Name: Manipolazione optogenetica dei circuiti neurali durante il monitoraggio degli stati di sonno/veglia nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Scopri la manipolazione optogenetica dei circuiti neurali nel nucleo del letto della stria terminale durante il monitoraggio degli stati di sonno/veglia nei topi. Questo metodo consente di esaminare le relazioni causali tra attività neuronale e regolazione del sonno.

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Questo studio è stato sostenuto dal Merck Investigator Studies Program (#54843), da un KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas, "WillDynamics" (16H06401) (T.S.) e da un KAKENHI Grant-in-Aid for Exploratory Research on Innovative Areas (T.S.) (18H02595).

Tutti gli esperimenti qui sono stati approvati dal Comitato per l'esperimento e l'uso degli animali dell'Università di Tsukuba, nel rispetto delle linee guida NIH.
1. Chirurgia animale, iniezione di virus, elettrodo per EEG/EMG e impianto in fibra ottica
ATTENZIONE: Occorre selezionare adeguate tecniche di protezione e manipolazione in base al livello di biosicurezza del virus da utilizzare. AAV deve essere utilizzato in una stanza isolata con grado P1A per l'iniezione, e il tubo che trasporta AAV deve essere sterilizzato con un'autoclave dopo che tutto il volume è esaurito. Il sito chirurgico e tutto il materiale impiantato devono essere puliti e sterili durante l'uso. NOT:</</c1> Vedere La Figura 1.
<ol><li>Disinfettare l'apparecchiatura chirurgica con l'autoclave.</li>
	<li>Anestetizza i topi con isoflurane utilizzando un vaporizzatore anestetico. Osservare fino a quando il mouse ha raggiunto la profondità desiderata di anestesia, determinata dalla perdita di risposta a pizzicare la coda con pinze. Applicare unguento oftalmico agli occhi per evitare che si annistringano.</li>
	<li>Disinfettare il campo chirurgico con soluzione di iodio o 70% EtOH (3x) e asciugare sufficientemente. Lasciare che il virus si scongeli sul ghiaccio durante l'intervento chirurgico. Coprire l'area chirurgica con carta da banco da laboratorio assorbente.</li>
	<li>Fissare la testa del mouse nell'apparato stereotassico con barre dell'orecchio e un pizzico naso. Dopo aver confermato che la testa è tenuta in modo stabile, fare un'incisione midsagittale nel cuoio capelluto per garantire le posizioni del bregma e lambda si trovano allo stesso livello su una linea orizzontale.</li>
	<li>Per evitare uno spazio di posizionamento, regolare in modo appropriato i livelli del pizzico del naso e delle barre dell'orecchio su e giù. Il bregma e la lambda si riferiscono all'intersezione tra i saggitalis sutura e sutura coronalis o sutura lambdoidal, rispettivamente (Figura 2).</li>
	<li>Utilizzare morsetti Serafin per tenere la pelle per mantenere l'accesso al cranio. Dopo l'esposizione del cranio, disinfettare la superficie del cranio con iodio o 5% H2O2, per consentire le suture craniche tra cui il bregma e lambda da visualizzare più chiaramente.</li>
	<li>Preparare l'iniezione vettoriale AAV:
	<ol>
<li>Lavare l'interno di una siringa da 10 mL (vedi Tabella deiMateriali) in sequenza con 70% EtOH, 100% EtOH e acqua sterilizzata, 5 volte ciascuna. Fissare la siringa nel morsetto di un braccio pompa di microiniezione e assicurarsi che tutta la soluzione nella siringa sia scarica.</li>
		<li>Aspirare con cura 2 l di olio minerale senza bolle d'aria, quindi aspirare il volume designato della soluzione del virus. Dopo l'aspirazione, manipolare il pulsante dello stantuffo e confermare che la soluzione antivirus emerge sulla punta dell'ago. NOT:</</c3> Il volume di iniezione della soluzione antivirus è stato determinato negli esperimenti pilota che utilizzano lo stesso ceppo di topo e lo stesso prodotto antivirus. La relazione tra il volume della soluzione virale e l'estensione dell'area di infezione dovrebbe essere stimata in anticipo.</li>
	</ol></li>
	<li>Vettore AAV iniettare:
	<ol>
<li>Regolare la punta dell'ago di microiniezione sul bregma e notare le coordinate come punto originale. Spostare la punta sul sito di iniezione designato (per il BNST: anteroposteriore , 0,2 mm, mediolaterale , 1,0 mm, dorsoventral - 4,2 mm) e posizionare la punta dell'ago sulla posizione. Mettere un segno sul cranio e fori di circa 2 mm di diametro utilizzando un trapano dentale con una fresa carbide da 0,7 mm. Fare attenzione a non danneggiare la dura o tessuto cerebrale.</li>
		<li>Dopo aver rimosso il sangue dai fori con un tampone di cotone, spostare lentamente l'ago nella posizione del BNST. Iniettare lentamente la quantità designata di soluzione virale (0,07 l/min) con un microiniettore meccanico. Dopo aver completato l'iniezione, lasciare l'ago per 5 min per consentire alla soluzione di infiltrarsi sufficientemente nel tessuto BNST. Estrarre con attenzione l'ago.</li>
		<li>Per l'iniezione bilaterale, ripetere i passaggi 1.8.1-1.8.2 sull'altro lato. Durante la procedura, mantenere il cranio umido con applicazioni di salina sterile. NOT:</</c2> Abbiamo usato impianti EEG/EMG personalizzati (W: 5 mm, D: 7 mm, H: 1 mm) con quattro elettrodi EEG (4 mm), due elettrodi EMG (2 mm; tagliare l'elettrodo da 4 mm a 2 mm con nipper) e 6 elettrodi (4,5 mm) (Figura 2A).</li>
	</ol></li>
	<li>Solder due fili in acciaio inox (vedi Tabella dei materiali) da cui 1 mm dell'isolamento viene rimosso da entrambe le estremità agli elettrodi EMG. Regolare il centro degli elettrodi sul bregma e contrassegnare la posizione di ogni elettrodo EEG (anteroposteriore - 1,5 mm, medio-1,0 mm) e determinare la posizione dell'impianto (Figura 2B).</li>
	<li>Impiantio fibre ottiche:
	<ol>
<li>Fissare un ferrule di fibra ottica al manipolatore e ruotare il braccio manipolatore in modo che abbia un angolo di 30 gradi contro una linea orizzontale (questo processo è necessario solo per evitare interferenze tra elettrodi e fibre ottiche, come nel caso della stimolazione BNST). Mettere la punta di fibra sul bregma e registrare le coordinate.</li>
		<li>Spostare la punta sulla riga di inserimento mirata e contrassegnare la posizione sul cranio. Posizionare anche segni aggiuntivi vicino al sito di inserimento per le viti di ancoraggio. Forare il cranio su ogni sito con un trapano dentale per inserire la fibra ottica e fissare la vite. Fissa la vite sul cranio. Fare attenzione a non rompere la dura o danneggiare qualsiasi tessuto da vite.</li>
		<li>Inserire delicatamente la fibra ottica fino a raggiungere sopra il BNST con un manipolatore. Il ferrule dovrebbe poggiare sul cranio rimanente (Figura 1B).</li>
		<li>Applicare il cemento dentale fotocurabile (vedi Tabella deimateriali) per coprire la fibra e la vite. Il tempo di reazione per solidificare la colla deve essere specificato dal manuale del produttore (il nostro materiale ha bisogno di esposizione alla luce per almeno 10 s con specifico generatore fotografico di lunghezza d'onda. Non è necessario asciugare la colla dopo questo).</li>
		<li>In questo passaggio, assicurarsi che nessun materiale (vite o colla) occupi lo spazio di montaggio per gli elettrodi. Inoltre, evitare di effettuare qualsiasi interruzione del cemento per il ferrule che si collega alla fibra ottica e al cavo. Ripetere i passaggi da 1.10.1-1.10.4 sul lato opposto per la stimolazione bilaterale.</li>
	</ol></li>
	<li>Fori di perforazione per elettrodi EEG/EMG. Inserire le punte degli elettrodi nei fori. Tenere l'impianto e applicare l'adesivo cianoacrilato nello spazio tra il cranio e gli elettrodi. Inserire di nuovo con attenzione a non interferire con alcun materiale.</li>
	<li>Coprire la circonferenza degli elettrodi e delle fibre ottiche con adesivo cianoacrilato seguito dall'applicazione dell'accelerante cianoacrita sull'adesivo. Questo passaggio evita di causare interruzioni nella zona di collegamento del cavo ferrule-to-optic o del filo elettrodo-a-piombo (Figura 1C). NOT:</</c1> Cianoacrylate adesivo e il suo accelerante sono dannosi per l'occhio del topo. Prestare attenzione a non causare la fuoriuscita di queste sostanze chimiche. Inoltre, fare attenzione a non toccare con forza gli elettrodi e le fibre al fine di evitare deviazioni impreviste immediatamente dopo la solidificazione adesiva.</li>
	<li>Esporre i muscoli del collo del mouse e inserire i fili per l'elettrodo EMG sotto il muscolo. Regolare la lunghezza dell'elettrodo EMG in modo che si localizzi appena sotto i muscoli nuchi. La connessione luminosa tra la punta dell'elettrodo e la fascia muscolare è sufficiente per catturare il segnale EMG.</li>
	<li>Applicare l'adesivo cianoacrilato per riempire gli impianti e solidificare l'adesivo con liquido di accelerazione. Quindi, mettere il mouse su un pad di calore per il recupero fino a quando non appare il riflesso posturale. Regolare la temperatura del termoma alla temperatura corporea di riposo degli animali (36,0 gradi centigradi in T-12 nel caso di topi C57BL6; non superare i 38,0 gradi centigradi). NOT:</</c0> Non è necessario un antibiotico per la chirurgia sterile.</li>
	<li>Segui le tue linee guida istituzionali locali per l'analgesia post-operatoria. Tenere i topi in una gabbia di casa per un periodo di recupero di almeno 7 giorni.</li>
</ol>2. Monitoraggio EEG/EMG con foto-eccitazione di neuroni mirati in stati di sonno specifici
ATTENZIONE: Questo protocollo include l'uso di apparecchiature laser di classe 3B o dispositivi LED. Gli sperimentatori devono essere a conoscenza delle informazioni di sicurezza. Sono necessari occhiali protettivi.
<ol><li>Prima di collegare il cavo laser alla fibra ottica, regolare l'intensità del laser con un scaler. Lesing la punta del cavo laser a una fibra ottica inutilizzata con un ferrule e confermare che non c'è spazio alla giunzione tra la fibra e il cavo.</li>
	<li>Accendere l'interruttore principale del laser e attendere 20 min per farlo riscaldare.</li>
	<li>Emettere il laser al controllo dell'intensità e regolare l'intensità del laser a 10 mW/mm2. Modificare la modalità laser in logica a transistor e verificare che gli impulsi di luce vengano emessi dalla fibra controllata dal regolatore di ripetizione che è impostata a 10 ms per la durata, 40 ms per il riposo, 20 volte per il ciclo e 20 volte la ripetizione (cioè 20 Hz di 10 ms impulsi di luce per 20 s).</li>
	<li>Dopo il periodo di recupero, spostare i topi nella camera sperimentale per la registrazione di EEG/EMG. Casa topi a una costante di 23 gradi centigradi con un ciclo di 12 h di luce / buio con cibo e acqua disponibili ad libitum.</li>
	<li>Collegare l'elettrodo impiantato e l'adattatore del cavo che è legato ad un anello di slittamento per evitare impigliamenti. Si raccomanda di coprire la giunzione con materiale impermeabile leggero come lamina di alluminio per evitare perdite laser. Se è necessario un esperimento bilaterale, utilizzare un anello di slittamento con un attacco biforcato per i cavi.</li>
	<li>In questo protocollo, valutiamo la latenza alla veglia dal sonno NREM o dal sonno REM, quindi il tempo di registrazione dovrebbe essere limitato nel tempo di zeitgeber ottimizzato (il valore di T0 è definito come il momento in cui la luce è accesa). Questo protocollo è stato condotto tra il protocollo T4 e T10. Lasciare che i topi rimangano liberamente nella camera sperimentale per almeno 1 h come acclimatazione.</li>
	<li>Durante il periodo sperimentale, monitorare i segnali EEG ed EMG nello stesso monitor e valutare lo stato del mouse come veglia, sonno NREM o sonno REM. Utilizzare il controllo del guadagno per ogni ondata per facilitare la distinzione di ogni stato.</li>
	<li>Per la misurazione della latenza di veglia del sonno NREM, osservare il sonno NREM stabile per 40 s o il sonno REM stabile per 30 s, quindi accendere l'interruttore del generatore di pattern per la fotostimolazione (questo protocollo genera 20 Hz di 10 ms impulsi di luce per 20 s). Confermare l'emissione del laser alle fibre ottiche impiantate.</li>
	<li>Registrare i segnali EEG/EMG fino a quando lo stato del sonno cambia in veglia. Se sono necessarie due o più sperimentazioni sperimentali, limitare la manipolazione optogenetica a una volta al giorno perché la fotostimolazione è un intervento artificiale che potrebbe influenzare l'architettura sonno/ veglia.</li>
	<li>Dopo l'esperimento, anestesizzare profondamente e perfemare con sterile salina e paraformaldeide (PFA) per il campionamento dell'intero cervello per l'analisi immunohistochimica26.</li>
</ol>3. Analisi del tempo di latenza dal sonno NREM alla Veglia
<ol><li>Dopo aver registrato i segnali EEG/EMG, trasferire i dati del segnale su un computer per il punteggio degli stati di sospensione/veglia. Questo protocollo descrive il metodo per l'analisi EEG con software di registrazione (vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Avviare l'applicazione di sospensione e fare clic sulla scheda File e selezionare Apri per scegliere i dati registrati (file .kcd). Fare clic sulla scheda Sospensione per selezionare Tempo eorale per la regolazione dell'intervallo di tempo per ogni epoca (usiamo 1 epoca/4 sec).</li>
	<li>Segnare manualmente gli stati di sonno / veglia in base ai segnali EEG/EMG, secondo i seguenti criteri: veglia, alta tensione EMG e bassa tensione EEG con alta frequenza; NREM, basso tono EMG e alta tensione EEG con frequenza alta (0,5-4 Hz); e REM, EMG indica l'atonia muscolare e la bassa tensione EEG con un'alta frequenza di 6-9 Hz. Uno stato che non continua consecutivamente per 16 s (cioè 4 epoche) non è definito come un cambiamento di stato perché non è uno stato stabile.</li>
	<li>Fare clic e tenere premuto il pulsante sinistro del mouse sulla prima epoca e trascinare il cursore fino a quando la tendenza specifica di più di 16 s (4 epoche) è terminata. Quindi, rilasciare il pulsante sinistro del mouse e scegliere lo stato appropriato (veglia o sonno NREM o sonno REM) nella finestra pop-up. Ripetere questa procedura per assegnare un punteggio a tutti i segnali EEG/EMG registrati nel file.</li>
	<li>Trova il tempo esatto di stimolazione nell'epoca in cui l'EEG mostra il sonno NREM o REM, e l'epoca che mostra la transizione di stato dopo il punto di stimolazione. Contare il numero di epoche tra i periodi subito dopo la stimolazione e poco prima della transizione di stato.</li>
	<li>Quindi moltiplicare il numero contato di epoche per 4 s (A). Nell'epoca della stimolazione, scattare una schermata e misurare la larghezza tra il punto di stimolazione e la fine dell'epoca. Quindi, dividere la lunghezza misurata per l'intera lunghezza dell'epoca e moltiplicare per 4 s (B). Analogamente, calcolare la durata della sospensione NREM nell'epoca del cambiamento di stato, il che significa il tempo tra l'inizio dell'epoca e il punto di modifica dello stato (C).</li>
	<li>Somma A, B e C per ottenere la latenza dal sonno NREM alla veglia. La stessa procedura viene utilizzata per l'analisi della transizione di stato dal sonno REM alla veglia.</li>
</ol>

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<li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Prigge, M., Schneider, F., Davidson, T. J., O’Shea, D. J., Sohal, V. S., Goshen, I., Finkelstein, J., Paz, J. T., Stehfest, K., Fudim, R., Ramakrishnan, C., Huguenard, J. R., Hegemann, P., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortical+excitation%2Finhibition+balance+in+information+processing+and+social+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction.</a> Nature. 40 (6), 1301-1315 (2012).</li>
</ol>

Questo progetto è stato in parte sostenuto finanziariamente da Merck & Co.

Abbiamo presentato un metodo per valutare l'effetto della stimolazione optogenetica dei neuroni con particolari identità chimiche sulle transizioni di stato del sonno / veglia e ha dato un esempio di manipolazione dei neuroni GABABNST. I nostri dati hanno mostrato che l'eccitazione optogenetica dei neuroni GABABNST si traduce in transizione immediata dal sonno NREM alla veglia.
Vari progetti sperimentali sono disponibili a causa dello sviluppo di numerosi tipi di strument...

Il sonno è essenziale per una funzione cognitiva ottimale. Recenti scoperte suggeriscono anche che i disturbi nel sonno sono associati a una vasta gamma di malattie1,2,3. Anche se le funzioni del sonno sono ancora in gran parte irrisolte, progressi sostanziali sono stati fatti di recente nella comprensione dei circuiti neurali e dei meccanismi che controllano il sonno / veglia stati4. Nei mammiferi, ci sono tre stati di vigilanza: veglia, sonno non rapido degli occhi (NREM), e rapido movimento degli occhi (REM) sonno. La Veglia è caratterizzata da oscillazioni EEG veloci (5-12 Hz) di bassa ampiezza con un'attività motoria mirata e sostenuta. Il sonno NREM è definito da oscillazioni lente (1-4 Hz) di alta ampiezza (onde delta), con mancanza di coscienza e attività motoria mirata. Il sonno REM è caratterizzato da oscillazioni relativamente veloci (6-12 Hz) di bassa ampiezza e atonia muscolare bilaterale quasi completa5.
Borbely ha proposto una teoria della regolazione della veglia del sonno nota come il modello di processo a due6,7. Un processo omeostatico, indicato anche come processo S, rappresenta la pressione del sonno che si accumula durante la veglia e si dissipa durante il sonno. Un altro processo, indicato come processo C, è un processo circadiano, che spiega perché i livelli di vigilanza fluttuano nel ciclo di 24 h. Oltre a questi due processi, fattori allostatici sono anche importanti per la regolazione del sonno/ veglia8,9. I fattori allostatici includono stati nutrizionali ed emozioni. La paura e l'ansia sono di solito accompagnate da un aumento dell'eccitazione insieme alle risposte autonomiche e neuroendocrine10,11,12. Si ritiene che il sistema limbico svolgi un ruolo nella regolazione della paura e dell'ansia, e i meccanismi alla base delle risposte autonome e neuroendocrine sono stati studiati ampiamente, ma il percorso attraverso il quale il sistema limbico influenza gli stati di sonno/veglia non ancora rivelato. Un gran numero di studi recenti che utilizzano opto e farmacogenetica hanno suggerito che i neuroni e i circuiti neuronali che regolano gli stati di sonno/veglia sono distribuiti in tutto il cervello, tra cui cortice, prosencefalo basale, talamo, ipotalamo, e il tronco encefalico. In particolare, i recenti progressi nell'optogenetica ci hanno permesso di stimolare o inibire specifici circuiti neurali in vivo con elevate risoluzioni spaziali e temporali. Questa tecnica permetterà di progredire nella nostra comprensione dei substrati neurali di sonno e veglia, e come gli stati di sonno / veglia sono regolati da processi circadiani, pressione del sonno, e fattori allostatici, tra cui l'emozione. Questo documento ha lo scopo di introdurre come utilizzare la manipolazione optogenetica combinata con la registrazione sonno/veglia, che potrebbe avere il potenziale per aggiornare la nostra comprensione dei connettomi e dei meccanismi nel cervello che svolgono un ruolo nella regolazione del sonno NREM, del sonno REM, e la veglia. La comprensione di questo meccanismo con cui il sistema limbico regola gli stati di sonno/veglia è di fondamentale importanza per la salute, perché l'insonnia è di solito associata all'ansia o alla paura di non riuscire a dormire (somnifobia).
Si ritiene che il BNST svolgga un ruolo essenziale nell'ansia e nella paura. GAD 67-esprimendo neuroni GABAergic sono una popolazione maggiore del BNST12,13. Abbiamo esaminato l'effetto della manipolazione optogenetica di questi neuroni (GABABNST) sugli stati di sonno/ veglia. Uno dei più grandi progressi nelle neuroscienze negli ultimi anni sono stati i metodi che consentono la manipolazione di neuroni con particolari identità chimiche in vivo, con alte risoluzioni spaziali e temporali. L'optogenetica è molto utile per dimostrare i collegamenti causali tra l'attività neurale e le risposte comportamentali specifiche14. Descriviamo l'optogenetica come un metodo per esaminare la connettività funzionale dei circuiti neurali definiti nella regolazione degli stati di sonno/veglia. Utilizzando questa tecnica, sono stati compiuti grandi progressi nella comprensione dei circuiti neuronali che regolano gli stati di sonno/veglia15,16,17,18,19 . In molti casi, gli opsin sono specificamente introdotti nei neuroni con particolari identità chimiche nelle regioni cerebrali selettive da una combinazione di topi Cre-driver e trasferimento genico mediato da Cre-inducible AAV. Inoltre, l'espressione focale di opsine fotosensibili come la channelrhodopsin 2 (ChR2)20 o l'archeerhodopsin (ArchT)21 combinata con un sistema Cre-loxP o Flp-FRT ci permette di manipolare una popolazione neuronale selettiva e specifica percorso neurale22.
Descriviamo qui esperimenti sui neuroni GABAergici nel BNST come esempio. Per esprimere le operazioni in una popolazione neuronale designata, i topi del conducente Cre appropriati e i vettori del virus dipendenti dal Cre sono più frequentemente utilizzati. Sono utili anche linee transgeniche o knock-in in cui le opsine sono espresse in particolari popolazioni neuronali. Nei seguenti esperimenti, abbiamo usato i topi Knock-in GAD67-Cre 23 in cui solo i neuroni GABAergici esprimono la Ricombinani Cre con un background genetico C57BL/6J e un vettore AAV che contiene ChR2 (hChR2 H134R) fuso con EYFP o EYFP come controllo con un interruttore "FLEx (Flip-excision)"24. La procedura descrive specificamente l'eccitazione optogenetica dei neuroni GABAergici nel BNST durante il monitoraggio degli stati di sonno/veglia25.

<table><tbody><tr><td>Giunti rotanti in fibra ottica 1x1</td><td>Doric</td><td>FRJ 1x1 FC-FC</td><td>per optogenetica</td></tr><tr><td>Connettore a 6 pin</td><td>KEL corporation</td><td>DSP02-006-431G</td><td></td></tr><tr><td>Presa a 6 pin</td><td>Hirose</td><td>21602X3GSE</td><td></td></tr><tr><td>Convertitore A/D</td><td>Nippon koden</td><td>N/A</td><td>Convertitore analogico/digitale</td></tr><tr><td>AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP</td><td></td><td></td><td>3.70&volte; 1013(copie genomiche/ml)</td></tr><tr><td>AAV10-EF1a-DIO-EYFP</td><td></td><td></td><td>5.82&volte; 1013(copie genomiche/ml)</td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Fuji film</td><td>014-23302</td><td></td></tr><tr><td>Amplificatore</td><td>Nippon koden</td><td>N/A</td><td>per registrazione EEG/EMG</td></tr><tr><td>Vaporizzatore anestetico</td><td>Muromachi</td><td>MK-AT-210D</td><td></td></tr><tr><td>Iniettore automatico</td><td>KD scientific</td><td>780311</td><td></td></tr><tr><td>Taglierina in metallo duro</td><td>Minitor</td><td>B1055</td><td>&phi; 0,7 millimetri. Indicato come trapano dentale, utilizzato con micromotore rotativo ad alta velocità&nbsp;</td></tr><tr><td>Adesione cianoacrilato&nbsp; (Aron alfa A) e accelerazione</td><td>Konishi</td><td>#30533</td><td></td></tr><tr><td>Lampada polimerizzante dentale</td><td>3M</td><td>Elipar S10</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo epossidico</td><td>Konishi</td><td>#04888</td><td>isolamento attorno alla saldatura del cavo a 6 pin e schermato</td></tr><tr><td>Cavo patch in fibra ottica (ramificazione)</td><td>Doric</td><td>BFP(#)_50/125/900-0.22</td><td></td></tr><tr><td>Gad67-Cre mouse</td><td>forniti dal Dr. Kenji Sakimura</td><td></td><td>Il gene della ricombinasi Cre viene inserito nella siringa di Hamilton dell'allele Gad67</td></tr><tr><td></td><td>Hamilton</td><td>65461-01</td><td></td></tr><tr><td>Kit micromotore rotativo ad alta velocità</td><td>FOREDOM</td><td>K.1070</td><td>Utilizzato con taglierina in metallo duro</td></tr><tr><td>Manicotto di interconnessione</td><td>Thorlab</td><td>ADAF1</td><td>&phi; Ceramica da 2,5 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Pfizer</td><td>871119</td><td></td></tr><tr><td>Laser&nbsp; &nbsp;</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>N/A</td><td>473 nm lunghezza d'onda</td></tr><tr><td>Controllo dell'intensità laser</td><td>COHERENT</td><td>1098293</td><td></td></tr><tr><td>Stimolatore laser</td> Centro <td>di ricerca biologica</td><td>STO2</td><td>riferito come generatore di impulsi nel testo</td></tr><tr><td>Fibra ottica con ghiera</td><td>Thorlab</td><td>FP200URT-CANNULA-SP-JP</td><td></td></tr><tr><td>pAAV2-rh10</td><td>fornito da PennVector Core</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA</td><td>Addgene</td><td>plasimid # 20296</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA</td><td>fornito dal Dr. Karl Deisseroth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cavo patch</td><td>Dorico</td><td>D202-9089-0,4 0,4</td><td>m di lunghezza, conduttore laser tra laser e giunto rotante</td></tr><tr><td>pHelper</td><td>Stratagene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cemento dentale fotopolimerizzabile</td><td>3M</td><td>56846</td><td></td></tr><tr><td>Morsetto Serafin</td><td>Stoelting</td><td>52120-43P</td><td></td></tr><tr><td>Cavo schermato</td><td>mogami</td><td>W2780</td><td>Saldatura a presa a 6 pin per la registrazione EEG/EMG</td></tr><tr><td>Camera di registrazione del sonno</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Su misura (21 cm&volte; 29 cm &volte; 19 cm) con supporto per serbatoio d'acqua</td></tr><tr><td>Software per la segnalazione del sonno</td><td>KISSEI COMTEC</td><td>N/</td><td>A per analisi EEG/EMG</td></tr><tr><td>Collettore rotante</td><td>neuroscienze,inc</td><td>N/A</td><td>per analisi EEG/EMG</td></tr><tr><td>Vite inossidabile</td><td>Yamazaki</td><td>N/A</td><td>&phi; 1,0 x 2,0</td></tr><tr><td>Filo inossidabile</td><td>Filo Cooner</td><td>AS633</td><td>&nbsp; Telaio stereotassico da 0,0130 pollici di diametro</td></tr><tr><td>con console digitale</td><td>Koph</td><td>N/A</td><td>Modello 940</td></tr><tr><td>Ago per siringa</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td></td></tr><tr><td>Software di registrazione vitale</td><td>KISSEI COMTEC</td><td>N/</td><td>A per la registrazione EEG/EMG</td></tr></tbody></table>

manipolazione optogenetica dei circuiti neurali durante il monitoraggio degli stati di sonno/veglia nei topi

Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice

Negli ultimi anni, l'optogenetica è stata ampiamente utilizzata in molti campi della ricerca neuroscientifica. In molti casi, un'opsina, come la rodopsina di canale 2 (ChR2), è espressa da un vettore di virus in un particolare tipo di cellule neuronali in vari topi Cre-driver. L'attivazione di queste operazioni è innescata dall'applicazione di impulsi di luce che vengono forniti da laser o LED attraverso cavi ottici, e l'effetto dell'attivazione è osservato con una risoluzione temporale molto alta. Gli sperimentatori sono in grado di stimolare acutamente i neuroni durante il monitoraggio del comportamento o di un altro risultato fisiologico nei topi. L'optogenetica può consentire strategie utili per valutare la funzione dei circuiti neuronali nella regolazione degli stati di sonno/veglia nei topi. Qui descriviamo una tecnica per esaminare l'effetto della manipolazione optogenetica dei neuroni con una specifica identità chimica durante l'elettroencefalogramma (EEG) e il monitoraggio dell'elettromiogramma (EMG) per valutare lo stadio del sonno dei topi. Ad esempio, descriviamo la manipolazione dei neuroni GABAergici nel nucleo del letto della stria terminalis (BNST). L'eccitazione optogenetica acuta di questi neuroni innesca una rapida transizione alla veglia quando applicata durante il sonno NREM. La manipolazione optogenetica insieme alla registrazione EEG/EMG può essere applicata per decifrare i circuiti neuronali che regolano gli stati di sonno/ veglia.

Il presente studio ha mostrato l'effetto dell'eccitazione optogenetica dei neuroni GABABNST sulla transizione dello stato del sonno. ChR2-EYFP è stato espresso focalmente nei neuroni GABA nel BNST. Uno studio istochimico di ibridazione in situ ha mostrato che ChR2-EYFP è stato colocalizzato nei neuroni che esprimono segnali mRNA GAD 67, indicando che questi sono neuroni GABAergic. I campioni di fette immunoistochimiche hanno confermato la posizione della fibra ottica, la cui pu...

Qui, descriviamo i metodi di manipolazione optogenetica di particolari tipi di neuroni durante il monitoraggio degli stati di sonno/veglia nei topi, presentando il nostro recente lavoro sul nucleo del letto della stria terminale come esempio.

Manipolazione optogenetica dei circuiti neurali durante il monitoraggio degli stati di sonno/veglia nei topi

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 ...

Questa procedura può aiutarci a identificare la funzione di specifico circuito neurologico che sono coinvolti nella regolazione della veglia del sonno con manipolazione meno invasiva e alta risoluzione temporale. Questo metodo ci consente la superficie di monitoraggio EEG in tempo reale in combinazione con la manipolazione di uno specifico circuito neurologico per esaminare la relazione causale tra circuiti e stati di veglia del sonno. Shota Kodani dimostrerà la procedura.Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del piedi, applicare un unguento agli occhi dell'animale e utilizzare le barre dell'orecchio e il perno del naso all'apparato stereotattico per stabilizzare la testa del mouse anestetizzato su un cuscinetto assorbente. Quando la testa è fissata in posizione, fare un'incisione medio-sagittale nel cuoio capelluto per confermare che l'intersezione tra la sutura sagittalis e la sutura coronalis o sutura lambdoidea si trova in una linea orizzontale allo stesso livello. Per evitare uno spazio di posizionamento, regolare il pizzicamento del naso e le barre dell'orecchio in base alle esigenze.Quindi l'uso di morsetti serafin per tenere aperta la pelle disinfetta la superficie esposta del cranio per consentire una visualizzazione più chiara delle suture cranici. Per iniettare il vettore virale adeno-associato, caricare una siringa sterilizzata a etanolo da 10 millilitro con due microlitri di olio minerale, seguita dal volume sperimentale del virus da iniettare. Utilizzare la pompa di microiniezione per regolare la punta dell'ago di microiniezione sul bregma e annotare le coordinate come punto di origine.Quindi spostare la punta nel sito di iniezione designato e posizionare la punta dell'ago sulla posizione. Contrassegnare il cranio nel sito di iniezione e utilizzare un trapano dentale dotato di una fresa in carburo da 0,7 millimetri per praticare un foro di circa due millimetri di diametro nel cranio. Dopo aver rimosso il sangue da tutto il foro con un batuffolo di cotone, spostare lentamente l'ago nel nucleo del letto della stria terminalis o BSNT e iniettare lentamente il volume designato della soluzione virale.Quindi lasciare l'ago in posizione per cinque minuti per consentire alla soluzione di infiltrarsi sufficientemente nel tessuto BNST prima di ritrarre accuratamente l'ago. Per l'elettroencefalogramma, o EEG, e l'elettromiogramma, o EMG, impianto di elettrodi, prima saldare due fili di acciaio inossidabile da cui è stato rimosso un millimetro di isolamento da entrambe le estremità agli elettrodi EMG e posizionare il centro degli elettrodi sul bregma. Quindi contrassegnare la posizione per ogni elettrodo EEG.Per determinare la posizione dell'impianto in fibra ottica, attaccare un ferrule in fibra ottica al manipolatore e ruotare il braccio manipolatore su un angolo più o meno di 30 gradi rispetto a una linea orizzontale. Metti la punta della fibra sul bregma e registra le coordinate. Spostare la punta sulla linea di inserimento mirata e contrassegnare la posizione sul cranio e la posizione per la vite di ancoraggio accanto al sito di inserimento.Utilizzare il trapano dentale per forare il cranio in ogni sito e utilizzare il manipolatore per inserire delicatamente la fibra ottica fino a raggiungere il BNST. Il ferrule dovrebbe poggiare sul cranio rimanente. Fissare la fibra al cranio con una vite di ancoraggio, facendo attenzione a non rompere la dura o danneggiare alcun tessuto.Quindi coprire la fibra e avvitare con cemento dentale foto-polimerizzabile. Successivamente, praticare fori per elettrodi EEG/EMG e inserire la punta del primo elettrodo in un unico foro. Tenendo l'impianto con una mano, applicare l'adesivo cianoacrilato nello spazio tra il cranio e l'elettrodo e inserire l'elettrodo per il resto del percorso, facendo attenzione a non danneggiare alcun tessuto.Una volta posizionati tutti gli elettrodi, coprire la circonferenza degli elettrodi e delle fibre ottiche con adesivo cianoacrilato aggiuntivo e accelerante cianoacrilato per evitare di causare interruzioni al ferrule al cavo ottico e all'elettrodo per condurre zone di collegamento del filo. Ora esponi i muscoli del collo e inserisci i fili per l'elettrodo EMG sotto il muscolo. Regolare la lunghezza dell'elettrodo EMG in modo che si adatti appena sotto i muscoli nucali e riempire gli impianti con più adesivo cianoacrilato e accelerante.Quindi posizionare il mouse su un riscaldatore con monitoraggio fino a completa ricompensa. Per il monitoraggio EEG/EMG durante la foto-eccitazione di neuroni mirati, utilizzare prima uno scalare per regolare l'intensità del laser e utilizzare un ferrule per intere la punta del cavo laser a una fibra ottica inutilizzata. Verificare che non vi sia spazio alla giunzione tra la fibra e il cavo.Dopo 20 minuti, emetti il laser riscaldato al controllo dell'intensità e regola l'intensità a 10 milliwatt per millimetro al quadrato. Impostare la durata dell'impulso luminoso su 10 millisecondi, il periodo di riposo su 40 millisecondi, il ciclo su 20 e la ripetizione su 20. Cambiare la modalità laser in logica transistor e confermare che gli impulsi di luce vengono emessi dalla fibra controllata dal regolatore di pattern.Collegare l'elettrodo impiantato e l'adattatore per cavi, quindi coprire la giunzione con materiale impermeabile leggero per evitare perdite laser. E quando il laser è pronto, spostare i topi nella camera sperimentale per la registrazione EEG / EMG. Per valutare la latenza alla veglia da movimenti oculari non rapidi o sonno rapido del movimento degli occhi, limitare il tempo di registrazione e ottimizzare il tempo di guadagno del sito e lasciare che i topi si muovano liberamente nella camera sperimentale per almeno un'ora.Durante il periodo sperimentale, monitorare i segnali EEG ed EMG nella stessa schermata di registrazione. Valuta lo stato del mouse come veglia, sonno non rapido del movimento degli occhi o sonno rapido del movimento degli occhi usando il controllo del guadagno per ogni onda per facilitare la distinzione di ogni stato. Per la misurazione del sonno di movimento oculare non rapido alla latenza di veglia, osservare il sonno stabile non rapido del movimento degli occhi per 40 secondi, quindi accendere il generatore di modelli per la stimolazione fotografica e confermare l'emissione laser alle fibre ottiche impiantate.Quindi registrare i segnali EEG/EMG fino a quando lo stato di sospensione non cambia in veglia. Qui sono rappresentate tracce EEG / EMG prima e dopo la stimolazione fotografica durante il sonno non rapido del movimento degli occhi. Un EEG ad alta tensione e a bassa frequenza senza segnali EMG, rappresenta un sonno di movimento degli occhi non rapido.La stimolazione fotografica ha innescato una transizione acuta alla veglia circa due secondi dopo la stimolazione nei topi che esprimono la channelrhodopsin-2 mentre i topi di controllo non hanno dimostrato questa transizione, suggerendo che l'eccitazione dei neuroni BNST GABA durante il sonno non rapido del movimento degli occhi innesca una rapida induzione della veglia. Al contrario, la stimolazione fotografica durante il sonno rapido del movimento degli occhi non ha avuto alcun effetto, quindi un effetto di transizione è emerso solo nel sonno non rapido del movimento degli occhi. È importante prestare attenzione a coordinazioni precise per le fasi di iniezione del virus e impianto in fibra ottica.Le tracce EEG/EMG catturate durante l'analisi del sonno possono essere utilizzate per valutare le conseguenze della manipolazione fotografica sui diversi stati vigilanti nei topi. Questa tecnica ci aiuterà anche a identificare altri componenti e circuiti coinvolti nella regolazione degli stati di veglia del sonno. Utilizzare occhiali protettivi per evitare danni laser all'occhio e assicurarsi di sterilizzare sempre il contenitore vettoriale del virus adeno-associato dopo l'uso.

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La procedura è descritta per manipolare l'attività dei neuroni cerebrali corticali piramidali optogenetically mentre l'elettroencefalogramma, elettromiogramma, e cerebrale concentrazione di lattato sono monitorati. Registrazioni sperimentali vengono eseguite su cavo-frenati topi, mentre subiscono spontanee sonno / veglia cicli. Optogenetic apparecchiatura è assemblata nel nostro laboratorio, apparecchi registrazione è commercialmente disponibile.

Elettroencefalografia simultanea, in tempo reale misura della concentrazione di lattato e la manipolazione Optogenetic di attività neuronale nella corteccia cerebrale Rodentia

Fonte: Kodani, S., et.al. Manipolazione optogenetica dei circuiti neurali durante il monitoraggio degli stati di sonno/veglia nei topi. J. Vis. Exp. (2019)Questo video dimostra la manipolazione optogenetica dei circuiti neurali coinvolti nella transizione dal sonno alla veglia nei topi. La procedura prevede l'impianto chirurgico di una fibra ottica ed elettrodi nel cervello e nei muscoli per consentire la stimolazione luminosa e la registrazione elettrofisiologica. Fornendo luce per attivare i...

Manipolazione optogenetica dei circuiti neurali per la transizione dal sonno alla veglia nei topi

Questo video dimostra un protocollo per modulare le oscillazioni theta in un modello murino geneticamente modificato con canali ionici sensibili alla luce nei suoi neuroni del setto mediale GABAergico. Fornendo impulsi luminosi all'ippocampo, il protocollo mira a sincronizzare l'attività neuronale e generare oscillazioni theta, che vengono registrate come potenziali di campo locale.

Manipolazione selettiva delle oscillazioni theta in un modello murino

Il recente sviluppo di strumenti neuroscienza che combinano genetica e ottica, definito "optogenetics", consente il controllo sulle attività del circuito neurale con un livello senza precedenti di risoluzione spaziale e temporale. Qui forniamo un protocollo per l'integrazione nella registrazione vivo con la manipolazione optogenetic di sottoinsiemi geneticamente definiti di neuroni piramidali corticali prefrontali e subicular.

Un metodo per High Fidelity optogenetic controllo dei singoli Piramidale neuroni<em&gt; In vivo</em

La registrazione dell'elettroencefalogramma (EEG) e dell'elettromiogramma (EMG) nei topi che si comportano liberamente è un passo fondamentale per correlare il comportamento e la fisiologia con il sonno e la veglia. Il protocollo sperimentale qui descritto fornisce un sistema basato su cavo per l'acquisizione di registrazioni EEG ed EMG nei topi.

Procedura di registrazione poligrafica per la misurazione del sonno nei topi

Qui presentiamo procedure sperimentali e analitiche per descrivere le dinamiche temporali delle variabili neurali e cardiache del sonno non REM nei topi, che modulano la risposta al sonno agli stimoli acustici.

Quantificare la dinamica infrarosso del potere spettrale e della frequenza cardiaca nei topi addormentati

Descriviamo l'uso di optogenetica e registrazioni elettrofisiologiche per manipolazioni selettive delle oscillazioni di teta hippocampal (5-10 Hz) in topi si comporta. L'efficacia di trascinamento ritmo è controllata mediante potenziali di campo locale. Una combinazione di opto - e farmacogenetica inibizione indirizzi la lettura efferente di sincronizzazione hippocampal.

Optogenetica trascinamenti di teta Hippocampal oscillazioni nel comportarsi topi

Descriviamo un metodo di alto-rendimento di misurazione sonno per mezzo di monitoraggio basato su attività di home-gabbia. Questo metodo offre vantaggi rispetto ai metodi tradizionali basati su EEG. E è convalidata anche per la determinazione della durata totale di sonno e può essere un potente strumento per monitorare il sonno nei modelli del roditore della malattia umana.

Determinazione non invasiva, High-throughput di durata di sonno in roditori

Questo lavoro introduce un metodo per eseguire un unitario optogenetica registrazione in modo affidabile da un mouse sveglio usando un optrode di vetro su misura.

Optogenetica identificazione di un tipo di un neurone con un Optrode di vetro in topi svegli

Con la manipolazione optogenetica di specifiche popolazioni neuronali o regioni cerebrali, il comportamento può essere modificato con alta risoluzione temporale e spaziale in animali in movimento libero. Utilizzando diversi strumenti optogenetici in combinazione con fibre ottiche cronicamente impiantate, è possibile eseguire una varietà di modulazioni neuronali e test comportamentali.

Manipolazione optogenetica dell'attività neuronale per modulare il comportamento nei topi in movimento libero

Questo articolo descrive un protocollo per la manipolazione di bersagli molecolari nella corteccia cerebrale utilizzando virus adeno-associati e per il monitoraggio degli effetti di questa manipolazione durante la veglia e il sonno utilizzando registrazioni elettrocorticografiche.

Registrazione elettrocorticografica delle aree della corteccia cerebrale manipolate utilizzando un virus adeno-associato che prende di mira Cofilin nei topi

Scopri la manipolazione optogenetica dei circuiti neurali nel nucleo del letto della stria terminale durante il monitoraggio degli stati di sonno/veglia nei topi. Questo metodo consente di esaminare le relazioni causali tra attività neuronale e regolazione del sonno.

Manipolazione optogenetica dei circuiti neurali durante il monitoraggio degli stati di sonno/veglia nei topi

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