Name: Misurazione delle dinamiche di sensibili alla forza della proteina in cellule viventi, utilizzando una combinazione di tecniche di fluorescenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Impara a misurare le dinamiche di proteine sensibili alla forza in cellule viventi con sensori di tensione FRET e FRAP. Questo metodo fornisce informazioni molecolari sulla meccanobiologia cellulare.

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Questo lavoro è stato supportato da un premio della National Science Foundation CAREER (NSF-CMMI-14-54257) così come di sovvenzioni da parte della American Heart Association (16GRNT30930019) e il National Institutes of Health (R01GM121739-01) assegnato al Dr. Brenton Hoffman e un nazionale Science Foundation Graduate Research Fellowship assegnato a Katheryn Rothenberg. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale della NSF o NIH.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il metodo FRAP FRET consente per la misura diretta della dinamica della proteina sensibile alla forza, una proprietà che è stato difficile sondare direttamente all'interno di cellule viventi. La sensibilità del dynamics della proteina per carico molecolare è critica alla funzione della proteina come un trasmettitore di forza o trasduttore. Caricamento è necessaria per la trasmissione di entrambi generato internamente ed esternamente applicate forze, chiamato mechanotransmission e per la conversione di tali forze in segna...

L'ambiente extracellulare è una fonte ricca di spunti sia biochimici e fisici che determinano il comportamento delle cellule. In particolare, la natura fisica del microambiente possa mediare principali funzioni cellulari, tra cui la crescita delle cellule, migrazione e differenziazione1,2,3,4. Disregolazione della meccanica del microambiente è una componente critica per molte malattie che non hanno ancora adeguato trattamento, quali cancro5, aterosclerosi6e7di fibrosi. Una comprensione completa di come le cellule convertono stimoli fisici in segnali biochimicamente rilevabili, un processo chiamato meccanotrasduzione, richiede la delucidazione dei meccanismi molecolari che mediano la trasmissione della forza, sia all'interno e all'esterno delle cellule e all'interno di più strutture subcellulari.
All'interno di strutture subcellulari, proteine si rivolgono costantemente sopra; associazione e separazione basata sulla forza del loro interazioni con l'associazione partner8. Per le forze per essere trasmesso con successo attraverso una distanza fisica, ci devono essere una catena ininterrotta di interazioni proteina-proteina, significante che il fatturato di una proteina deve essere abbastanza lento per sostenere e trasmettere forza alla sua associazione partner9. Mentre interazioni proteina-proteina consistono generalmente di diversi legami non covalenti tra i domini della proteina, l'interazione spesso è concettualizzato come uno stato legato che può eseguire la transizione a uno stato non associato sotto diverse condizioni10, 11. per un'interazione proteina-proteina data, è possibile che in vigore non può avere effetto sulla durata dell'interazione, conosciuto come un "legame ideale", ridurre la durata dell'interazione, conosciuto come un "legame di slittamento" o aumentare la durata dell'interazione , conosciuto come un "legame di cattura"10. Così, c'è un intricato rapporto tra carico proteico e dinamica di proteine che ci riferiamo come sensibili alla forza dinamica.
Verso la comprensione l'effetto del carico sulle dinamiche di vincolo, è stata effettuata una serie di esperimenti altamente informativi a livello di singola molecola. Utilizzando proteine isolate, o frammenti di proteine e tecniche di manipolazione come magnetiche pinzette, pinzette ottiche e microscopia a forza atomica, questi studi hanno dimostrato interazioni della proteina-proteina di sensibili alla forza per più rilevanti proteine11,12. Entrambe le integrine13 e caderine14, che sono proteine transmembrana importante per formare interazioni cellula-matrice e cellula-cellula, rispettivamente, hanno dimostrato alterazioni nella dinamica dovuta a caricare. All'interno della cellula, vinculina viene reclutato a entrambi talin15 e α-catenina16 in un modo dipendente dalla forza e può formare un legame di cattura con l'actina17, che indica un ruolo cruciale per vinculin sia adesioni focali (FAs) e giunzioni intermedie (AJs ) sotto carico. Studi di singola molecola consentono per l'isolamento delle interazioni specifiche proteina-proteina e producono risultati inequivocabili, ma essi non tengono conto della complessità dell'ambiente cellulare.
Pietra miliare gli esperimenti hanno dimostrato che diverse strutture subcellulari, tra cui FAs e AJs, mechanosensitive ed esibiscono Assemblea avanzata in risposta a carichi generati internamente o esternamente applicato18,19, 20,21,22. Inoltre, diversi modelli teorici hanno suggerito che potrebbe essere guidato mechanosensitive assemblaggio di proteine sensibili alla forza dinamica23,24,25. Per esaminare queste dinamiche di sensibili alla forza nelle cellule viventi, sono stati presi alcuni approcci indiretti. FRAP e relative tecniche forniscono una metodologia relativamente semplice per la misurazione dinamica della proteina in cellule26,27,28,29. Tuttavia, la misurazione del carico proteico è stato più limitata. Un approccio tipico è quello di confrontare la dinamica della proteina in cellule con e senza l'esposizione ad un inibitore del citoscheletro utilizzato per ridurre il generale cella contrattilità8,30,31. Concettualmente, questo è un confronto tra un carico elevato e basso carico stato. Tuttavia, non c'è nessuna quantificazione del carico attraverso la proteina in entrambi gli Stati, e ci possono essere effetti biochimici non intenzionali dell'inibitore, tale perdita di siti di legame chiave lungo un filamento di F-actina. Un altro approccio, specifico per FAs, è stato per misurare lo sforzo di forza totale sul substrato dalla FA usando microscopia di forza di trazione per approssimare carico molecolare ed esaminare la relazione con le dinamiche di una singola proteina all'interno la FA32. Mentre questo approccio consente per la quantificazione della forza totale, non fornisce informazioni specifiche molecolarmente. FAs sono costituiti da più di 200 differenti proteine, molte delle quali può sopportare carico33. Così, misurare la produzione di forza totale di un FA potenzialmente oscura la possibilità di molteplici vie di trasmissione di forza e in modo affidabile non fornisce una misura del carico su una proteina specifica.
A differenza di precedenti approcci in mechanobiology, l'avvento dei sensori di tensione basato su FRET permette diretta misurazione del carico di proteine specifiche all'interno di vita di cellule34,35,36. Qui, presentiamo un protocollo che combina sensori di tensione basato su FRET con la misura di FRAP-base della dinamica della proteina. Ci riferiamo a questa tecnica come FRET-FRAP. Questo approccio permette la misurazione simultanea di carico proteico e la dinamica della proteina, permettendo la valutazione delle dinamiche sensibili alla forza della proteina in cellule viventi (Figura 1). Già, la tecnica FRET-FRAP è stata applicata allo studio delle dinamiche sensibili alla forza della meccanica del linker proteina vinculin37. Sensori di tensione sono stati sviluppati per numerose proteine che sono rilevanti in una varietà di strutture subcellulari. Ad esempio, i sensori sono stati sviluppati per vinculin34 e talin38,39 a FAs, caderine e catenine in AJs40,41,42, nesprin nel complesso nucleare LINC 43, α-actinina44 e filamina36 del citoscheletro e MUC-1 nel glicocalice45, tra gli altri46. Allo stesso modo, FRAP è che una tecnica comunemente usata è stata utilizzata sulle proteine meccanosensibili entro le adesioni focali8,31, adherens junctions47, actina corteccia26e nucleo48. Movimento in avanti, che la tecnica FRET-FRAP dovrebbe essere ampiamente applicabile a uno qualsiasi di questi sensori esistenti o appena sviluppato sensori, consentendo per le misurazioni di sensibili alla forza dinamica in un'ampia varietà di contesti e strutture subcellulari. A tal fine, forniamo un dettagliato protocollo generalizzato per implementare la tecnica FRET-FRAP applicabile a questi diversi sistemi. Speriamo che questo vi permetterà una vasta gamma di esperimenti chiarire i ruoli delle varie proteine meccanosensibili nella regolazione della trasmissione della forza e nel mediare il comportamento delle cellule.

<table><tbody><tr><td>0,05% tripsina-EDTA</td><td>Thermo Fisher</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldeide</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>60x Obiettivo NA1.35</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO 60XO</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione antibiotica-antimicotica (100x)</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Fase automatizzata</td><td>Precedente</td><td>H117EIX3</td><td></td> scientifica</tr><tr><td>Specchio dicroico personalizzato</td><td>Chroma Technology Corp</td><td></td><td>T450/514rpc</td></tr><tr><td>Filtro di emissione mTFP1 personalizzato</td><td>Chroma Technology Corp</td><td></td><td>ET485/20m</td></tr><tr><td>Filtro di eccitazione mTFP1 personalizzato</td><td>Chroma Technology Corp</td><td></td><td>ET450/30x</td></tr><tr><td>Filtro di eccitazione Venus personalizzato</td><td>Chroma Technology Corp</td><td></td><td>ET514/10x</td></tr><tr><td>DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium</td><td>Zaffiro</td><td>MC102</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5796</td><td>con L-glutammina e bicarbonato di sodio</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>HyClone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina, Corning umano</td><td></td><td>47743-654</td><td></td></tr><tr><td>FRAPPA Diapositiva di calibrazione</td><td>Andor</td><td></td><td>fornita insieme all'unità FRAPPA</td></tr><tr><td>Sistema FRAPPA con 515 nm Laser</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piatti al fluoro con fondo in vetro</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35</td><td></td></tr><tr><td>HEK293-T Cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>bromuro di esadimetrina, polibrene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza invertita</td><td></td> Sigma <td>Aldrich</td> D6429 ad alto contenuto di glucosio Dulbecco's Modified Eagle's Olympus IX83 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> JMP Pro <td></td></tr><tr><td> Software</td><td>SAS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lambda 10-3 Ruote portafiltri motorizzate</td><td>Sutter Instruments</td><td>LB10-NW</td><td></td></tr><tr><td>Lampada ad arco LambdaLS con lampadina allo xeno priva di ozono da 300 W</td><td>Sutter Instruments</td><td>LS/OF30</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Software MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminoacidi non essenziali</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140050</td><td></td></tr> MetaMorph per <tr><td>sistema di microumidificazione</td><td></td> Olympus <td>Olympus</td> Bioptechs 130708 <td></td></tr><tr><td>MoFlo Astrios EQ Cell Sorter</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td></td></tr><tr><td>Riscaldatore obiettivo Medium</td><td>Bioptechs</td><td>150819-13</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> OptiMEM Thermo Fisher 31985070 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata fosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G Busta Plasmide Addgene</td><td></td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>pRRL Regalo vettoriale</td><td></td><td></td><td>dal Dr. Kam Leong (Columbia University)</td></tr> <tr><td>psPax2 Imballaggio Plasmide</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Fotocamera</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XT/XF Centrifuga</td><td>Thermo Fisher</td><td>75004505</td><td></td></tr><tr><td>Stabile Z Stage Warmer</td><td>Bioptechs</td><td>403-1926</td><td></td></tr><tr><td>Filtro Emissioni</td><td>Venus Semrock</td><td>FF01-571/72</td><td></td></tr></tbody></table>

misurazione delle dinamiche di sensibili alla forza della proteina in cellule viventi, utilizzando una combinazione di tecniche di fluorescenza

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cellule di percepiscono e rispondono ai segnali fisici nel loro ambiente convertendo stimoli meccanici in segnali biochimicamente rilevabili in un processo chiamato mechanotransduction. Un passo fondamentale nella meccanotrasduzione è la trasmissione di forze tra gli ambienti interni ed esterni. Per la trasmissione di forze, ci deve essere una continua, ininterrotta sollevatore fisico creato da una serie di interazioni proteina-proteina. Per un'interazione proteina-proteina data, carico meccanico non può avere alcun effetto sull'interazione, portare alla dissociazione più veloce dell'interazione, o addirittura stabilizza l'interazione. Comprendere come molecolare carico detta turnover delle proteine in cellule viventi in grado di fornire preziose informazioni circa lo stato meccanico di una proteina, a sua volta chiarire il suo ruolo nella meccanotrasduzione. Le tecniche esistenti per la misurazione dinamica di proteine sensibili alla forza mancano misure dirette di carico proteico o si basano su misure effettuate di fuori del contesto cellulare. Qui, descriviamo un protocollo per il recupero di trasferimento-fluorescenza Förster energia di risonanza dopo tecnica photobleaching (FRET-FRAP), che consente la misurazione delle dinamiche di sensibili alla forza della proteina nelle cellule viventi. Questa tecnica è potenzialmente applicabile a qualsiasi sensore di tensione basato su FRET, facilitare lo studio della dinamica di proteine sensibili alla forza in varietà di strutture subcellulari e in diversi tipi cellulari.

FRET-FRAP si compone della combinazione di due tecniche di fluorescenza, FRET e FRAP. Come ci siamo concentrati sugli effetti del carico proteico, abbiamo usato tensione basato su FRET sensori34,46. Questi sensori sono spesso basati su un modulo composto da due proteine fluorescenti, come mTFP1 e VenusA206K, collegati da un linker flagelliform (Figura 1A) sensore di tensionamento. Quando il modulo vie...

Qui, presentiamo un protocollo per l'uso simultaneo di Förster risonanza energia basati sul trasferimento di tensione sensori per misurare recupero carico e fluorescenza della proteina dopo photobleaching per misurare la dinamica della proteina che permette la misurazione di sensibili alla forza dynamics della proteina nelle cellule viventi.

Misurazione delle dinamiche di sensibili alla forza della proteina in cellule viventi, utilizzando una combinazione di tecniche di fluorescenza

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

Questo metodo può rispondere a domande chiave nel campo della meccanobiologia, come il modo in cui le forze vengono trasmesse e percepiti all'interno delle cellule, nonché tra le cellule e il loro ambiente. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente l'accesso alle informazioni su scala molecolare su come le proteine rispondono alle forze meccaniche all'interno del contesto nativo della cellula vivente. Sebbene questo metodo sia stato applicato specificamente allo studio della vinculina della proteina dell'adesione focale, può anche essere applicato ad altre proteine meccanicamente sensibili, come talina, caderine o nesprina.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché una corretta configurazione dell'imaging è difficile ma necessaria per il successo dell'analisi. Iniziare questa procedura con l'espressione stabile del costrutto del sensore di tensione nel tipo di cella desiderato, come descritto nel protocollo di testo. Per preparare i substrati per la semina cellulare, acquisire quattro piatti con fondo di vetro da 35 millimetri.Lavorando in una cappa di coltura cellulare, in un tubo conico da 15 millilitri, fare quattro millilitri da 10 microgrammi per fibronectina millilitro in soluzione salina sterile tamponata con fosfato, o PBS. Invertire delicatamente il tubo una volta per mescolare e lasciare riposare la soluzione per cinque minuti nel cappuccio di coltura cellulare. Quindi pipettare un millilitro di soluzione di fibronectina su ogni piatto con fondo di vetro.Lasciare la soluzione di fibronectina sui piatti per un'ora a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius. Quindi aspirare la soluzione di fibronectina e risciacquare una volta con PBS. Lasciare un millilitro di PBS sui piatti fino a quando le cellule non sono pronte per la semina.Dopo aver contato le cellule, seminare 30.000 cellule su ogni piatto di vetro rivestito di fibronectina con il mezzo completo appropriato per un volume finale di 1,5 millilitri. Lasciare che le cellule si diffondano per quattro ore dopo la semina. A due ore di diffusione, aspirare i mezzi di crescita e risciacquare una volta con i mezzi di imaging.Lasciare 1,5 millilitri del supporto di imaging. Riscaldare il microscopio come descritto nel protocollo di testo prima di iniziare la calibrazione. Per calibrare il laser FRAP, aprire prima la finestra di configurazione laser.Impostare l'impostazione Illuminazione sulle impostazioni di illuminazione FRAP appropriate per l'esposizione laser al campione. Quindi impostare l'impostazione Illuminazione sulle impostazioni di illuminazione appropriate per l'imaging solo del fluoroforo accettore. Selezionate l'obiettivo da calibrare in Impostazione sistema coordinate (Coordinate system).Deselezionare Fare clic manualmente sui punti di calibrazione e selezionare Visualizza immagini durante la calibrazione. Impostate il tempo di divaro su 10.000 microsecondi e il numero di impulsi su 100. Ora posizionare la diapositiva di calibrazione, fatta di bromuro di etidio sigillato tra uno scivolo di vetro e uno scivolo di copertura, nell'adattatore del palco con il lato di scorrimento del coperchio verso il basso.Utilizzare le impostazioni di illuminazione dell'accettore per concentrarsi sulla superficie della diapositiva, identificabile come piano focale con il segnale più luminoso. Piccoli difetti nel rivestimento saranno visibili per aiutare a concentrarsi. Spostare la diapositiva in un'area con fluorescenza uniforme attraverso il piano di imaging.Fare clic su Crea impostazione per la prima calibrazione o Impostazione aggiornamento per le calibrazioni successive. Il software inizializza il processo di calibrazione, sbiancando e rilevando automaticamente la posizione del punto sbiancato. Garantire una calibrazione riuscita valutando l'immagine finale, che sarà una griglia tre per tre di punti sbiancati che dovrebbero essere distribuiti in modo uniforme e a fuoco.Salvare l'immagine di calibrazione per riferimento futuro. Rimuovere la diapositiva di calibrazione e archiviare in modo sicuro. La calibrazione deve essere eseguita prima di iniziare ogni esperimento, ma non deve essere eseguita tra i campioni.Preparare la configurazione della microscopia per l'imaging a cellule vive, preferibilmente con uno stadio riscaldato e un obiettivo, nonché un controllo dell'anidride carbonica. Lasciare equilibrare per 20 minuti. Ora posiziona uno dei campioni generati di cellule che esprimono il sensore di tensione nel supporto del microscopio per l'imaging.Lasciare equilibrare le cellule per 10 minuti. Per garantire la salute delle celle con immagini, mantenere la temperatura a 37 gradi Celsius nella camera di imaging. Utilizzare una pompa peristaltica per passare l'anidride carbonica umidificata del 5% sui campioni a 15 millilitri al minuto per mantenere il pH.Aprite lo strumento Acquisizione multidimensionale o MDA e impostatelo con i parametri di imaging FRET, inclusi i diversi set di filtri. Salvare l'MDA nella cartella sperimentale con il nome MDA_FRET_date. Impostare un altro MDA con i parametri di imaging FRAP, inclusi i diversi set di filtri, le impostazioni timelapse e il Journal per pulsare il laser dopo l'acquisizione pre-candeggina.Salvare l'MDA nella cartella sperimentale con il nome MDA_FRAP_date. Nella barra degli strumenti nella parte superiore dello schermo selezionare Diario, Avvia registrazione. Aprire la finestra MDA, caricare lo stato MDA_FRET_date e premere Acquisisci.Quindi caricare lo stato MDA_FRAP_date e premere Acquisisci. Al termine dell'acquisizione, nella barra degli strumenti nella parte superiore dello schermo, selezionare Diario, Interrompi registrazione. Salvare questo diario nella cartella sperimentale con il nome di FRETFRAP_date aggiungerlo a una barra degli strumenti per un facile accesso.Chiudere la finestra MDA. Spostarsi nel campione utilizzando l'acquisizione dell'immagine in Acquisisci, Acquisisci con un tempo di esposizione minimo e un filtro di densità neutro per identificare le celle di interesse. Impostare la messa a fuoco automatica continua passando a Dispositivi, Messa a fuoco.Mettere a fuoco manualmente il campione fino a raggiungere il piano di imaging corretto. Fate clic su Imposta messa a fuoco continua (Set Continuous Focus) e attendete che il sistema si adatti. Una volta regolato il sistema, fare clic su Avvia messa a fuoco continua.Quindi trova una cella che esprima il sensore di tensione con una chiara localizzazione in una struttura di interesse e aggancia un'immagine. Disegna una regione rettangolare di interesse, o ROI, per evidenziare dove sbiancare. Archiviare questa posizione del ROI.Inizializza ora il FRETFRAP_date di registrazione, che inizierà l'acquisizione di immagini FRET, seguito dall'inizializzazione del timelapse FRAP. Ripeti questi passaggi fino a quando non vengono acquisiti da 10 a 15 set di immagini. Quindi analizzare i dati FRET-FRAP come descritto nel protocollo di testo.Ecco i risultati rappresentativi per l'imaging FRET del sensore di tensione della vinculina, a seguito della segmentazione e del mascheramento per isolare le aderenze focali. La variazione turale del carico di vinculina può essere vista attraverso la cella. L'imaging e l'analisi FRAP possono essere influenzati dalla stabilità dell'adesione focale.Un'adesione focale che si sta trasferendo rapidamente durante il periodo di imaging può essere difficile da tracciare con precisione. Spesso questo è indicato da una curva FRAP che contiene discontinuità e ininterpretabile. Per una vinculina di tipo selvatico, esiste una correlazione inversa tra carico proteico e tasso di turnover, che indica che la vinculina è stabilizzata con la forza.L'introduzione di una mutazione nella vinculina per effettuare il suo legame con la talina si traduce in un'inversione della correlazione, indicando che la vinculina che non è in grado di legare la talina è destabilizzata dalla forza. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di preparare correttamente i campioni, assicurarsi che le celle esprimano il sensore a livelli endogeni e scegliere attentamente i parametri di imaging. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come l'immunofluorescenza, la misurazione della dinamica della scala cellulare o cellule impegnative con vari inibitori al fine di rispondere a domande aggiuntive come come la proteina di interesse interagisce con altri componenti subcellulari per coordinare la risposta alla forza.

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Impara a misurare le dinamiche di proteine sensibili alla forza in cellule viventi con sensori di tensione FRET e FRAP. Questo metodo fornisce informazioni molecolari sulla meccanobiologia cellulare.

Misurazione delle dinamiche di sensibili alla forza della proteina in cellule viventi, utilizzando una combinazione di tecniche di fluorescenza (Video) | JoVE Journal

Misurazione delle dinamiche di sensibili alla forza della proteina in cellule viventi, utilizzando una combinazione di tecniche di fluorescenza

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