchiatura) canestro cella era PV-immunopositive (FITC colorazione) e CB-immunonegative (colorazione rosso-Texas). BC: Rappresentanza traccia delle risposte di tensione a hyperpolarizing e depolarizzando iniezione corrente di una cella di cesto CA2 con ampia dentritici ed axonal arbor. BD: Composito EPSP medie mostrano breve treno facilitazione apparente durante le risposte ai treni di tre punte. Esempi di altri tipi di interneuroni registrate in CA2 possono essere trovati in precedenti studi25,30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/58592fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58592/58592fig2.jpg"> Figura 2 : Ricostruzione 3D delle cellule del corpo. (A) l'analisi 3D del corpo cellulare. Vista dei contorni diversi tracciati a posizioni diverse z mentre messa a fuoco attraverso il corpo cellulare. (B) vista 3D dei contorni diversi. (C) vista 3D del corpo delle cellule ad un angolo differente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/58592fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58592/58592fig3.jpg"> Figura 3 : Analisi di morfometria di ricostruzioni 3D di un neurone. (A) ricostruzione 3D di una cellula di cesto stretto arbor CA2. Ogni ramo dendritica è rappresentato da un colore (verde, blu, rosso e rosa) e dell'assone è in azzurro. (B) dendrogramma della cella cesto che rappresenta il numero delle ramificazioni dendritiche e la lunghezza di ogni segmento contenuta all'interno di sfere concentriche con il soma e a 100 μm intervalli dal soma. I colori il dendrogramma corrispondono a quelle di dendriti in a. (C) esempio di analisi morfometrica eseguita su cellule piramidali CA2 (adattate da un precedente studio23). Il numero delle ramificazioni dendritiche era tramato contro la distanza dal soma delle cellule piramidali CA2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/58592fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58592/58592fig4.jpg"> Figura 4 : Esempi di buona (A) e poveri (B) HRP macchiatura. (A) biocitina recupero ha rivelato un interneurone molto ben riempito in CA2. Il corpo delle cellule (CB) è macchiato scuro e ha contorni chiari. I dendriti sono in rilievo e visualizzate alcune spine (rappresentati da stelle rosse). L'arbor assonale (A) è denso e presenta piccole boutons. (B) esempio di un povero dentritici ed axonal macchiatura delle 2 cellule piramidali in CA2. La colorazione della CB è debole con nessun contorno chiaro. Povero di colorazione è spesso associato con più brevi registrazioni elettrofisiologiche, con conseguente presenza di pochissimi rami biocitina-riempito. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/58592fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> 
Video 1: 3D ricostruzione neuronale di una cella di cesto CA2 con limitato arbor dendritiche (noto anche come cellula di cesto stretto arbor CA2) con sua soma nel corneum pyramidale, dendriti che attraversa tutti gli strati e assone in CA2 corneum pyramidale e adiacente strato oriens e radiato. Molto pochi rami ha raggiunto la prossimale CA3 strato oriens e CA3 corneum pyramidale. Questa cella è stata riempita con biocitina seguito registrazioni elettrofisiologiche e sezioni sono stati elaborati con avidina-HRP seguendo il protocollo descritto qui. A causa di affettare, solo l'assone all'interno della profondità della fetta è stato recuperato, anche se i dendriti sono intatti. Dendriti sono in rosa scuro e assone in bianco. I limiti di strato e regione sono state aggiunte all'inizio del video. Ricostruzione 3D da video di Georgia Economides-3D da Svenja Falk. Il video è stato registrato con un software di ricostruzione del neurone come indicato nel passo 2.17 e modificato con un software di editing video. Link al video:30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/Figure_3.mp4" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo video.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Soluzioni utilizzate</td>
			<td>Composizione/istruzioni</td>
		</tr>
<tr>
<td>Soluzione di fissazione</td>
			<td>paraformaldeide al 4%, 0,2% saturi acido picrico soluzione, soluzione di glutaraldeide 0.025% in tampone fosfato 0,1 M (PB)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,1 tampone fosfato M a pH 7,6</td>
			<td>Aggiungere 100 mL di brodo 1 M fosfato tampone a 900 mL di acqua distillata</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampone fosfato salino (PBS) pH 7,4/7.5</td>
			<td>Aggiungere 10 mL di tampone fosfato 0.1M, 0,2 g di KCl e 8,76 g di NaCl a 990 mL di acqua distillata</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampone TRIS pH 7.5</td>
			<td>Sciogliere 5,72 g di Tris cloridrato e 1,66 g di Tris Base in 50 mL di acqua distillata. Quindi apportare fino a 1 L con acqua distillata.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Soluzione fissante glutaraldeide e paraformaldeide tamponata</td>
			<td>paraformaldeide al 4%, 0,2% saturi acido picrico soluzione, soluzione di glutaraldeide 0.025% in tampone fosfato 0,1 M.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Soluzione di ABC</td>
			<td>Soluzione da effettuarsi almeno 30 min prima dell'uso del kit di ABC. Aggiungere 1 goccia di soluzione A e 1 goccia di soluzione B a 2,5 mL di PBS.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Resina epossidica di Durcupan:</td>
			<td>Fare 20 vasi: 20 g di componente A, 20 g di componente B, 0,6 g di componente C e 0,4 g di componente D -</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Proteggere l'equilibrio da sversamenti accidentali di coprire la piastra con un cerchio di carta da filtro. Valutare attentamente i reagenti in un becher di tripour nelle proporzioni sopra indicato. Miscelare accuratamente agitando vigorosamente utilizzando due bastoni di legno per almeno 5 min. La miscela dovrebbe trasformarsi in un colore marrone scuro di densità uniforme. Porre il becher in forno a ~ 50 ° C per un massimo di 10 min per rimuovere come molte bolle di aria possibile. Nota: La resina inizia a curare se si lascia il bicchiere nel forno più di 10 min. decantare la resina in vasi di plastica o siringhe da 5 mL, datarle e riporre nel congelatore di-20 ° C pronto per l'uso.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Tabella delle soluzioni.

Il protocollo descritto qui descrive l'analisi di immunofluorescenza, biocitina recupero e ricostruzioni di alta qualità di hippocampal CA2 interneuroni seguendo le registrazioni elettrofisiologiche intracellulari in vitro, permettendo un neurone caratterizzazione e infine bene anatomia un neurone per essere studiato.

Recupero di biocitina e ricostruzioni 3D di interneuroni riempito Hippocampal CA2

How cortical network activity processes information is of importance to a large number of basic and clinical scientific questions. The protocol described ...

Questo metodo può aiutare a classificare i sottotipi neuronali ed estendere la nostra comprensione della mappa funzionale dei circuiti corticali. Questo protocollo è stato ottimizzato per preservare l'ultrastruttura dei neuroni e ottenere un eccellente recupero di pergolati dendritici e assonali, consentendo ricostruzioni di alta qualità. Al termine di una registrazione elettrofisiologia, trasferire la fetta contenente la cella registrata in un piccolo piatto di ACSF.Mentre si lavora in una cappa aspirante, arrotolare la fetta su un piccolo pezzo di carta da filtro di alta qualità e posizionare un altro pezzo di carta filtrante inumidita sulla fetta. Mettere il tessuto in una piccola pentola di plastica contenente da 5 a 10 millilitri di soluzione fissante e conservare a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, trasferire il tessuto dal contenitore con soluzione fissante in un contenitore con due millilitri di tampone di fosfato molare 0,1 per risciacquare e tagliare qualsiasi tessuto in eccesso con una lama bisturi.Rimuovere il tessuto in eccesso posizionando la fetta in una piastra di Petri e tagliare il tessuto in eccesso con una lama bisturi. Trasferire il tessuto tagliato in una piastra di Petri pulita, assicurandosi che giace piatto senza pieghe o pieghe. Rimuovere il tampone in eccesso utilizzando un pennello asciutto.Coprire il tessuto con una soluzione di gelatina calda e posizionare la piastra di Petri su un blocco congelato per raffreddare rapidamente la soluzione. Quindi, spostare il piatto di impostazione della gelatina a 4 gradi Celsius per 30-60 minuti. In una cappa aspirante, utilizzare una lama bisturi per tagliare un piccolo blocco di 1 X 1 centimetro contenente il tessuto incorporato di gelatina.Sollevare il blocco utilizzando una piccola spatola e trasferirlo con cura in una soluzione fissante fresca. Lasciare fissare per almeno 30 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo questa seconda fissazione, lavare il blocco di gelatina in cinque millilitri di PB tre volte.Dopo il lavaggio, asciugare il blocco usando un pezzo di tessuto di carta. Quindi utilizzare una piccola quantità di colla cianoacrilato per attaccare il blocco, orientato con il tessuto nella parte superiore, su un camion vibratomo usando super colla. Sezionare la fetta con uno spessore di 50 micron utilizzando un vibratomo e posizionare accuratamente ogni sezione in una fiala di vetro contenente il 10% di saccarosio.Dopo aver sessato, raccogliere con cura una sezione dal flaconcino e posizionarla piatta in un coperchio della piastra di Petri. Quindi utilizzare una lama di bisturi fresca per rimuovere la gelatina da tutta la sezione. Mettere le sezioni in una fiala contenente 2 millilitri di saccarosio fresco al 10% in PB e agitare per 10 minuti per iniziare il processo di crioprotezione.Dopo la crioprotezione, posizionare le sezioni piatte su un piccolo rettangolo di foglio di alluminio utilizzando un pennello. Rimuovere il liquido in eccesso dalle sezioni e piegare con cura il foglio in un pacco. Tenere il foglio di alluminio vicino alla superficie dell'azoto liquido senza toccare la superficie per 30 secondi.E poi lasciare che le sezioni si scongelino completamente per circa 30 secondi. Ripetere il congelamento scongelare altre due volte. Rimuovere tutte le sezioni dal foglio con un pennello e posizionarle in una fiala di vetro contenente due millilitri di PB per lavare via il saccarosio in eccesso sotto costante agitazione.Dopo l'immunosottenzione per l'imaging a fluorescenza, posizionare lo scivolo in una piastra di Petri di vetro contenente PBS e rimuovere con cura lo scivolo di copertura. Quindi lavare le sezioni dallo scivolo utilizzando delicati impulsi di PBS da una pipetta Pasteur. Posizionare le sezioni in una fiala di vetro pulita contenente PBS.Eseguire la reazione HRP di Avidin incubando prima le sezioni nel complesso di biotina di Avidin o ABC, per almeno due ore per amplificare il prodotto di reazione HRP. Quindi, lavare le sezioni con PBS 3 volte per 10 minuti, quindi con tris buffer due volte per 10 minuti. Dopo aver rimosso l'ultimo lavaggio tampone tris, aggiungere rapidamente una goccia di soluzione di cloruro di nichel all'otto per cento alla soluzione di diaminobenzidina o soluzione DAB.Quindi pipettare la soluzione in uscita per mescolare e aggiungere rapidamente un millilitro di questa soluzione sulle sezioni. Incubare le sezioni in questa soluzione per 15 minuti. Quindi aggiungere 10 microlitri di perossido di idrogeno all'1% alla soluzione DAB.Lasciare che la reazione proceda al buio sotto agitazione costante per circa uno o due minuti fino a quando le cellule non sono etichettate. In una cappa aspirante, posizionare un piccolo cerchio di carta da filtro in una piastra di Petri e smorzarlo con PB. Sollevare le sezioni una alla volta dal flaconcino di vetro utilizzando un pennello e posizionarle con cura piatte sulla carta. Coprire le sezioni con un altro cerchio inumidito di carta da filtro e rimuovere il tampone in eccesso toccando delicatamente la carta velina in superficie.Applicare otto o nove gocce di tetrossido di osmio dell'uno per cento in PB sulla carta superiore. Coprire il piatto e conservare nel cappuccio dei fumi per almeno 30 minuti, ma non più di 1 ora. Dopo aver risciacquato, montato e copreto le sezioni, disidratare attraverso una serie di soluzioni al 50%, 70%, 95% e 100% di alcol.Dopo la fase di disidratazione, trasferire le sezioni in una fiala di vetro contenente etanolo al 100% su uno shaker per circa cinque minuti. Sostituire la soluzione alcolica con ossido di propilene e lavare tre volte per cinque minuti. Dopo l'ultimo lavaggio, tenere circa due millilitri di ossido di propilene nel flaconcino e aggiungere resina a un rapporto 1:1.Assicurarsi che la resina sia sciolta e mantenere le sezioni sotto agitazione costante per 30 minuti. Dopo 30 minuti, utilizzare un bastoncino di legno per posizionare ogni sezione in una planchetta di alluminio contenente resina epossidica e incubare durante la notte. Il giorno successivo, posizionare la planchette su una piastra calda per circa 10 minuti.Quindi raccogliere ogni sezione con un bastone di legno e posizionare su uno scivolo pulito. Una volta che tutte le sezioni sono state trasferite sulla diapositiva, visualizzare la diapositiva sotto un microscopio sezionante per controllare l'orientamento delle sezioni e posizionare un coverslip sulle sezioni. Curare in forno per 48 ore a 56 gradi Celsius.Usa un obiettivo di ingrandimento basso per concentrarti sulla sezione home contenente il corpo cellulare. Quindi usa un obiettivo 100x, concentrati sul corpo della cella e fai clic al centro per contrassegnare il punto di riferimento. Per tracciare il soma in 3D usando l'obiettivo 100x, selezionare il contorno dalla scheda traccia e selezionare il contorno del corpo della cella.Usa il joystick per spostare la messa a fuoco nella parte superiore del corpo cellulare. Posizionare i punti facendo clic sul perimetro della parte attualmente a fuoco. Fate clic con il pulsante destro del mouse e selezionate Chiudi contorno (Close Contour) per completare questo primo contorno.Ripetere questo processo in diverse posizioni z fino a raggiungere la parte inferiore del corpo cellulare. Per rintracciare l'arbor dendritico, selezionare dendrite o dendrite apicale, nel menu neuronale. In primo luogo, tracciate un breve segmento iniziale per ogni dendrite utilizzando la rotellina di scorrimento del mouse per regolare il diametro del cursore in modo che corrisponda al diametro della dendrite.Traccia lungo ogni dendrite. Quando viene raggiunto un nodo nell'albero, fare clic con il pulsante destro del mouse e scegliere nodo biforcazione o nodo di triforcazione dal menu a discesa. Per identificare i punti corrispondenti tra i dendriti in una sezione che corrispondono alla sezione completata, fare clic sulla scheda Sposta e selezionare i punti di corrispondenza.Selezionare il numero di punti da abbinare e quindi premere OK. Fare clic sulla fine di un ramo completato e quindi fare clic sul ramo. Ripetere questa situazione per ogni punto di corrispondenza. Una volta tracciati tutti i dendriti di ogni sezione, tracciare l'assone usando lo stesso processo Mostra qui una ricostruzione di una cella cestello CA2 con pergolato dendritico e assonale limitato utilizzando un tubo di disegno.I dendriti sono in nero e l'assone è in rosso. Questa è un'immagine di esempio della cellula del cestello riempita di biocitina seguendo il protocollo HRP di Avidin descritto qui. Ecco un video di una ricostruzione neuronale 3D della cellula cesto CA2.I dendriti sono in rosa scuro e l'assone è in bianco. Infine, questa immagine mostra un dendrogramma della cella del cestello CA2. Ci sarà bisogno di tempo per diventare abili con questo protocollo.Tuttavia, questo approccio ottimizzato può generare immagini ad alta risoluzione di strutture corticali e ippocampali complesse in vitro.

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Questo video mostra il processo di visualizzazione di un interneurone pieno di biocitina in una sezione ippocampale di ratto, evidenziando la sua identità neurochimica attraverso l'uso di anticorpi specifici e la microscopia a fluorescenza.

Immunocolorazione degli interneuroni in una sezione ippocampale di ratto

Questo video mostra la procedura per colorare fette fisse di cervello di ratto contenenti interneuroni pieni di biocitina. Il protocollo include l'incubazione con il complesso avidina-biotina (ABC), la colorazione con HRP e substrato cromogenico, la conservazione delle strutture con tetrossido di osmio e l'inclusione del tessuto nella resina per l'imaging.

Marcatura di interneuroni riempiti di biocitina in fette di ippocampo di ratto per la visualizzazione

Per comprendere la struttura delle reti neuronali, caratterizzazione funzionale e morfologica dei singoli neuroni è una necessità. Qui, dimostriamo etichettatura juxtasomal biocitina, che permette registrazioni elettrofisiologiche nella configurazione extracellulare, pur mantenendo la capacità di etichettare intracellulare neurone per la ricostruzione post-hoc di dendritiche e dell'architettura assonale.

Juxtasomal biocitina Etichettatura per studiare la struttura-funzione relazioni dei singoli neuroni corticali

Reti corticali sono controllati da un piccolo, ma diverso insieme di interneuroni inibitori. Indagine funzionale degli interneuroni richiede quindi la registrazione mirata e l'identificazione rigorosa. Qui descritto è un approccio combinato che coinvolge le registrazioni whole-cell da coppie singole o sinapticamente-accoppiati di neuroni con etichettatura intracellulare, post-hoc analisi morfologica e immunocitochimica.

Whole-cell patch-clamp registrazioni da Morphologically- e neurochimico-identificati interneuroni dell&#39;ippocampo

Le colture a bassa densità di neuroni primari dell'ippocampo di solito richiedono uno strato di alimentazione della glia per fornire fattori neurotrofici e sostenere la longevità. Descriviamo qui un metodo semplificato per coltivare neuroni a bassissima densità su vetrini coprioggetti in presenza di uno strato di alimentazione neuronale ad alta densità, che facilita lo studio di specifici meccanismi neuronali-autonomi.

Un metodo semplificato per Ultra-Low Density, Long-Term primaria ippocampale Neuron Cultura

Questo protocollo presenta un metodo per il recupero morfologica dei neuroni rattoppati durante le registrazioni elettrofisiologiche utilizzando riempimento biocitina e successiva postprocessing immunoistochimica. Abbiamo dimostrato che spesse sezioni biocitina-riempita che erano macchiate e coprioggetto possono essere ricolorate con un secondo giorni di anticorpi primari o mesi dopo.

Immunocolorazione delle sezioni biocitina-riempite e trasformati per neurochimici Marcatori

Presentiamo un metodo che unisce le registrazioni della intero-cellula patch-clamp e due-fotone imaging per registrare transitori di Ca2 + nei dendriti neuronali nelle fette del cervello acuto.

Imaging del due-fotone calcio nei dendriti neuronali nelle fette del cervello

Qui presentiamo protocolli per la preparazione di fette cerebrali acute contenenti il nucleo genetico laterale e l'indagine elettrofisiologica della funzione sinapsi retinogenica e corticogena. Questo protocollo fornisce un modo efficiente per studiare le sinapsi con la probabilità ad alto rilascio e basso rilascio nelle stesse fette cerebrali acute.

Indagini elettrofisiologiche sulla funzione di sinapla Retinogeniculate e Corticogeniculate

Presentiamo un protocollo per preparare fette acute dall'ippocampo dorsale-intermedio dei topi. Confrontiamo questa preparazione trasversale con l'affezione coronale in termini di qualità delle registrazioni e conservazione delle caratteristiche morfologiche dei neuroni registrati.

Preparazione di fette acute dall'ippocampo dorsale per la registrazione a cellule intere e la ricostruzione neuronale nel giro dentato di topi adulti

Qui presentiamo un protocollo che descrive la trasduzione virale di regioni cerebrali discrete con costrutti optogenetici per consentire la caratterizzazione elettrofisiologica sinaptico-specifica in fette acute di cervello di roditori.

Ex Vivo Interrogazione optogenetica della trasmissione sinaptica a lungo raggio e della plasticità dalla corteccia prefrontale mediale alla corteccia entorinale laterale

La combinazione della trasduzione del vettore virale e della compensazione del cervello utilizzando il metodo CLARITY consente lo studio di un gran numero di neuroni e astrociti contemporaneamente.

Indagine sull'interazione spaziale tra astrociti e neuroni nel cervello eliminato

Scopri il recupero di biocitina e le ricostruzioni 3D di interneuroni ippocampali CA2. Questo metodo combina registrazioni elettrofisiologiche e immunofluorescenza per preservare l'ultrastruttura neuronale e ottenere ricostruzioni morfologiche di alta qualità.

Recupero di biocitina e ricostruzioni 3D di interneuroni riempito Hippocampal CA2

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