Name: Stima del numero di Nephron in rene intero utilizzando il metodo di macerazione acida (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Impara il metodo di macerazione acida per stimare il numero di nefroni nel rene intero. Questa tecnica rapida e riproducibile facilita lo studio dello sviluppo renale e delle malattie cardiovascolari.

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Questo lavoro è stato sostenuto in parte dagli istituti nazionali di salute, cuore nazionale, polmone, e Blood Institute (R01HL107632).

Le forniture e i reagenti elencati di seguito sono per la determinazione del numero di nefrone renale intero in un topo, cioè due reni. Le modifiche per l'uso del metodo di macerazione acida per ratto sono identificate con asterischi. Tutti i protocolli sperimentali sono conformi alla guida nazionale degli istituti di salute per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università del Mississippi Medical Center.
1. procedura di isolamento dei reni
<ol><li>Pesare il topo (o altre specie) ed eutanizzare con un isoflurano (5%-8%) sovradosaggio o pentobarbital (150 mg/kg di iniezione intraperitoneale).</li>
	<li>Una volta che il mouse è eutanizzato, aprire la sua cavità addominale utilizzando forbici chirurgiche sottili lungo la linea mediana.</li>
	<li>Sollevare con cautela l'intestino e l'adiposo riproduttivo sul lato destro della cavità addominale. Per dissezione lorda, isolare il rene sinistro. Utilizzando forbici chirurgiche fini, tagliare l'arteria renale sinistra e la vena e rimuovere con cautela il rene sinistro, mettendo il rene in un opportunamente etichettato (numero del mouse/identificatore) barca di pesatura contenente fosforo-tamponata Salina (PBS).</li>
	<li>Ripetere la procedura per il rene destro.</li>
	<li>Rimuovere ogni rene dalla rispettiva barca di pesatura e posizionarlo su una garza chirurgica pre-inumidito con PBS.</li>
	<li>Lasciando il rene sulla garza chirurgica, rimuovere rapidamente qualsiasi tessuto non renale aderente (come adiposo perirenale o ghiandola surrenale) seguita dalla rimozione della capsula renale. Pesare ogni rene singolarmente, registrando il peso del rene sinistro e destro separatamente in un taccuino di laboratorio.</li>
</ol>2. procedure di omogeneizzazione, incubazione e straining
<ol><li>Una volta che ogni rene viene pesato, drenare ogni barca di pesatura di PBS e riportare i reni nella barca di pesatura opportunamente etichettata. Usando una lama di rasoio pulita, tagliare il rene a metà, longitudinalmente. Posizionare ogni mezzo rene rivolto verso il basso e tagliare ogni metà in pezzi di 2 mm o più piccoli.</li>
	<li>Utilizzando lo stesso Razorblade, raccogliere accuratamente e posizionare i pezzi di rene tritati in un etichettato 15-mL tubo conico (mouse numero/identificatore; sinistra contro rene destro).</li>
	<li>Ripetere la procedura per il rene opposto, utilizzando una nuova lama di rasoio. Posizionare il rene tritato in un tubo conico da 15 mL con etichetta separata.</li>
	<li>In un cappuccio di fumi ben ventilato, aggiungere 5 mL di acido cloridrico 6 M (HCl) ad ogni tubo conico da 15 mL.</li>
	<li>Sostituire il tappo al tubo conico, agitare delicatamente la miscela rene/HCl e posizionare il tubo conico da 15 mL in un bagno d'acqua preriscaldato a 37 ° c per 90 min (* 120 min per i reni del ratto).</li>
	<li>Agitare brevemente ogni tubo da 15 mL ogni 15 minuti durante l'incubazione per garantire che tutti i tessuti siano esposti all'acido HCl.</li>
	<li>Inserire un ago da 18 G in una siringa da 5 mL (* siringa da 10 mL per ratto) e rimuovere con cautela lo stantuffo della siringa. Collocare la siringa in un tubo conico da 50 mL (tubo #1) in una cappa di aspirazione.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione di rene/HCl dal bagno d'acqua e versare la soluzione tissutale nell'estremità aperta della siringa e impostare il tubo conico da 15 mL da parte in un rack provetta. Sostituire con cautela lo stantuffo e spingere lentamente lo stantuffo in modo da estinare la soluzione attraverso l'ago e nel tubo #1.</li>
	<li>Lavare il tubo conico da 15 mL con 5 mL di soluzione PBS. Agitare il PBS nel tubo conico da 15 mL in modo da solubilizzare il tessuto renale rimanente.</li>
	<li>Di nuovo, rimuovere con cautela lo stantuffo dalla siringa da 5 mL contenente l'ago da 18 G e versare il contenuto dal tubo conico da 15 mL all'estremità aperta della siringa. Sostituire con cautela lo stantuffo e sciacquare la siringa spingendo delicatamente verso il basso lo stantuffo, in #1 del tubo. Ripetere questo processo 2x (eseguito 3x in totale).</li>
	<li>Inserire un ago da 21 G in una nuova siringa da 5 mL (* siringa da 10 mL per ratto) e rimuovere con cautela lo stantuffo della siringa. Posizionare la siringa con l'ago da 21 G inserito in un nuovo tubo conico 50 mL (tubo #2).</li>
	<li>Versare il contenuto dal tubo #1 all'estremità aperta della siringa contenente l'ago da 21 G. Inserire con cautela lo stantuffo e sciacquare la siringa spingendo delicatamente verso il basso lo stantuffo della siringa e posizionando la soluzione estrusa nel tubo #2.</li>
	<li>Lavare il tubo #1 con 5 mL di soluzione PBS. Swirl il PBS in tubo #1 in modo da solubilizzare qualsiasi tessuto renale rimanente.</li>
	<li>Di nuovo, rimuovere con cautela lo stantuffo dalla siringa da 5 mL contenente l'ago da 18 G e versare il contenuto dal tubo #1 all'estremità aperta della siringa. Sostituire con cautela lo stantuffo e sciacquare la siringa spingendo delicatamente verso il basso lo stantuffo, estecando la soluzione nel tubo #2. Ripetere questo processo 2x (eseguito 3x in totale).</li>
	<li>Portare il volume totale di tubo #2 fino a 50 mL aggiungendo ulteriori PBS, fino alla linea 50-mL su tubo #2.</li>
	<li>Incubare #2 del tubo contenente la soluzione di tessuto renale in un rack di tubi su una piastra Rocker in un frigorifero impostato a 4 ° c durante la notte (minimo 8-10 h).</li>
</ol>3. conteggio dei glomeruli e estrapolazione del numero di nephron
<ol><li>Rimuovere il tubo #2 dal frigorifero e risospendere il tessuto pellettato capovolgendo delicatamente il tubo più volte al fine di creare una soluzione omogenea. Si consiglia di contare i glomeruli entro 5 d dopo l'elaborazione.</li>
	<li>Con cautela aliquota 500 μL della soluzione renale in un unico pozzo di una piastra 12-well. Ripetere questo 2x, mettendo ogni aliquota in un pozzo separato in modo che ci siano tre pozzi di soluzione renale per rene, per l'analisi in triplice plicato.</li>
	<li>Aggiungere 500 μL di PBS a ciascuno dei tre pozzetti contenenti la soluzione renale, per una diluizione 1:1.</li>
	<li>Utilizzando un microscopio invertito, contare il numero di glomeruli per pozzetto. Il conteggio è aiutato utilizzando una griglia di 16 sezioni separate posizionate sul fondo di ciascun pozzo. Contare il numero di glomeruli per ogni sezione della griglia e quindi sommare il conteggio per griglia per ottenere il numero totale di glomeruli per pozzo. I glomeruli sono facilmente identificabili dalla loro struttura sferica. Ulteriori identificatori includevano una tonalità rossastra a causa di capillari riempiti di sangue, così come pre-o post-arteriole che rimangono attaccati al corpo dei singoli glomeruli (Figura 1).</li>
	<li>Aggiungere il numero totale di glomeruli conteggiati per ciascuno dei tre pozzetti e poi dividerli per tre per il numero medio di glomeruli per 500 μL di soluzione renale. Se la varianza nel numero medio di glomeruli per pozzo è superiore al 10%, ripetere la procedura di conteggio dei nevi, prestando molta attenzione alla natura omogenea della soluzione renale. Moltiplicare il numero di glomeruli contati per ben volte 100 per il numero medio di glomeruli per rene. Il numero totale di nefrone può essere espresso per rene o, usando il peso del rene, per mg o g di tessuto.</li>
</ol>

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<li>Brenner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephron+adaptation+to+renal+injury+or+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nephron adaptation to renal injury or ablation.</a> American Journal of Physiology. 249 (3 Pt 2), F324-F337 (1985).</li>
<li>Didion, S. P., Wang, X., Garrett, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+correlation+between+blood+pressure+and+nephron+endowment+in+a+genetic+model+of+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Direct correlation between blood pressure and nephron endowment in a genetic model of hypertension.</a> Hypertension. 68, A052(2016).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Con una buona tecnica sperimentale, il metodo di macerazione acida è ideale per stimare il numero di nefrone in rene intero. Anche se il rene viene sciolto in acido, i glomeruli rimangono in gran parte integri e sono facilmente identificabili, rendendo il conteggio dei singoli glomeruli relativamente facile e diretto. La tecnica di macerazione acida è particolarmente vantaggiosa per diversi motivi. In primo luogo, il metodo di macerazione acida è un metodo rapido e conveniente che richiede relativamente poco in termini d...

Il nefrone è sia la struttura di base che l'unità funzionale del rene1. Strutturalmente, il nefrone è costituito dal glomerulo (capillari e podociti) che si trova all'interno della capsula del Bowman e del tubulo renale, costituito dal tubulo prossimale, dal loop di Henle e dal tubulo distale che termina nel condotto di raccolta. Funzionalmente, il ruolo del nefrone è la filtrazione e il riassorbimento di acqua ed elettroliti e la secrezione di rifiuti. In generale, la nefrogenesi è completata a 36 settimane di gestazione negli esseri umani e poco dopo la nascita in diverse specie come il topo e il ratto2. L'investitura di nefrone si riferisce al numero totale di nefroni con cui è nato un individuo, mentre il numero di nevi è il numero totale di nefroni misurati in qualsiasi momento dopo la nascita3. Il termine numero di nefrone e il numero glomerulare sono spesso usati in modo intercambiabile. Poiché c'è solo un glomerulo per nefrone, la valutazione del numero di glomeruli è un surrogato importante per stimare il numero di nefrone.
La valutazione della dotazione di nefrone e del numero di nefrone è di interesse clinico, in quanto gli studi hanno dimostrato un'associazione tra la dotazione di nefrone e i numeri di nefrone ridotti con un aumento dell'incidenza di malattie cardiovascolari4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15. sulla base dei risultati nei reni all'autopsia, Brenner ha osservato che gli individui ipertesi presentavano un numero totale inferiore di nefroni rispetto agli individui normotensivi16. Così, Brenner ipotizzò che vi è una relazione inversa tra il numero di nefrone e il rischio di sviluppare ipertensione più tardi nella vita. Brenner ipotizzò anche che una riduzione del numero dei nefroni fosse compensata dai nefroni rimasti. Al fine di mantenere il normale tasso di filtrazione nel rene, i nefroni residui compensano aumentando la loro superficie glomerulare (ipertrofia glomerulare), lavorando così per mitigare qualsiasi effetto avverso della perdita di nefrone sulla funzione renale4 ,16.
Mentre protettivo nell'ipertrofia glomerulare a breve termine, a lungo termine, porta ad un aumento della ritenzione di sodio e liquidi, un aumento del volume del fluido extracellulare e aumenti della pressione arteriosa, portando a un circolo vizioso di ulteriori aumenti in pressione capillare glomerulare, iperfiltrazione glomerulare e cicatrizzazione del nefrone (sclerosi) e lesione4,16.
Ottenere stime o conteggi di numero di nefrone offre un paio di vantaggi sperimentali: 1) fornisce informazioni sul processo di nefrogenesi, che può quindi essere collegato a specifici geni o fattori nell'embrione o nell'ambiente materno-fetale, e 2) C'è un'associazione di numero di nefrone con malattia cardiovascolare e, quindi, c'è il potenziale che le stime del numero di nefrone potrebbero essere utilizzate per predire il rischio cardiovascolare futuro2,17,18, 19 anni di , 20 il , 21 anni di , 22. oltre all'ambiente materno-fetale, diverse malattie influenzano direttamente il numero di nevi e la funzione renale, tra cui l'aterosclerosi, il diabete, l'ipertensione e anche l'invecchiamento normale2,9, 10,11,12,22,23. Pertanto, la valutazione del numero di nefrone del rene intero è importante per comprendere sia i fattori genetici che quelli ambientali che influenzano la nefrogenesi (valea dire, l'investitura del nefrone) e il numero di nefrone nel corso della vita di una persona e gli effetti risultanti sulla funzionalità renale e sulla salute cardiovascolare.
Attualmente, ci sono diversi metodi disponibili per la determinazione e la quantificazione del numero di nefrone, ciascuno con i propri vantaggi e limitazioni24,25,26,27,28 ,29,30. Metodi sofisticati per determinare il numero di nefratti renali interi includono metodi stereologici, come il metodo dissettore/frazionata e risonanza magnetica25,26. Spesso considerato il gold-standard per la determinazione del numero di nefrone rene intero, il metodo dissector/fratore è sia costoso e dispendioso in termini di tempo. I recenti progressi e il miglioramento dell'imaging e della lavorazione a risonanza magnetica hanno fornito gli strumenti per contare singolarmente ogni nefrone. Tuttavia, l'imaging a risonanza magnetica non è solo dispendioso in termini di tempo, ma anche estremamente costoso. Inoltre, sia il metodo dissettore/fratore che la risonanza magnetica richiedono competenze tecniche avanzate, limitando così l'uso di tali metodi nella maggior parte dei laboratori di ricerca.
La maggior parte dei metodi per determinare il numero di nefrone fa conteggi o stime in base all'identificazione dei glomeruli, in quanto sono facilmente identificabili strutturalmente. In questo documento, il metodo di macerazione acida per stimare il numero di nefrone in rene intero è descritto e dimostrato27. Il metodo di macerazione acida è veloce, affidabile e significativamente meno costoso rispetto ad altri metodi, come il metodo del dissettore/fratore e l'imaging a risonanza magnetica. Inoltre, il metodo di macerazione acida fornisce stime altamente ripetibili del numero di nevi che sono stati segnalati all'interno della gamma di quelli determinati utilizzando la risonanza magnetica Imaging26.

<table><tbody><tr><td>Anestesia con isoflurano</td><td>Abbott Laboratories</td><td>05260-05</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di vaporizzazione e flussometro con isoflurano</td><td>Braintree Scientific</td><td>VP I</td><td>Include fornitura di ossigeno per uso medico</td></tr><tr><td>Microscopio invertito Leica DMIL LED Leica</td><td>Microsystems</td><td>DMIL LED</td><td>Qualsiasi marca adatta anche</td></tr><tr><td>Bagno d'acqua digitale</td><td>Fisher Scientific</td><td>2239</td><td>Qualsiasi marca adatto</td></tr><tr><td>ToughCut Forbici chirurgiche fini</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td>tagliente da 25 mm, lunghezza 11,5 cm; Punte: affilate-affilate; Forma della punta: diritta</td></tr><tr><td>Micro pinza da dissezione 4 1/4 in.</td><td>Biomed Res Instruments, Inc</td><td>10-1760</td> Pannello in plexiglass <td>con punta curva</td></tr><tr><td>5 pollici x 7 pollici.</td><td>qualsiasi fonte adatta</td><td>n/a</td><td>Qualsiasi marca adatta anche</td></tr><tr><td>Piatto di pesata esagonale in polistirene</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-2002-100</td><td>Qualsiasi marca adatta anche</td></tr><tr><td>Lame di rasoio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td>Acciaio al carbonio a bordo singolo 0,009</td></tr><tr><td>Spugne di garza 4 x 4 pollici 8 strati</td><td>Fisher Scientific</td><td>MSD-1400250</td><td></td></tr><tr><td>10x soluzione salina concentrata tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5493-4L</td><td>Diluire a 1x&nbsp;</td></tr><tr><td>6 N Soluzione di acido idrocolrico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3750-32</td><td></td></tr><tr><td>15 mL provetta da centrifuga conica</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td>Qualsiasi marca adatta anche</td></tr><tr><td>50 mL provetta da centrifuga conica</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td>Qualsiasi marca adatta anche</td></tr><tr><td>Siringa monouso da 5 ml</td><td>Cole Palmer</td><td>EW-07944-06</td><td>Qualsiasi marca adatta anche</td></tr><tr><td>18G1.5 usa e getta ago</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-5D</td><td>Qualsiasi marca adatta anche</td></tr><tr><td>21G1.5 ago monouso</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-5B</td><td>Qualsiasi marca adatta anche</td></tr><tr><td>piastre per colture cellulari a 12 pozzetti multipli con coperchio</td><td>Cole Palmer</td><td>#FW-01959-06</td><td>Qualsiasi marca adatta anche</td></tr><tr><td>Rack per provette modulari in polipropilene</td><td>Cole Palmer</td><td>#EW-06733-00</td><td>In grado di contenere provette coniche da 15 e 50 mL; qualsiasi marca adatta anche</td></tr></tbody></table>

stima del numero di nephron in rene intero utilizzando il metodo di macerazione acida

Estimation of Nephron Number in Whole Kidney using the Acid Maceration Method

L'investitura di nephron si riferisce al numero totale di nefroni a cui è nato un individuo, poiché la nefrogenesi nell'uomo è completata da 36 settimane di gestazione e non si formano nuovi nefroni dopo la nascita. Il numero di nephron si riferisce al numero totale di nefroni misurati in qualsiasi momento post-parto. Sia i fattori genetici che quelli ambientali influenzano sia il numero che l'investitura dei nevi. Comprendere come i geni o i fattori specifici influenzano il processo di perdita o scomparsa di nefrogenesi e di nefrone è importante in quanto gli individui con una dotazione o un numero di nefrone inferiore sono pensati per essere ad un rischio maggiore di sviluppare malattie renali o cardiovascolari. Comprendere come le esposizioni ambientali nel corso della vita di una persona influisce sul numero di nefrone sarà anche vitale per determinare il rischio di malattia futuro. Pertanto, la capacità di valutare in modo rapido e affidabile il numero di nefratti renali interi è un requisito sperimentale di base per comprendere meglio i meccanismi che contribuiscono o promuovono la perdita di nefrogenesi o di nefrone. Qui, descriviamo il metodo di macerazione acida per la stima del numero di nefrone renale intero in base alla procedura descritta da Damadian, Shawayri e Bricker, con lievi modifiche. Il metodo di macerazione acida fornisce stime rapide e affidabili del numero di nefratti (valutati dal conteggio dei glomeruli) che sono entro il 5% di quelli determinati utilizzando metodi più avanzati, seppur costosi, come l'imaging a risonanza magnetica. Inoltre, il metodo di macerazione acida è un ottimo metodo ad alto rendimento per valutare il numero di nefrini in un gran quantità di campioni o condizioni sperimentali.

Di seguito sono riportate le stime rappresentative del numero di nefrone del rene intero da un modello murino di ipertensione e un modello genetico di ratto della malattia renale cronica legata all'età. Le caratteristiche chiave di identificazione dei glomeruli, come una struttura sferica con o senza strutture pre-o post-arteriolari o tubolari collegate, sono evidenziate per quelle nuove al metodo di macerazione acida (Figura 1).
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Le stime del numero di nefrone rene intero sono importanti clinicamente e sperimentalmente, in quanto vi è un'associazione inversa tra il numero di nefrone e un aumentato rischio di malattie renali e cardiovascolari. Qui è dimostrato l'uso del metodo di macerazione acida, che fornisce stime rapide e affidabili del numero di nefrone renale intero.

Stima del numero di Nephron in rene intero utilizzando il metodo di macerazione acida

Nephron endowment refers to the total number of nephrons an individual is born with, as nephrogenesis in humans is completed by 36 weeks of gestation and ...

Il metodo di macerazione acida può aiutare a rispondere a domande chiave sul rene e su come geni specifici contribuiscono o influenzano lo sviluppo del nefro, nonché su come condizioni specifiche, come diabete o ipertensione, influenzano il numero di nefro. Questo è importante in quanto un numero totale di nefrroni con cui un individuo nato è determinato durante lo sviluppo fetale e la perdita di nefroni è stata associata a patologia renale. I principali vantaggi del metodo di macerazione acida sono che è più veloce, più riproducibile, economico e meno dispendioso in termini di tempo rispetto ad altri metodi di conteggio del nefro, come la risonanza magnetica.Questa tecnica facilita la correlazione dell'impatto nel numero di nefro sulla funzione renale, che è importante per promuovere la nostra comprensione di come geni specifici influenzano la funzione e lo sviluppo del nefro. Lo studio di geni o fattori che influenzano il numero complessivo di nefro sarà determinante nello sviluppo di approcci farmacologici o genetici progettati per limitare la perdita di nefro associata alla malattia. Con una buona tecnica e pratica sperimentale, gli individui nuovi a questo metodo dovrebbero facilmente acquisire padronanza del metodo di macerazione acida consentendo stime affidabili e riproducibili di interi numeri di nefro renale.Inizia usando forbici chirurgiche fini per aprire la cavità addominale del topo lungo la linea mediana. Spostare con cura l'intestino e l'adiposo riproduttivo sul lato destro dell'animale. Utilizzando la dissezione lorda, isolare il rene sinistro e tagliare l'arteria renale sinistra e la vena per rimuovere con cura il rene posizionando l'organo in una barca di pesatura appropriatamente etichettata di PBS.Raccogliere il rene giusto nello stesso modo e posizionare entrambi i reni su una garza chirurgica pre-inumidita con PBS. Rimuovere rapidamente qualsiasi tessuto non renale aderente e le capsule renali. Quindi pesare ogni rene registrando individualmente il peso dell'organo sinistro e destro separatamente.Dopo la pesatura, riposizionare ogni rene in una barca di pesatura adeguatamente etichettata senza PBS e utilizzare una lama di rasoio pulita per tagliare ogni organo a metà longitudinalmente. Posizionare ogni mezzo rene tagliato lateralmente e tagliare ogni metà in due millimetri o pezzi più piccoli. Utilizzando la stessa lama di rasoio, trasferire accuratamente i pezzi di rene tritati in un tubo conico da 15 millilitri opportunamente etichettato.In una cappa fumi ben ventilata, aggiungere cinque millilitri di sei acido cloridrico molare ad ogni tubo. Successivamente, agitare delicatamente le miscele di acido renale prima di posizionare i tubi in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per 90 minuti. Al termine della macerazione acida, attaccare un ago calibro 18 a una siringa da cinque millilitri per rene e rimuovere con cura i pistoni della siringa.Posizionare le siringhe in singoli tubi conici da 50 millilitri nella cappa dei fumi e versare le soluzioni renali all'estremità aperta di ogni siringa mettendo da parte i tubi vuoti in un rack della provetta. Quindi sostituire con cura i pistoni per la lenta estrusione di ogni soluzione attraverso gli aghi nei tubi da 50 millilitri. Lavare i tubi conici da 15 millilitri con cinque millilitri di soluzione PBS per tubo che ruota il PBS per solubilizzare qualsiasi tessuto renale rimanente.Estrudere il contenuto del lavaggio nel tubo appropriato da 50 millilitri come appena dimostrato. Dopo aver estruso il terzo lavaggio, dotare ogni siringa di un ago calibro 21. Estrudere il contenuto dei tubi da 50 millilitri in un secondo set di tubi da 50 millilitri attraverso il lavaggio dell'ago di foro più piccolo ed estrudendo il primo contenuto di tubi da 50 millilitri tre volte con PBS fresco come dimostrato.Dopo il terzo lavaggio ed estrusione, portare il volume totale in ogni tubo fino a 50 millilitri con PBS aggiuntivo e posizionare i tubi in un rack su una piastra rocker a quattro gradi Celsius durante la notte. Entro cinque giorni dall'elaborazione, posizionare una griglia contenente 16 sezioni separate sul fondo di sei pozzi di una piastra di 12 pozza. Invertire delicatamente i tubi della soluzione renale più volte per rimorsi i tessuti pelletti.Aggiungere con cura tre aliquote da 500 microliter di ogni soluzione omogeneizzata per rene a ciascuno dei tre pozzi della piastra del pozzo 12. Diluire il contenuto di ogni pozzo con un volume uguale di PBS. Posizionare la piastra sul palco di un microscopio invertito.Identificare i glomeruli per la loro struttura sferica, la tonalità rossastra e le arterie pre o post attaccate ai corpi dei singoli glomeruli. Contare il numero di glomeruli per ogni sezione grigliata per sommare il conteggio per griglia per il calcolo del numero totale di glomeruli per pozzo. Quindi moltiplicare il numero di glomeruli per pozzo per 100 per ottenere il numero medio di glomeruli per rene.In questo esperimento rappresentativo, il numero totale di nefro nei topi infusi con il veicolo per 14 giorni è stato di circa 12.500 nefroni per rene. L'angiotensina, tuttavia, ha aumentato la pressione atriale di circa 40 millimetri di mercurio ed è stata associata a una significativa riduzione di quasi il 26% del numero totale di nefro. In questo modello genetico di agenesia renale del ratto, gli animali nati con due reni sono stati calcolati per contenere circa 27.500 nefrroni per rene dopo la macerazione acida come dimostrato, mentre i ratti nati con un rene solitario hanno un numero totale di nefroni significativamente inferiore.Le stime di entrambi gli esperimenti erano coerenti con le gamme precedentemente riportate nei ratti. Il metodo di macerazione acida è ideale per stimare il numero di nefroni in reni interi, specialmente nei laboratori non dotati di tecniche più laboriose e proibitive per il conteggio dei nefroni, come il metodo del frazionatore disettore o la risonanza magnetica. Questo metodo consente una stima elevata della produttività, efficiente e riproducibile del numero intero di nefro renale che si trovano entro il 5% dei numeri determinati dalla risonanza magnetica.La valutazione del numero di nefro è di rilevanza clinica in quanto il numero ridotto di nefroni è stato associato a un aumento del rischio di malattie cardiovascolari, come la malattia renale cronica. Non dimenticare che lavorare con acido cloridrico può essere estremamente pericoloso e che devono essere prese precauzioni, come indossare guanti, occhiali protettivi e un cappotto da laboratorio.

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Quantificare permeabilità glomerulare delle Macromolecole fluorescenti usando la microscopia a due fotoni a Monaco di Baviera ratti Wistar

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L'obiettivo principale di questo protocollo è quello di isolare in modo efficiente culture vitale primaria glomeruli con contaminanti minimale per l'uso in una varietà di applicazioni a valle. Glomeruli isolati mantengono relazioni strutturali tra tipi di componenti delle cellule e possono essere coltivate ex vivo per un breve periodo.

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Qui presentiamo un protocollo che utilizza la microscopia a 2 fotoni a Monaco di Baviera nei ratti Wistar Fromter con glomeruli di superficie per quantificare gli effetti dell'ostruzione ureterale prolungata sulla dinamica e sulla funzione glomerulare.

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La piattaforma sperimentale di moxibustione può riparare i ratti senza restrizioni e i ratti possono sottoporsi a moxibustione multi-agopunto nello stato di veglia, garantendo il benessere dei ratti, proteggendo la sicurezza degli operatori, garantendo l'efficacia terapeutica e migliorando l'efficienza dell'esperimento.

Utilizzo della moxibustione separata da torte a base di erbe per il trattamento di ratti con insufficienza renale cronica

Questo studio presenta una serie di metodi facili da usare, completi e semplici per etichettare e analizzare i glomeruli da reni di topo eliminati da CUBIC. Dati come il numero e il volume del glomerulo possono essere ottenuti in modo semplice e affidabile utilizzando l'isotiocianato di fluoresceina (FITC)-destrano, la microscopia a fluorescenza a foglio luminoso (LSFM) o la comune microscopia confocale e software come Imaris.

Un metodo efficiente e veloce per l'etichettatura e l'analisi dei glomeruli di topo

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Impara il metodo di macerazione acida per stimare il numero di nefroni nel rene intero. Questa tecnica rapida e riproducibile facilita lo studio dello sviluppo renale e delle malattie cardiovascolari.

Stima del numero di Nephron in rene intero utilizzando il metodo di macerazione acida

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