Rilevamento di Tilapia Lago Virus mediante RT-PCR convenzionale e SYBR Green RT-qPCR

Benvenuti a tutti. Mi chiamo Win Surachetpong. Sono professore assistente presso la facoltà di microbiologia veterinaria e immunologia di medicina veterinaria presso l'Università kasetstart, thailandia.

Io e il mio team siamo specializzati in malattie virali emergenti in tilapia. Ora stiamo lavorando al virus del lago tilapia che causa un'elevata mortalità nella tilapia. Poiché la tilapia è la seconda specie ittico più importante che è la cultura in tutto il mondo, fornisce una fonte proteica per un milione di persone e svolge un ruolo importante per la sicurezza alimentare.

Quindi il recente focolaio del virus del lago tilapia causa un impatto socioeconomico che ha portato molti scienziati a cercare di trovare una soluzione a questo problema. Finora abbiamo bisogno di un metodo molto sensibile, rapido e accurato per rilevare il virus. In questo video, ti mostreremo passo dopo passo per rilevare il virus del lago tilapia nel tessuto ittico a partire dalla raccolta dei campioni, dalla popolazione campione e dall'analisi PCR in tempo reale.

In primo luogo, solubilizzare il sovradosaggio di olio di stoffa in acqua per eutanasiare il pesce. Mettere il pesce morto su un vassoio, sterilizzare l'apparecchiatura utilizzando il 95% di etanolo, quindi bruciare con un bruciatore di alcol. Tagliare lentamente il pesce dall'addome inferiore verso l'alto, per raccogliere il fegato.

Raccogliere parte del fegato in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri. La prima parte dell'estrazione dell'RNA deve essere eseguita in una cappa di flusso Laminare e indossare dispositivi di protezione. Aggiungere un millilitro di reagente di estrazione dell'RNA nel tubo.

Polverizzare il fegato usando un pestello tissutale in omogeneo. Aggiungere 200 microlitri di cloroformio nel tubo. Quindi, mescolare delicatamente invertendo il tubo più volte.

Mettere da parte per tre minuti a temperatura ambiente. Centrifuga a quattro gradi celsius a 12.000 RCF per 15 minuti. Raccogliere con cura i tubi dalla centrifuga.

Trasferire delicatamente 500 microlitri della fase acquosa superiore incolore in un nuovo tubo. Aggiungere un volume di isopropanolo nel tubo. Riscaldare a meno 20 gradi celsius per due ore o fino a durante la notte per far precipitare l'RNA.

Dopo l'incubazione, centrifugare la soluzione nella stessa condizione di centrifuga. Raccogliere i tubi dalla centrifuga, quindi scartare il supernatante. Il pellet di RNA può essere visto come puntato dalla freccia.

Aggiungere un millilitro di 75% di etanolo nel tubo per lavare il pellet di RNA e invertire più volte. Centrifuga a quattro gradi celsius, a 10.000 RCF per 15 minuti. Raccogliere i tubi dalla centrifuga, quindi scartare il supernatante.

Estraggono l'etanolo rimasto usando la pipetta automatica e asciugare all'aria a temperatura ambiente per cinque-10 minuti. Aggiungere da 30 a 60 microlitri RNasi acqua libera, preri warmed a 55-60 gradi celsius per solubilizzare il pellet di RNA. Utilizzare da uno a due microlitri di soluzione di RNA per misurare la concentrazione utilizzando uno spettrofotometro a micro volume.

I risultati verranno visualizzate sullo schermo. Diluire la concentrazione a 200 nanogrammi per microlitro utilizzando acqua libera da RNasi. Eseguire la sintesi cDNA utilizzando le sostanze chimiche e le condizioni elencate come segue.

Utilizzare un termociclo per convertire l'RNA in cDNA con le condizioni suggerite. Di seguito sono riportata le sostanze chimiche e le condizioni utilizzate per determinare il carico TiLV utilizzando PCR in tempo reale. Erogare sei millilitri del mix master qPCR in ogni flaconcino di tubo a nastro qPCR bianco.

Successivamente, quattro millilitri di campione di cDNA vengono caricati nel pozzo. In questa fase una nuova punta del tubo deve essere cambiata in ogni singolo pozzo, per evitare la contaminazione da campione a campione. Sigillare saldamente la striscia qPCR con un cappuccio trasparente per strisce qPCR.

Mescolare delicatamente la soluzione svolazzando su una punta della striscia. Quindi spin down usando la micro centrifuga per raccogliere tutto il liquido sul fondo dei vasi. Usa la condizione dei due gradini come mostrato nel video, seleziona il pozzo in 96 piastre di pozzo che utilizzerai.

Seleziona il cyber green come flora per la tintura. Selezionare sconosciuto come tipo di esempio e inserire un nome in una casella del nome di esempio. Aprire il coperchio di una macchina PCR in tempo reale e posizionare la striscia qPCR nel pozzo assegnato.

Quindi chiudi il coperchio. Eseguire la macchina con la condizione selezionata. La macchina inizierà e funzionerà dopo che il coperchio aveva raggiunto la temperatura desiderata.

Dopo la fine delle condizioni qPCR, viene visualizzata la curva di amplificazione. Qui, la freccia di velocità indica dove il livello di soglia si interrompe tra la fase esponenziale e la fase lineare che si traduce in valore CT. Il valore CT viene quindi estrapolato nel numero di copia del registro dei virus per calcolare un certo numero di virus che rimangono utilizzando la curva standard.

Il picco di fusione viene anche visualizzato per identificare se il virus rilevato da qPCR è, in effetti, TiLV in cui i picchi di fusione variano generalmente tra 79,5 e 80,5 gradi celsius. Quindi speriamo che questo metodo sia strumenti importanti per gli agricoltori e le organizzazioni di tutto il mondo, che potrebbero richiedere l'implementazione di un controllo e limitare la diffusione dell'infezione da TiLV.