Microbiopsy assorbente campionamento ed estrazione di RNA per sangue mininvasivo, simultaneo e analisi della pelle

Questo metodo può facilitare la creazione di marcatori organici per le malattie della pelle e anche ridurre il rischio per i partecipanti alla ricerca clinica. I principali vantaggi di questa tecnica sono che non richiede un allenamento intensivo e non lascia cicatrici. Cinque minuti prima della microbiopsia, posizionare un tubo di centrifuga vuoto a due millilitri sul ghiaccio secco per cinque minuti.

Indossare guanti monouso, spruzzare le mani e gli strumenti con il 70% di etanolo prima di sanificare il sito di applicazione sul soggetto con una salvietta alcolica. Rimuovere la micro biopsia dal pacchetto di radiazioni gamma sterilizzate senza toccare il microneedle e tirare lo stantuffo fino a quando non si sente un clic e lo stantuffo si blocca in posizione. Puntare il dispositivo caricato con un angolo approssimativamente perpendicolare alla pelle da campionare, facendo attenzione che l'area di campionamento sia in una posizione fissa e applicare il dispositivo sulla pelle entro almeno un chilogrammo di forza.

Quindi premere il grilletto e tenere il dispositivo in posizione per almeno dieci secondi. Se il dispositivo viene rilasciato prima di dieci secondi, c'è una maggiore probabilità di variazione nell'assorbimento del sangue e anche nell'analisi successiva. Una volta che il campione è stato assorbito, estrarre delicatamente lo stantuffo e il microneedle assorbente dalla custodia e utilizzare forcep sterili per tirare i due fori del microneedle per rimuoverlo dallo stantuffo.

Aggiungere 50 microlitri di tampone di estrazione al tubo su ghiaccio secco e posizionare il microneedle intatto nel tubo sul lato dell'ago di ghiaccio secco verso il basso. Fare attenzione a non lasciare che la punta del microneedle tocchi nulla durante il processo di rimozione. Vortice il tubo per tre o cinque secondi per raccogliere del materiale campionato dalla punta del microneedle e incubare il tubo in un blocco di calore o bagno d'acqua per 30 minuti a 42 gradi celsius.

Al termine dell'incubazione, utilizzare forcep sterili per posizionare l'estremità posteriore del livello del microneedle con il bordo superiore del tubo di microfugo e chiudere il coperchio del tubo in modo che la parte superiore del microneedle sia tenuta in posizione tra il cappuccio e il tubo. Centrifugare il tubo per raccogliere il materiale campionato dallo strato assorbente del dispositivo e utilizzare le forcep per rimuovere con cura il microneedle senza immergere di nuovo la punta nella soluzione tampone. Centrifugare nuovamente il campione e trasferire con cura il supernatante in un nuovo tubo di microfuga.

Aggiungere quindi 250 microlitri di tampone di condizionamento su una membrana filtrante a colonna di purificazione per un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente e diluire il tampone mediante centrifugazione. Aggiungere 50 microlitri di etanolo al campione di RNA estratto con miscelazione delicata e trasferire la miscela nella colonna di purificazione precondizione. Centrifugare immediatamente il tubo due volte per rimuovere il flusso passante, seguito da un lavaggio in cento microlitri di tampone di lavaggio uno.

Per la digestione del DNA, aggiungere 40 microlitri di miscela di incubazione DNA appena preparata direttamente sulla membrana della colonna di purificazione per un'incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente seguita da un lavaggio con 40 microlitri di tampone di lavaggio uno. Al termine della centrifugazione, lavare la colonna con 100 microlitri di tampone di lavaggio due e controllare la colonna di purificazione per eventuali tamponi di lavaggio residui. Trasferire la colonna di purificazione in un tubo di micro centrifuga da 0,5 millilitri fornito nel kit di estrazione dell'RNA e posizionare la punta della pipetta direttamente sulla membrana della colonna di purificazione per aggiungere 11 microlitri di acqua RNA sPRE alla colonna.

Dopo due minuti di incubazione a temperatura ambiente, centrifugare la colonna una volta per distribuire l'acqua sPRE dell'RNA in tutta la colonna e una volta per elutare l'RNA. Quindi conservare il campione totale di RNA a meno 80 gradi celsius se la sintesi cDNA non viene eseguita immediatamente. Il microneedle microbiopsico assorbente è costituito da due strati di piastra d'acciaio con uno strato assorbente nel mezzo per il campionamento simultaneo della pelle e del sangue.

L'uso di una microbiopsia assorbente induce solo eritema minore, che non è evidente dopo 48 ore. Dopo la puntura, alcuni piccoli pezzi di pelle vengono catturati vicino alla punta del microneedle e il sangue viene assorbito nella carta filtrante. Quando il microneedle assorbente viene rimosso immediatamente dopo la puntura, il volume del campione e la successiva quantità di mRNA estratto sono significativamente inferiori a quelli ottenuti dopo aver tenuto premuto per dieci secondi dopo la puntura.

Livelli simili di espressione del marcatore cutaneo vengono rilevati dopo l'uso della microbiopsia assorbente e della microbiopsia cutanea precedente mediante analisi quantitativa pcr. Ma un livello significativamente più elevato di espressione del bio marker dei globuli bianchi viene rilevato dopo il campionamento della microbiopsia assorbente, suggerendo che il microneedle microbiopsico assorbente funziona meglio per la raccolta del sangue mantenendo la stessa capacità per la cattura del campione cutaneo come con la microbiopsia cutanea. Quindi, durante l'applicazione della tecnica, è fondamentale ricordare che l'applicazione del dispositivo in base a ciò che suggeriamo è essenziale per ottenere risultati affidabili.

Quindi, seguendo questa procedura, altri metodi, come la PCR in tempo reale, possono essere seguiti per la profilazione dell'espressione relativamente genica. Anche se stiamo ancora sviluppando il dispositivo, siamo fiduciosi che la tecnica abbia spianato la strada alle ricerche cliniche per l'esecuzione del campionamento, per applicazioni dermatologiche cosmetiche o pediatriche perché è così semplice ed è minimamente invasiva.