Stima del numero di Nephron in rene intero utilizzando il metodo di macerazione acida

Il metodo di macerazione acida può aiutare a rispondere a domande chiave sul rene e su come geni specifici contribuiscono o influenzano lo sviluppo del nefro, nonché su come condizioni specifiche, come diabete o ipertensione, influenzano il numero di nefro. Questo è importante in quanto un numero totale di nefrroni con cui un individuo nato è determinato durante lo sviluppo fetale e la perdita di nefroni è stata associata a patologia renale. I principali vantaggi del metodo di macerazione acida sono che è più veloce, più riproducibile, economico e meno dispendioso in termini di tempo rispetto ad altri metodi di conteggio del nefro, come la risonanza magnetica.

Questa tecnica facilita la correlazione dell'impatto nel numero di nefro sulla funzione renale, che è importante per promuovere la nostra comprensione di come geni specifici influenzano la funzione e lo sviluppo del nefro. Lo studio di geni o fattori che influenzano il numero complessivo di nefro sarà determinante nello sviluppo di approcci farmacologici o genetici progettati per limitare la perdita di nefro associata alla malattia. Con una buona tecnica e pratica sperimentale, gli individui nuovi a questo metodo dovrebbero facilmente acquisire padronanza del metodo di macerazione acida consentendo stime affidabili e riproducibili di interi numeri di nefro renale.

Inizia usando forbici chirurgiche fini per aprire la cavità addominale del topo lungo la linea mediana. Spostare con cura l'intestino e l'adiposo riproduttivo sul lato destro dell'animale. Utilizzando la dissezione lorda, isolare il rene sinistro e tagliare l'arteria renale sinistra e la vena per rimuovere con cura il rene posizionando l'organo in una barca di pesatura appropriatamente etichettata di PBS.

Raccogliere il rene giusto nello stesso modo e posizionare entrambi i reni su una garza chirurgica pre-inumidita con PBS. Rimuovere rapidamente qualsiasi tessuto non renale aderente e le capsule renali. Quindi pesare ogni rene registrando individualmente il peso dell'organo sinistro e destro separatamente.

Dopo la pesatura, riposizionare ogni rene in una barca di pesatura adeguatamente etichettata senza PBS e utilizzare una lama di rasoio pulita per tagliare ogni organo a metà longitudinalmente. Posizionare ogni mezzo rene tagliato lateralmente e tagliare ogni metà in due millimetri o pezzi più piccoli. Utilizzando la stessa lama di rasoio, trasferire accuratamente i pezzi di rene tritati in un tubo conico da 15 millilitri opportunamente etichettato.

In una cappa fumi ben ventilata, aggiungere cinque millilitri di sei acido cloridrico molare ad ogni tubo. Successivamente, agitare delicatamente le miscele di acido renale prima di posizionare i tubi in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per 90 minuti. Al termine della macerazione acida, attaccare un ago calibro 18 a una siringa da cinque millilitri per rene e rimuovere con cura i pistoni della siringa.

Posizionare le siringhe in singoli tubi conici da 50 millilitri nella cappa dei fumi e versare le soluzioni renali all'estremità aperta di ogni siringa mettendo da parte i tubi vuoti in un rack della provetta. Quindi sostituire con cura i pistoni per la lenta estrusione di ogni soluzione attraverso gli aghi nei tubi da 50 millilitri. Lavare i tubi conici da 15 millilitri con cinque millilitri di soluzione PBS per tubo che ruota il PBS per solubilizzare qualsiasi tessuto renale rimanente.

Estrudere il contenuto del lavaggio nel tubo appropriato da 50 millilitri come appena dimostrato. Dopo aver estruso il terzo lavaggio, dotare ogni siringa di un ago calibro 21. Estrudere il contenuto dei tubi da 50 millilitri in un secondo set di tubi da 50 millilitri attraverso il lavaggio dell'ago di foro più piccolo ed estrudendo il primo contenuto di tubi da 50 millilitri tre volte con PBS fresco come dimostrato.

Dopo il terzo lavaggio ed estrusione, portare il volume totale in ogni tubo fino a 50 millilitri con PBS aggiuntivo e posizionare i tubi in un rack su una piastra rocker a quattro gradi Celsius durante la notte. Entro cinque giorni dall'elaborazione, posizionare una griglia contenente 16 sezioni separate sul fondo di sei pozzi di una piastra di 12 pozza. Invertire delicatamente i tubi della soluzione renale più volte per rimorsi i tessuti pelletti.

Aggiungere con cura tre aliquote da 500 microliter di ogni soluzione omogeneizzata per rene a ciascuno dei tre pozzi della piastra del pozzo 12. Diluire il contenuto di ogni pozzo con un volume uguale di PBS. Posizionare la piastra sul palco di un microscopio invertito.

Identificare i glomeruli per la loro struttura sferica, la tonalità rossastra e le arterie pre o post attaccate ai corpi dei singoli glomeruli. Contare il numero di glomeruli per ogni sezione grigliata per sommare il conteggio per griglia per il calcolo del numero totale di glomeruli per pozzo. Quindi moltiplicare il numero di glomeruli per pozzo per 100 per ottenere il numero medio di glomeruli per rene.

In questo esperimento rappresentativo, il numero totale di nefro nei topi infusi con il veicolo per 14 giorni è stato di circa 12.500 nefroni per rene. L'angiotensina, tuttavia, ha aumentato la pressione atriale di circa 40 millimetri di mercurio ed è stata associata a una significativa riduzione di quasi il 26% del numero totale di nefro. In questo modello genetico di agenesia renale del ratto, gli animali nati con due reni sono stati calcolati per contenere circa 27.500 nefrroni per rene dopo la macerazione acida come dimostrato, mentre i ratti nati con un rene solitario hanno un numero totale di nefroni significativamente inferiore.

Le stime di entrambi gli esperimenti erano coerenti con le gamme precedentemente riportate nei ratti. Il metodo di macerazione acida è ideale per stimare il numero di nefroni in reni interi, specialmente nei laboratori non dotati di tecniche più laboriose e proibitive per il conteggio dei nefroni, come il metodo del frazionatore disettore o la risonanza magnetica. Questo metodo consente una stima elevata della produttività, efficiente e riproducibile del numero intero di nefro renale che si trovano entro il 5% dei numeri determinati dalla risonanza magnetica.

La valutazione del numero di nefro è di rilevanza clinica in quanto il numero ridotto di nefroni è stato associato a un aumento del rischio di malattie cardiovascolari, come la malattia renale cronica. Non dimenticare che lavorare con acido cloridrico può essere estremamente pericoloso e che devono essere prese precauzioni, come indossare guanti, occhiali protettivi e un cappotto da laboratorio.