Name: Analisi metagenomica quasi di Salmonella da campioni ambientali e alimentari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-25T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Scopri la sequenziamento quasimetagenomico per la sicurezza alimentare usando separazione immunomagnetica e amplificazione MDA. Questo metodo consente il rilevamento e la sottotipizzazione rapida di Salmonella da campioni ambientali e alimentari.

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Gli autori vorrei ringraziare Mark Harrison e Gwen Hirsch della University of Georgia per fornire gentilmente il ceppo batterico e altro supporto a questo studio.

1. preparazione del campione
Nota: Campioni di prodotti alimentari sono preparati per pre-arricchimento secondo la Guida di laboratorio di microbiologia (MLG) di Stati Uniti Dipartimento di agricoltura sicurezza alimentare e Inspection Service (USDA-FSIS)11 e manuale analitico batteriologico (BAM) della US Food e Drug Administration (FDA)12.
<ol><li>Asetticamente posto una porzione di 25 g di campione di cibo come il pepe nero, petto di pollo, carne macinata e germogli di erba medica o un tampone ambientale in un sacchetto di laboratorio sterile frullatore con un filtro incorporato. Preparare un tampone ambientale inumidendo asetticamente una spugna con brodo di arricchimento (Rappaport-Vassiliadis, RV). Trascinare il tampone su tutta la superficie o area predeterminata, quindi metterlo in un sacchetto di frullatore di laboratorio.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58612/58612fig1.jpg"> Figura 1: alimentari rappresentativi e campioni ambientali per il rilevamento di quasi-metagenomica e tipizzazione di Salmonella. I campioni vengono inseriti in sacchetti stomacher filtro sterile insieme al brodo di RV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58612/58612fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol start="2"><li>Miscelare accuratamente ogni campione di 25 g con 225 mL di arricchimento RV brodo utilizzando un massaggio di blender o mano di laboratorio per 30 s. Nota: Varianti di brodo RV come consigliato da MLG e BAM possono essere utilizzati a seconda dei tipi di campione.</li>
	<li>Incubare la miscela di brodo di arricchimento del campione in un incubatore da laboratorio a 42 ° C per 4 – 24 h.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, è necessario raccogliere un sottocampione di 50 mL di brodo di arricchimento dal lato filtrato della borsa in una provetta da centrifuga separata 50 mL.</li>
	<li>Centrifugare la provetta a 100 x g per 10 min rimuovere detriti solidi nell'omogeneato.</li>
	<li>Recuperare il surnatante attentamente per un nuovo 50 mL Centrifugare la provetta e centrifugare le provette a 3.000-6.000 x g per 10 min recuperare il pellet cellulare.</li>
	<li>(Opzionale) Scartare il surnatante e lavare la pallina di risospensione in 5ml di Buffered Peptone Water (BPW) e centrifugare le provette a 3.000-6.000 × g per 10 min. Nota: BPW può preparato dalla dissoluzione 10 g di peptone, 5 g di cloruro di sodio, 3,5 g di disodio fosfato, e 1,5 g di fosfato monopotassico in 1 L di acqua distillata. Il pH finale deve essere regolato a 7,2 ± 0,2 a 25 ° C. Utilizzabile anche sterilizzare in autoclave a 121 ° c per 15 min. BPW commercialmente disponibili.</li>
	<li>Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 5 mL di BPW.</li>
</ol>2. immunomagnetica separazione (IMS) e amplificazione multipla di cilindrata (MDA)
Nota: Per evitare contaminazioni tra campioni, lavorare in una cappa di biosicurezza, cambiare i puntali delle pipette per ogni tubo, evitare di toccare il tubo con la pipetta e non collocare tubi ravvicinati in stand magnetico durante la fase di lavaggio.
<ol><li>Scongelare la sample buffer e il buffer di reazione dal kit di MDA in ghiaccio o a 4 ° C in anticipo.</li>
	<li>Mescolare 1 mL di ri-sospensione cellulare a pellet a BPW con 20 μL di anti -Salmonella perline in provette per microcentrifuga da 1,5 mL e posizionarlo sul miscelatore rotante per 30 min a temperatura ambiente. Nota: Flora competitiva, particelle di grasso e proteine nel sedimento risospeso possono interferire con IMS. Diluizione di pellet cellulare risospeso in BPW è utile per ridurre la perdita dei complessi perle -Salmonella dal supporto magnetico durante fasi di lavaggio.</li>
	<li>Inserire le provette nel supporto magnetico e consentire 3 min per il corretto recupero dei branelli capovolgendo il rack diverse volte a concentrare le perle in una pallina sul lato del tubo.</li>
	<li>Mantenere le provette sul supporto magnetico. Aspirare e scartare il surnatante da ciascuna provetta, come pure il liquido restante nel tappo di ogni tubo. Nota: Fare attenzione a non disturbare il pellet di perline IMS sulla parete laterale del tubo contro il magnete.</li>
	<li>Rimuovere il supporto del tubo dal supporto magnetico e aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio (PBS contenente 0,05% (v/v) polisorbato 20) e capovolgendo per rimuovere batteri di legame non specifico dal complesso.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 2.3 – 2.5 due volte.</li>
	<li>Dopo il lavaggio 3rd , eseguire la definitiva separazione magnetica di perline ripetendo i passaggi 2.3 – 2.4. Rimuovere i tubi dal rack magnetico e metterli in un microfuge per 1 s per far girare giù perline. Quindi, posizionare i tubi nel rack magnetico per 3 minuti prima di togliere qualsiasi residuo di tampone.</li>
	<li>Risospendere i complessi diSalmonella perle - in 9 μL di tampone del campione e incubare a 95 ° C per 3 min per denaturazione.</li>
	<li>Dopo raffreddamento a 4 ° C il ghiaccio, si combinano con 9 μL di tampone di reazione più 1 μL di enzima mescolare e tenere sul ghiaccio.</li>
	<li>In un termociclatore, incubare le provette a 30 ° C per 2 h per l'amplificazione, seguita da riscaldamento a 65 ° C per 10 min per inattivare l'enzima e raffreddare a 4 ° C sul ghiaccio.</li>
	<li>Valutare la quantità e la qualità dei prodotti MDA misurando la concentrazione del DNA e la purezza (260/280 ratio &gt; 1,8) su uno strumento di fluorospectrometer. Nota: A causa del legame non specifico di perline IMS, DNA genomico da organismi diversi da Salmonella è probabile che sia presente nei prodotti di MDA, ma non influisce sulla analisi a valle.</li>
	<li>Conservare i prodotti finali (20 μL) a-20 ° C fino a uso per PCR Real-Time e/o preparazione di libreria per il sequenziamento di quasimetagenomics.</li>
</ol>3. Real-Time PCR
Nota: Questo passaggio è facoltativo per 1) rilevazione di Salmonella senza sottotipi e 2) valutare la qualità del campione prima del sequenziamento di quasimetagenomics.
<ol><li>Preparare 18 μL di miscela PCR per campione, contenente Universal PCR Master Mix (10 μL), forward primer (2 μL, 900 nM), reverse primer (2 μL, 900 nM), sonda (2 μL, 250 nM) e acqua di grado molecolare (2 μL). Nota: Salmonella-iniettori del oligonucleotide specifico (in avanti: CTCACCAGGAGATTACAACATGG, reverse: AGCTCAGACCAAAAGTGACCATC) e sonda sono stati progettati per amplificare una sequenza di 94 punti di ebollizione all'interno del gene ttr (accessione no. AF 282268)13.</li>
	<li>Mescolare il prodotto MDA dal punto 2.12 pipettando delicatamente su e giù per perle -Salmonella complessi con liquido per creare una sospensione. Aggiungere 2 μL della sospensione in 18 μL di miscela PCR.</li>
	<li>Eseguire PCR in tempo reale utilizzando un protocollo PCR in tempo reale ottimizzato, specificando due periodi di detenzione, uno a 50 ° C per 2 min e un altro a 95 ° C per 10 minuti, seguiti da 40 cicli di 95 ° C per 15 s e 60 ° C per 60 s.</li>
	<li>Calcolare il ciclo soglia (Ct), che è il numero di cicli necessari per la fluorescenza da DNA amplificato per attraversare la linea di soglia. Nota: La linea di soglia è impostata nella fase lineare tra la linea di base e Altopiano degli appezzamenti amplificazione di campioni. Risultati negativi corrispondono a valori Ct su 40 o campioni con valori di Ct superiori a quella del controllo negativo.</li>
</ol>4. Biblioteca preparazione per il sequenziamento di Quasimetagenomic
Nota: I prodotti MDA possono essere ordinati in sequenza da entrambi breve leggere e lungo leggere (nanopore) piattaforme di sequenziamento. Utilizzare l'ultima versione del kit di preparazione libreria del DNA forniti dai produttori delle piattaforme di sequenziamento. Eseguire la preparazione libreria DNA seguendo le istruzioni dei produttori. Utilizzare il protocollo di DNA genomico basso input 2D per la preparazione di libreria per il sequenziamento di lungo-ha letto piattaforma5. Per la preparazione di biblioteca per la piattaforma di sequenziamento di breve-lettura, piccole modifiche al protocollo del produttore sono fornite di seguito.
<ol><li>Seguire metodi di preparazione di libreria standard con l'aggiunta di soluzioni tampone e reagenti ai prodotti MDA. Trasferimento 40 μL di sequenziamento prepped MDA prodotti per una nuova piastra e aggiungere 20 μL di perle di purificazione di PCR in ciascun pozzetto.</li>
	<li>Incubare la piastra a temperatura ambiente per 10 min senza agitare.</li>
	<li>Le perline con 80% di etanolo di lavare e asciugare le perline per 12 min.</li>
	<li>Risospendere secchi perline in 53 μL di tampone di risospensione e incubare per 2 minuti senza agitazione.</li>
	<li>Diluire e librerie seguendo le istruzioni del fabbricante della piscina. Nota: Un 22 riuniti e Biblioteca denaturato è ora pronto ad essere sequenziata.</li>
</ol>

<ol><li>Valderrama, W. B., Dudley, E. G., Doores, S., Cutter, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commercially+Available+Rapid+Methods+for+Detection+of+Selected+Food-borne+Pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Food+Science+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Commercially Available Rapid Methods for Detection of Selected Food-borne Pathogens.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (9), 1519-1531 (2016).</li>
<li>Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., Elkins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+metagenomic+sequencing+to+food+safety%3A+detection+of+Shiga+Toxin-producing+Escherichia+coli+on+fresh+bagged+spinach%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Application of metagenomic sequencing to food safety: detection of Shiga Toxin-producing Escherichia coli on fresh bagged spinach.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (23), 8183-8191 (2015).</li>
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<li>Hyeon, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quasi-metagenomics+and+realtime+sequencing+aided+detection+and+subtyping+of+Salmonella+enterica+from+food+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quasi-metagenomics and realtime sequencing aided detection and subtyping of Salmonella enterica from food samples.</a> Applied and Environmental Microbiology. , (2017).</li>
<li>Hyeon, J. Y., Deng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+Salmonella+in+raw+chicken+breast+using+real-time+PCR+combined+with+immunomagnetic+separation+and+whole+genome+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of Salmonella in raw chicken breast using real-time PCR combined with immunomagnetic separation and whole genome amplification.</a> Food Microbiology. 63, 111-116 (2017).</li>
<li>Hosono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+whole-genome+amplification+directly+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Unbiased whole-genome amplification directly from clinical samples.</a> Genome Research. 13 (5), 954-964 (2003).</li>
<li>Seth-Smith, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+sequences+of+Chlamydia+trachomatis+directly+from+clinical+samples+without+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Whole-genome sequences of Chlamydia trachomatis directly from clinical samples without culture.</a> Genome Research. 23 (5), 855-866 (2013).</li>
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<li>Hammack, T. S., Amaguana, R. M., June, G. A., Sherrod, P. S., Andrews, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+effectiveness+of+selenite+cystine+broth%2C+tetrathionate+broth%2C+and+Rappaport-Vassiliadis+medium+for+the+recovery+of+Salmonella+spp.+from+foods+with+a+low+microbial+load%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Protection%22%5BJournal%5D)">Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella spp. from foods with a low microbial load.</a> Journal of Food Protection. 62 (1), 16-21 (1999).</li>
<li>Wood, D. E., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kraken%3A+ultrafast+metagenomic+sequence+classification+using+exact+alignments%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments.</a> Genome Biology. 15 (3), R46(2014).</li>
<li>Davis, S., Pettengill, J. B., Luo, Y., Payne, J., Shpuntoff, A., Rand, H., Strain, E. <a target="_blank" href="https://peerj.com/articles/cs-20/?utm_source=TrendMD&utm_campaign=PeerJ_TrendMD_0&utm_medium=TrendMD">CFSAN SNP Pipeline: an automated method for constructing SNP matrices from next-generation sequence data.</a> PeerJ Computer Science. 1 (e20), (2015).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+serotype+determination+utilizing+high-throughput+genome+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Salmonella serotype determination utilizing high-throughput genome sequencing data.</a> Journal of Clinical Microbiology. 53 (5), 1685-1692 (2015).</li>
<li>Rodrigue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+genome+amplification+and+de+novo+assembly+of+single+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Whole genome amplification and de novo assembly of single bacterial cells.</a> PLoS One. 4 (9), e6864(2009).</li>
<li>Ramamurthy, T., Ghosh, A., Pazhani, G. P., Shinoda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Perspectives+on+Viable+but+Non-Culturable+%28VBNC%29+Pathogenic+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Current Perspectives on Viable but Non-Culturable (VBNC) Pathogenic Bacteria.</a> Front Public Health. 2, 103(2014).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

A causa della spesso-bassa abbondanza e omogenei in presenza di Salmonella negli alimenti e nei campioni ambientali, arricchimento di cultura prima di IMS-MDA è ancora necessario per il rilevamento di Salmonella e subtyping; è quindi un passo fondamentale del protocollo. Per identificare le condizioni ottimali per aumentare l'abbondanza di Salmonella relativa flora sfondo campione, media diversi arricchimento può essere valutata per gli esempi specifici. Secondo MLG e BAM, sia terreno selettivo...

Metagenomica sequenziamento permette teoricamente di rilevamento concertato e tipizzazione di agenti patogeni di origine alimentare. Tuttavia, campioni alimentari presentano sfide all'analisi dell'agente patogeno mediante sequenziamento diretto del microbioma cibo. In primo luogo, patogeni di origine alimentare sono spesso presenti a livelli bassi in campioni alimentari. La maggior parte dei metodi di rilevazione rapida commercialmente disponibili ancora richiedono 8 – 48 h coltura per arricchire patogeni e cellule a un livello rilevabile1. In secondo luogo, molti alimenti contengono abbondante microflora cellule e/o cibo del DNA, che rende il DNA di agenti patogeni di origine alimentare una piccola frazione del metagenoma di cibo e un obiettivo sfuggente per rilevazione e definizione di sottotipo di metagenomica sequenziamento diretto.
Modifica del cibo microbiomi è stato segnalato per consentire la notevole concentrazione di patogeni di origine alimentare DNA per facilitare il rilevamento basato sul sequenziamento di Shiga tossina Escherichia coli2,3 e Salmonella enterica4. Perché alimenti microbiomi sono ancora miscele di differenti specie microbiche, loro sequenziamento è definito come di analisi metagenomica quasi4. Microbioma modifica può essere eseguita da cultura arricchimento da solo2,3 , o in combinazione con separazione immunomagnetica (IMS) e più cilindrata amplificazione (MDA)4,5. IMS è in grado di catturare in modo selettivo patogeni e cellule dalla coltura di arricchimento tramite biglie magnetiche rivestite con anticorpo. MDA può generare una quantità sufficiente di DNA genomico per la sequenza attraverso il ɸ29 altamente efficiente della polimerasi del DNA6. IMS-MDA ha permesso il rilevamento del patogeno coltura-indipendente da campioni clinici7e accorciando l'arricchimento della cultura per il rilevamento di quasi-metagenomica e tipizzazione di Salmonella in campioni di cibo4.
L'obiettivo generale di questo metodo è quello di preparare quasi metagenomici DNA da campioni di alimenti per consentire mirate concentrazione del DNA genomico di Salmonella e successivo rilevamento e sottotipizzazione del contaminante Salmonella mediante sequenziamento. Paragonato ai metodi standard per Salmonella rilevamento8,9 e10di sottotipizzazione, l'approccio di quasimetagenomic sostanzialmente possibile accorciare i tempi di turnaround da alimenti contaminati ed i campioni ambientali sottotipi molecolari dell'agente patogeno unificando i due in genere separata analisi in un unico flusso di lavoro. Questo metodo è particolarmente utile per applicazioni come risposta alle epidemie trasmesse da alimenti e altre indagini di schiena traccia dove robusto patogeno sottotipizzazione è richiesto oltre al rilevamento del patogeno e rapida inversione di tendenza analitica è importante.

<table><tbody><tr><td>Sacchetto frullatore da laboratorio con filtro</td><td>VWR</td><td>10048-886</td><td></td></tr><tr><td>Acqua peptonica tamponata</td><td>Prodotti di micorbiologia ossoide</td><td>CM0509</td><td></td></tr><tr><td>Rappaport Brodo di Vassiliadis</td><td>Neogen Acumedia</td><td>7730A</td><td></td></tr><tr><td>Polisorbato 20&nbsp;</td><td>Frullatore Millipore Sigma</td><td>P9416</td><td>Tween 20</td></tr><tr><td>Stomacher</td><td>Seward</td><td></td><td></td>30010108</tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Fisher Scientific 75005194</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga da 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-6</td><td></td></tr><tr><td>Termociclatore</td><td>Techne Prime</td><td>EW-93945-13</td><td></td></tr><tr><td>Termociclatore in tempo reale StepOne</td><td>Applied Biosystems</td><td>4.76357</td><td></td></tr><tr><td>Perline AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Perle di purificazione PCR; mescolare bene prima dell'uso; negozio a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Kit di preparazione libreria Nextera XT</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>Conservare a -80 &deg; </td></tr><tr><td>Kit di preparazione della libreria C MinIon</td><td>Oxford Nanopore</td><td>SQK-LSK108</td><td>Negozio a -80 &deg; C</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Dynabead Anti-Salmonella beads</td><td>Applied Biosystems</td><td>71002</td><td>Vortex bene prima dell'uso</td></tr><tr><td>Illustra GenomiPhi V2 Kit di amplificazione del DNA (kit MDA) -Tampone campione -Tampone di reazione -Miscela enzimatica</td><td>GE Healthcare</td><td>25-6600-30</td><td>Conservare a -80 &deg; C</td></tr><tr><td>HulaMixer</td><td>Invitrogen</td><td>15920D</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag rack magnetico</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR mastermix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4304437</td><td>Mescolare bene prima dell'uso; conservare a 4 gradi C</td></tr><tr><td>Microfuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-090-100</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi metagenomica quasi di salmonella da campioni ambientali e alimentari

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomica sequenziamento si riferisce all'analisi basata su sequenziamento dei microbiomi modificate di cibo e campioni ambientali. In questo protocollo, microbiome modificazione è progettato per concentrare il DNA genomico di un contaminante di agente patogeno alimentare destinazione per facilitare l'individuazione e definizione di sottotipo dell'agente patogeno in un unico flusso di lavoro. Qui, spiegare e dimostrare la procedura di preparazione del campione per l'analisi metagenomica quasi di Salmonella enterica da alimentari rappresentativi e campioni ambientali tra cui germogli di erba medica, pepe nero macinato, macinato di manzo, petto di pollo e tamponi ambientali. Campioni vengono prima sottoposti all'arricchimento della cultura della Salmonella per una durata ridotta e regolabile (4 – 24 h). Salmonella cellule quindi vengono acquisite in modo selettivo dalla coltura di arricchimento di separazione immunomagnetica (IMS). Infine, amplificazione multipla di cilindrata (MDA) viene eseguita per amplificare il DNA dalle cellule di IMS-catturato. L'output di DNA del presente protocollo possa essere sequenziato da piattaforme di sequenziamento di throughput elevato. Un'analisi PCR quantitativa opzionale può essere eseguita per sostituire sequenziamento per rilevamento di Salmonella o valutare la concentrazione di Salmonella del DNA prima di sequenziamento.

Prima del sequenziamento di quasimetagenomic, la quantità e la purezza dei prodotti IMS-MDA globale possono essere valutate dal fluorospectrometer (tabella 1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Tempo di arricchimento (h)</td>
			<td>Valore di CT</td>
			<td>Concentrazione (ng/ul)</td>
			<td>Purezza (260/280)</td>
		...

Qui, presentiamo un protocollo per preparare campioni di DNA da alimentare e ambientale microbiomi per rilevamento concertato e tipizzazione di Salmonella mediante sequenziamento di quasimetagenomic. L'uso combinato di arricchimento della cultura, separazione immunomagnetica (IMS) e cilindrata più amplificazione (MDA) permette efficace concentrazione del DNA genomico di Salmonella da campioni ambientali e alimentari.

Analisi metagenomica quasi di Salmonella da campioni ambientali e alimentari

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, ...

Questo metodo può essere utilizzato per rilevare salmonella da campioni di alimenti e identificare l'agente patogeno a livello di ceppo attraverso il rilevamento genetico delle impronte digitali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che combina il rilevamento e la sottotipizzazione della Salmonella in un unico flusso di lavoro e riduce sostanzialmente i tempi di consegna dal campione alimentare contaminato da Salmonella all'impronta digitale dell'agente patogeno. Per iniziare, posizionare aseticamente un campione di cibo da 25 grammi all'interno di un sacchetto di frullatore da laboratorio sterile con un filtro incorporato o, facoltativamente, preparare un tampone ambientale inumidindo aseticamente una spugna con brodo di arricchimento, trascinandolo su una superficie predeterminata e posizionandolo all'interno di un sacchetto del frullatore.Utilizzando un frullatore da laboratorio, mescolare accuratamente ogni campione con 225 millilitri di brodo di arricchimento del camper. Quindi incubare la miscela a 42 gradi Celsius per quattro o 21 ore. Successivamente, raccogliere un sottocampione da 50 millilitri di brodo di arricchimento dal lato filtrato del sacchetto.Quindi centri

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Questo protocollo descrive un semplice nastro adesivo a base di approccio per il campionamento di pomodoro e di altre superfici di prodotti freschi, seguita da una rapida individuazione cellule intere...

Combinazione di nastro adesivo a base di campionamento e di fluorescenza In situ</emIbridazione> per il rilevamento rapido di Salmonella Su prodotti freschi

Descriviamo un multiplex PCR per la rilevazione rapida di Salmonella enterica sierotipi Enteritidis, Hadar, Heidelberg, e Typhimurium. Sierotipi di Salmonella specifici possono essere identificati prendendo di mira un multiplex PCR di geni e sequenze uniche per l'O-antigene grappolo biosintesi e flagellina di un sierotipo dato. Sierotipo viene assegnato poi a isolare Salmonella in base alla comparsa di specifiche, ampliconi dimensioni (prodotto PCR) corrispondente al allele di destinazione.

Un Allelotyping PCR per l&#39;identificazione Salmonella enterica Sierotipi Enteritidis, Hadar, Heidelberg, e Typhimurium

Questo manoscritto descrive un dettagliato protocollo standardizzato di alta-16S rRNA-amplicone sequenziamento. Il protocollo introduce un protocollo integrato, in uniforme, fattibile ed economico a partire dalla raccolta del campione fecale attraverso l'analisi dei dati. Questo protocollo consente l'analisi di un gran numero di campioni con rigorosi standard e diversi controlli.

Protocollo guidata per caratterizzazione microbica fecale mediante sequenziamento del 16S rRNA-amplicone

Salmonella spp /Shigella spp sono agenti patogeni comuni attribuiti alla diarrea. Qui, descriviamo una piattaforma di alto-rendimento per lo screening della Salmonella spp /Shigella spp usando la PCR in tempo reale combinati con cultura guidato.

Una piattaforma di High-throughput per lo Screening della Salmonella spp /Shigella spp.

Questo approccio molecolare per determinare la forma fisica batterica facilita il rilevamento preciso e preciso dei microrganismi utilizzando codici a barre specifici del DNA genomico quantificati tramite PCR digitale. Il protocollo descrive il calcolo dell'indice concorrenziale per i ceppi di Salmonella;  tuttavia, la tecnologia è facilmente adattabile ai protocolli che richiedono la quantificazione assoluta di qualsiasi organismo geneticamente malleabile.

Indice competitivo digitale basato su PCR per l'analisi ad alto epossibilere del fitness nella Salmonella

L'immunoprecipitazioni della cromatina abbinata al sequenziamento di nuova generazione (ChIP-seq) è un metodo utilizzato per stabilire le interazioni tra i fattori di trascrizione e le sequenze genomiche che controllano. Questo protocollo delinea le tecniche per l'esecuzione di ChIP-seq con biofilm batterici, utilizzando come esempio il biofilm batterico di Salmonella enterica serovar Typhimurium.

Individuazione degli obiettivi normativi CsgD nel biofilm della Salmonella mediante l'immunoprecipitazioni della cromatina e il sequenziamento ad alto rendimento (ChIP-seq)

L'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) è un test di amplificazione dell'acido nucleico isotermico (iNAAT) che ha attirato un ampio interesse nel campo del rilevamento degli agenti patogeni. Qui presentiamo un protocollo Salmonella LAMP convalidato in più laboratori come metodo rapido, affidabile e robusto per lo screening della Salmonella negli alimenti per animali e la conferma della Salmonella presuntiva dall'isolamento della coltura.

Amplificazione isotermica mediata ad anello per lo screening della Salmonella negli alimenti animali e conferma della Salmonella dall'isolamento della coltura

Questa piattaforma computazionale analitica fornisce una guida pratica per microbiologi, ecologi ed epidemiologi interessati alla genomica delle popolazioni batteriche. Nello specifico, il lavoro qui presentato ha dimostrato come eseguire: i) mappatura filogenetica di genotipi gerarchici; ii) analisi dei genotipi basata sulla frequenza; iii) analisi di parentela e clonalità; iv) identificazione del lignaggio differenziando i loci accessori.

Estrazione euristica di genotipi gerarchici e loci genomici accessori in popolazioni batteriche

La Salmonella invade e si replica all'interno delle cellule epiteliali intestinali sia nei vacuoli specifici della Salmonella che libera nel citosol (iperreplicazione). Un protocollo basato sulla microscopia a fluorescenza ad alta produttività è descritto qui per quantificare i fenotipi intracellulari di Salmonella mediante due analisi di immagini complementari attraverso ImageJ, raggiungendo la risoluzione e il punteggio di una singola cellula.

Analisi automatizzata dei fenotipi intracellulari di Salmonella con ImageJ

La fattibilità di strategie di sequenziamento dell'intero genoma (WGS) utilizzando strumenti da banco ha semplificato l'interrogazione del genoma di ogni microbo di rilevanza per la salute pubblica in un ambiente di laboratorio. Viene descritto un adattamento metodologico del flusso di lavoro per WGS batterico e viene inoltre presentata una pipeline bioinformatica per l'analisi.

Caratterizzazione di un ceppo patogeno di Escherichia coli derivato da allevamenti di Oreochromis spp. che utilizzano il sequenziamento dell'intero genoma

Scopri la sequenziamento quasimetagenomico per la sicurezza alimentare usando separazione immunomagnetica e amplificazione MDA. Questo metodo consente il rilevamento e la sottotipizzazione rapida di Salmonella da campioni ambientali e alimentari.

Analisi metagenomica quasi di Salmonella da campioni ambientali e alimentari

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