Name: Costruzione di un foglio di multistrato delle cellule staminali mesenchimali con un sistema di cultura dinamica 3D (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Impara a costruire fogli cellulari multistrato di cellule staminali mesenchimali con un sistema di perfusione dinamica 3D. Questo metodo migliora l'apporto nutrizionale in vitro e preserva le proprietà staminali per terapie rigenerative efficaci.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato supportato dal National Natural Science Foundation della Cina (concessione numero 31771064); la scienza e la tecnologia pianificazione progetto della provincia di Guangdong (sovvenzione numeri 2013B010404030, 2014A010105029 e 2016A020214012); la scienza e la tecnologia pianificazione progetto di Guangzhou (concessione numero 201607010063); e l'innovazione dello studente non laureato e il programma di formazione all'imprenditorialità (concessione numero 201610559028); la National Science Foundation per giovani scienziati della Cina (grant numero 31800819).

Tutte le cellule staminali e procedure di esperimento sugli animali sono state condotte secondo le linee guida etiche della guida nazionale per la cura e l'uso di animali da laboratorio e approvate dal comitato di uso (Guangzhou, Cina) e Jinan University Animal Care.
1. preparazione dell'impalcatura DPP con il PLA2 decellularizzazione metodo14
Nota: Vedere Figura 1A per un disegno schematico del metodo di decellularizzazione2 PLA.
<ol><li>Preparare 100 mL di soluzione di2 200 U/mL PLA. Aggiungere 0,5 g di sodio desossicolato e 2 mL di PLA2 in 198 mL di soluzione tampone di carbonato. Questa soluzione deve essere usata entro 24 ore dopo la preparazione.</li>
	<li>Ottenere il pericardio porcino fresco (FPP) da macello e restituire al laboratorio entro 1 h. Nota: La FPP deve essere conservata a 4 ° C durante il trasporto. Passaggi: 1.2-1.10 dovrebbero essere condotta con continua agitazione in un bagno di acqua termostatata.</li>
	<li>Lavare accuratamente la FPP con 200 mL di soluzione tampone fosfato (PBS) contenente 1% di penicillina-streptomicina in un becher da 500 mL a 10 ° Cfor 10 min ripetere questo passaggio x 2.</li>
	<li>Dividere la FPP in due strati e rimuovere il tessuto adiposo con pinze e le forbici. Nota: Tenere la FPP bagnato con l'aggiunta di 50 mL di PBS ogni 20 min durante la rimozione del tessuto adiposo.</li>
	<li>Modellare la FPP 10x10 cm2 pezzi con le forbici. Lavare la FPP con 200 mL di soluzione tampone di carbonato (CBS) contenente 1% di penicillina-streptomicina in un becher da 500 mL a 10 ° C per 10 min. Ripetere questo passaggio x 2.</li>
	<li>Trasferire la FPP per acqua pura e inzupparlo a 10° C per 12 h.</li>
	<li>Immergere i campioni di2 cm 10x10 in 50 mL di CBS contenente 200 U/mL PLA2 e 0,5% (p/v) sodio desossicolato soluzione a 37 ° C per 6 h.</li>
	<li>Lavare i campioni con CBS contenente 1% di penicillina-streptomicina a 10 ° C per 10 min. Ripetere questo passaggio x 2.</li>
	<li>Immergere ogni campione in 50 mL di CBS contenente 200 U/mL PLA2 e 0,5% (p/v) sodio desossicolato soluzione a 37 ° C per 2 h.</li>
	<li>Lavare i campioni con CBS contenente 1% di penicillina-streptomicina a 10 ° C per 2 h. Ripetere questo passaggio per 10 volte almeno. I campioni su piatti piani e asciugarli fino a peso costante nel forno a temperatura costante a 55 ° C. Nota: Il campione deve essere asciugata completamente. Pesare il campione DPP ogni 10 min e ripetere 3 volte o fino a quando il peso non cambia.</li>
	<li>Forma ogni campione DPP in un cerchio di 10,5 mm di diametro con un trapano. Confezione ogni DPP in un sacchetto sigillato sterile.</li>
	<li>Sterilizzare i campioni DPP a raggi gamma (25 kGy). Memorizzati i campioni DPP a 4 ° C prima dell'uso. Nota: Tutti i campioni possono essere conservati fino a sei mesi a 4 ° C.</li>
</ol>2. preparazioni per la cella foglio costruzione
<ol><li>Autoclave tutti gli strumenti e i componenti di vettore del tessuto a 121 ° C per 30 min, compresi i tubi centrifughi di 1,5 mL, pinze, pinze, forbici, a denti nero basi (componente portante del tessuto) e anelli di tensione bianco (componente portante del tessuto).</li>
	<li>Preparare 20 mL di soluzione di saccarosio di 10% privo di germi. Peso 2 g di saccarosio e sciogliere il saccarosio in 18 mL di acqua ultrapura. Sterilizzare in autoclave la soluzione di saccarosio al 10% a 121 ° C per 30 min o filtro la soluzione con un filtro da 0,22 µm.</li>
	<li>Autoclave i dispositivi di sistema dinamico di aspersione a 121 ° C per 30 min, compreso un gas cambio attrezzature, una bottiglia di vetro da 500 mL, un contenitore di cultura di aspersione e i tubi di tessuto connettivi.</li>
	<li>Preparare gli strumenti sterilizzati in autoclave e tessuto componenti del vettore. Mettere la parte nera di base dell'elemento portante del tessuto in una piastra di coltura.</li>
	<li>Pick up un'impalcatura DPP secca e metterlo al centro della base nera. Mettere un anello bianco di tensionamento sul patibolo DPP e fissarlo nell'elemento portante del tessuto. Nota: Assicurarsi l'impalcatura è totalmente fisso nell'elemento portante del tessuto e non c'è nessuno spazio tra la base nera e l'anello di tensione bianco. In caso contrario, separare il vettore di tessuto e fissare nuovamente il patibolo.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l di terreno di coltura sul patibolo DPP per reidratazione. Nota: Se l'impalcatura non viene risolto anche nel supporto del tessuto, il terreno di coltura si infiltrano la piastra di coltura.</li>
	<li>Mettere l'impalcatura in un incubatore a 37 ° C e lasciare in ammollo per 15 min.</li>
</ol>3. preparazione delle cellule per cella foglio costruzione
Nota: Questo protocollo è per la coltura cellulare usando un piatto di 100 mm. Per una schematica della costruzione della struttura celle multistrato, vedere Figura 1B .
<ol><li>Isolare le BMSC13. Nota: Questo metodo è progettato per la costruzione di un strato di cellule MSC multistrato. Ratto BMSC sono utilizzati nel presente protocollo. Le BMSC sono isolati utilizzando il metodo aderente intero midollo osseo, e le BMSC sono espanse in vitro per ottenere sufficienti quantità di cellule.<ol>
<li>Autoclave gli strumenti a 121 ° C per 30 min, tra cui pinze, pinze dentate e forbici. Preparare una siringa da 2 mL per iniezione e terreno di coltura BMSC (Dulbecco modificato dell'Aquila medio [DMEM], 10% siero bovino fetale, glutamina 1% e 1% di penicillina-streptomicina).</li>
		<li>Eutanasia i ratti maschii di Sprague-Dawley (deviazione standard) di tre-settimana-vecchio dalla dislocazione della vertebra cervicale. Immergere l'animale in 100 mL di soluzione di alcool di 75% in un becher per 5 min.</li>
		<li>Prendere l'animale fuori il becher e posizionarlo incline sul tavolo operatorio. Incidere la pelle sul dorso dell'animale con forbici e pinze. Isolare i tessuti della pelle e del muscolo per esporre i femori di coscia.</li>
		<li>Isolare i femori di coscia e metterlo in 30 mL di PBS in una provetta da centrifuga 50 mL. Inserire due femori di coscia in una provetta. Vortexare la provetta da centrifuga per lavare il tessuto. Ripetere questo passaggio x 2.</li>
		<li>Entrambe le estremità dei femori di tagliare con le forbici ed esporre la cavità del midollo.</li>
		<li>Aspirare 2 mL di terreno di coltura BMSC con una siringa di iniezione. Inserire l'ago nella cavità del midollo e scovare il midollo osseo con terreno di coltura. Scovare ogni femori due coscia in una piastra di coltura di 100 mm.</li>
		<li>Per ogni piatto di cultura di 100mm, aggiungere 2 mL di terreno di coltura nella piastra di coltura. Mettere la piastra di coltura in incubatore a 37 ° C e coltura statica per 72 h.</li>
		<li>Togliere la piastra di coltura dall'incubatrice. Sostituire il surnatante con 6 mL di terreno di coltura fresco.</li>
		<li>Osservare BMSCs primario sotto un microscopio. In seguito, passaggio le BMSC ogni 5-7 gg.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prendere le cellule fuori dell'incubatrice. Osservare le cellule al microscopio e scegliere celle adatte per costruzione di strato delle cellule. Quando le BMSC raggiungere confluenza di 80% - 90%, le cellule possono essere scelti come le cellule seminate.</li>
	<li>Rimuovere il terreno di coltura dalla piastra di coltura. Lavare delicatamente le cellule con 2 mL di PBS caldo. Rimuovere tutti i PBS dalla piastra di coltura e rendere sicuro no liquidi resti. Aggiungere 2 mL di tripsina 0,25% (o un'altra soluzione di dissociazione) al piatto e incubare a 37 ° C per 3 min.</li>
	<li>Fermare l'effetto della tripsina aggiungendo 2 mL di terreno di coltura e lavare delicatamente le cellule dal piatto. Trasferire la sospensione cellulare in una nuova provetta da centrifuga da 15 mL. Centrifugare le cellule a 225 x g per 5 min.</li>
	<li>Eliminare il surnatante. Risospendere le cellule con 3 mL di soluzione di saccarosio al 10% (p/v). Nota: soluzione di saccarosio al 10% (p/v) viene utilizzato per lavare le cellule per ottenere un impasto uniforme delle cellule-idrogel nei passaggi seguenti.</li>
	<li>Aspirare 10 µ l di sospensione cellulare e contare il numero di cellulare con un emocitometro. Calcolare il volume necessario per il passaggio successivo. Per foglio di una cella, vengono utilizzati BMSCs 3 milioni.</li>
	<li>Estrarre le cellule 3 milioni e trasferirli in una provetta da centrifuga da 15 mL nuovo. Centrifugare le cellule a 225 x g per 5 min.</li>
	<li>Eliminare il surnatante. Risospendere le cellule con 1 mL di soluzione di saccarosio al 10% (p/v). Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 1,5 mL. Nota: Utilizzando un tubo da centrifuga 1,5 mL è utile per preparare la miscela di cella-idrogel.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 260 xg per 5 minuti completamente rimuovere il supernatante e ottenere il sedimento cellulare.</li>
</ol>4. preparazione delle BMSC e il RAD16-ho miscela peptidica Hydrogel
Nota: Vedere Figura 1B per una schematica della costruzione della struttura celle multistrato.
<ol><li>Aggiungere 20 µ l di soluzione di saccarosio al 10% (p/v) per il tubo centrifugo 1.5 mL. Risospendere le BMSC delicatamente e ottenere una sospensione uniforme. Nota: Non generare eventuali bolle durante la risospensione.</li>
	<li>Aggiungere 20 µ l di RAD16-ho peptide idrogel nella parte superiore della sospensione. Mescolare delicatamente il RAD16-io sospensione delle cellule e del peptide con la punta della pipetta. Quando la sospensione cellulare e idrogel sono mescolati insieme, pipettare delicatamente l'impasto un paio di volte.</li>
	<li>Estrarre l'impalcatura DPP da parte del vettore di tessuto e aspirare delicatamente il terreno di coltura con un puntale. Nota: Accertarsi che l'impalcatura DPP è completamente reidratato prima di aggiungere la miscela di cella-idrogel.</li>
	<li>Aspirare la miscela e uniformemente aggiungerlo al patibolo DPP. Nota: Il volume totale della miscela sarebbe circa 40-50 µ l. Si consiglia di aggiungere la miscela 10 µ l in un momento dal centro verso l'esterno dell'impalcatura.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di terreno di coltura alla parte inferiore dell'elemento portante del tessuto. Mettere il foglio di cella nell'incubatore 37 ° C per 5 min.</li>
	<li>Prendere il foglio delle cellule dall'incubatrice. Delicatamente aggiungere 4 mL di terreno di coltura nella piastra di coltura e immergere il foglio delle cellule. Mettere il foglio di cella nell'incubatore 37 ° C per 2 h di coltura statica.</li>
</ol>5. cultura in Vitro di un foglio di celle multistrato 3D utilizzando un sistema di cultura dinamica
Nota: Vedere Figura 1 per una schematica del sistema dinamico 3D.
<ol><li>Preparare il sistema di perfusione dinamici, tra cui una pompa peristaltica, apparecchiature di scambio di gas, una bottiglia di vetro da 500 mL, un contenitore di cultura di aspersione e i tubi di tessuto connettivi. Assemblare il sistema di perfusione dinamica come mostrato nella Figura 2.</li>
	<li>Aggiungere 200 mL di terreno di coltura per la bottiglia di vetro sterile. Inserire il foglio delle cellule nella camera del contenitore di cultura. Nota: Prestare attenzione alla direzione della superficie superiore dello strato di cellule.</li>
	<li>Aggiungere 3 mL di terreno di coltura nel contenitore del tessuto e chiudere il contenitore. Mettere il sistema dinamico di aspersione nell'incubatrice e avviare la pompa. Impostare la portata della pompa peristaltica a 8 mL/min cultura strato di cellule nel sistema dinamico di perfusione per 48 h.</li>
</ol>6. ottenere un strato di cellule MSC multistrato
<ol><li>Autoclave gli strumenti e i componenti di vettore del tessuto a 121 ° C per 30 min, inclusi tubi centrifughi 1,5 mL, forcipe e forcipe dentato.</li>
	<li>Tirare fuori l'ingresso condotto dalla bottiglia di vetro per interrompere l'alimentazione di coltura per il contenitore. Nota: Arrestare la pompa peristaltica, quando il contenitore di cultura è vuoto.</li>
	<li>Prendere il foglio di cella dal contenitore di cultura e metterlo in una piastra di coltura.</li>
	<li>Utilizzare una pinza per immobilizzare il vettore di tessuto e un altro forcipe dentato per separare l'anello bianco dalla base nera. Infine, ottenere strato di cellule BMSCs multistrato.</li>
	<li>Per breve conservazione, ogni strato di cellule possa essere trasferito a un tubo centrifugo 1.5 mL con il forcipe. L'impalcatura DPP deve essere collegato alla parete interna del tubo centrifugo, e strato di cellule dovrebbe diffondere quanto più possibile la provetta da centrifuga.</li>
	<li>Delicatamente aggiungere 1 mL di terreno di coltura nel tubo centrifugo da immergere il foglio delle cellule. Chiudere il tappo del tubo centrifugo e memorizzare strato di cellule a 4 ° C. Nota: Strato di cellule dovrebbe essere trapiantato o analizzato quanto prima. Si consiglia di utilizzare il foglio di cella all'interno di 4 h.</li>
</ol>

<ol><li>Miyahara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayered+mesenchymal+stem+cells+repair+scarred+myocardium+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction.</a> Nature Medicine. 12 (4), 459-465 (2006).</li>
<li>Narita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+cell-sheet+technique+eliminates+arrhythmogenicity+of+skeletal+myoblast-based+therapy+to+the+heart+with+enhanced+therapeutic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The use of cell-sheet technique eliminates arrhythmogenicity of skeletal myoblast-based therapy to the heart with enhanced therapeutic effects.</a> International Journal of Cardiology. 168 (1), 261-269 (2013).</li>
<li>Narita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Use+of+Scaffold-free+Cell+Sheet+Technique+to+Refine+Mesenchymal+Stromal+Cell-based+Therapy+for+Heart+Failure%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">The Use of Scaffold-free Cell Sheet Technique to Refine Mesenchymal Stromal Cell-based Therapy for Heart Failure.</a> Molecular Therapy. 21 (4), 860-867 (2013).</li>
<li>Matsuo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiently+Piled-Up+Cardiac+Tissue-Like+Sheets+With+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cells+Robustly+Promotes+Cell+Engraftment+and+Ameliorates+Cardiac+Dysfunction+After+Myocardial+Infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Efficiently Piled-Up Cardiac Tissue-Like Sheets With Pluripotent Stem Cell-Derived Cells Robustly Promotes Cell Engraftment and Ameliorates Cardiac Dysfunction After Myocardial Infarction.</a> Circulation. 128 (22), (2013).</li>
<li>Alshammary, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+cardiac+stem+cell+sheet+transplantation+on+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery+Today%22%5BJournal%5D)">Impact of cardiac stem cell sheet transplantation on myocardial infarction.</a> Surgery Today. 43 (9), 970-976 (2013).</li>
<li>Chen, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+a+novel+PLGA+fiber%2Fcollagen+composite+web+as+a+scaffold+for+engineering+of+articular+cartilage+tissue+with+adjustable+thickness%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">The use of a novel PLGA fiber/collagen composite web as a scaffold for engineering of articular cartilage tissue with adjustable thickness.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 67a (4), 1170-1180 (2003).</li>
<li>Cerqueira, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Adipose+Stem+Cells+Cell+Sheet+Constructs+Impact+Epidermal+Morphogenesis+in+Full-Thickness+Excisional+Wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Human Adipose Stem Cells Cell Sheet Constructs Impact Epidermal Morphogenesis in Full-Thickness Excisional Wounds.</a> Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).</li>
<li>Sasagawa, T., Shimizu, T., Sekiya, S., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+angiogenic+potential+between+prevascular+and+non-prevascular+layered+adipose-derived+stem+cell-sheets+in+early+post-transplanted+period%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Comparison of angiogenic potential between prevascular and non-prevascular layered adipose-derived stem cell-sheets in early post-transplanted period.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (2), 358-365 (2014).</li>
<li>Ishii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayered+adipose-derived+regenerative+cell+sheets+created+by+a+novel+magnetite+tissue+engineering+method+for+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Multilayered adipose-derived regenerative cell sheets created by a novel magnetite tissue engineering method for myocardial infarction.</a> International Journal of Cardiology. 175 (3), 545-553 (2014).</li>
<li>Godier-Furnemont, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composite+scaffold+provides+a+cell+delivery+platform+for+cardiovascular+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+nanofibrous+sheets+of+collagen%2Felastin%2Fpolycaprolactone+improve+cardiac+repair+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Electrospun nanofibrous sheets of collagen/elastin/polycaprolactone improve cardiac repair after myocardial infarction.</a> American Journal of Translational Research. 8 (4), 1678-1694 (2016).</li>
<li>Arana, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardial+delivery+of+collagen+patches+with+adipose-derived+stem+cells+in+rat+and+minipig+models+of+chronic+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Epicardial delivery of collagen patches with adipose-derived stem cells in rat and minipig models of chronic myocardial infarction.</a> Biomaterials. 35 (1), 143-151 (2014).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+high+bioactivity+multilayered+bone-marrow+mesenchymal+stem+cell+sheets+for+myocardial+infarction+using+a+3D-dynamic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Preparation of high bioactivity multilayered bone-marrow mesenchymal stem cell sheets for myocardial infarction using a 3D-dynamic system.</a> Acta Biomaterialia. 72, 182-195 (2018).</li>
<li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+phospholipase+A%282%29+to+prepare+acellular+porcine+corneal+stroma+as+a+tissue+engineering+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of phospholipase A(2) to prepare acellular porcine corneal stroma as a tissue engineering scaffold.</a> Biomaterials. 30 (21), 3513-3522 (2009).</li>
<li>Degano, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+self-assembling+peptide+nanofiber+scaffolds+on+mouse+embryonic+fibroblast+implantation+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of self-assembling peptide nanofiber scaffolds on mouse embryonic fibroblast implantation and proliferation.</a> Biomaterials. 30 (6), 1156-1165 (2009).</li>
<li>Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+stem+cell+niches+from+the+molecule+up+through+engineered+peptide+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Building stem cell niches from the molecule up through engineered peptide materials.</a> Neuroscience Letters. 519 (2), 138-146 (2012).</li>
<li>Cui, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+Mesenchymal+Stem+Cells+with+Self-Assembling+Polypeptide+Scaffolds+Is+Conducive+to+Treating+Myocardial+Infarction+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Tohoku+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Transplantation of Mesenchymal Stem Cells with Self-Assembling Polypeptide Scaffolds Is Conducive to Treating Myocardial Infarction in Rats.</a> Tohoku Journal of Experimental Medicine. 222 (4), 281-289 (2010).</li>
<li>Jun, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+Assembled+Bilayer+Cell+Sheets+of+Stem+Cells+and+Endothelial+Cells+Using+Thermosensitive+Hydrogels+for+Therapeutic+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Spatially Assembled Bilayer Cell Sheets of Stem Cells and Endothelial Cells Using Thermosensitive Hydrogels for Therapeutic Angiogenesis.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (9), (2017).</li>
<li>Chen, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porous+tissue+grafts+sandwiched+with+multilayered+mesenchymal+stromal+cell+sheets+induce+tissue+regeneration+for+cardiac+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Porous tissue grafts sandwiched with multilayered mesenchymal stromal cell sheets induce tissue regeneration for cardiac repair.</a> Cardiovascular Research. 80 (1), 88-95 (2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il presente protocollo segnala un metodo efficiente per la costruzione di un foglio multistrato di MSC. Questo strato di cellule presenta resistenza meccanica ottima, cell ad alta densità di semina e bioattività favorevole sulle cellule staminali. Utilizzando BMSCs come esempio, la struttura cellulare 3D rapidamente costruita con RAD16-io del peptide idrogel. Dopo in coltura nel sistema dinamico di aspersione, il foglio BMSC multistrato è ottenuto con successo e le BMSC mantenere un'alta espressione di marcatori di cellu...

Terapia con cellule staminali è stata segnalata come un efficace trattamento per molte malattie; Tuttavia, cella bassa ritenzione e scarsa sopravvivenza all'interno della zona di destinazione rimangono questioni critiche dopo l'iniezione di cellule staminali tradizionale. Per risolvere questo problema, tessuto ingegneria gli scienziati hanno sviluppato la tecnica del foglio di cella. Un foglio monostrato cellulare con intatto della matrice extracellulare in primo luogo è stato preparato utilizzando la risposta di temperatura cultura piatto1e relativi studi di follow-up segnalato i miglioramenti significativi di conservazione delle cellule staminali e la sopravvivenza all'interno il colpito da infarto zona2,3. Tra i metodi, costruendo il foglio di celle multistrato è stata segnalata come una strategia efficace per migliorare la sopravvivenza delle cellule e la cella foglio effetto terapeutico3,4. Da allora, gli scienziati hanno lavorato sullo sviluppo di metodi di costruzione del foglio differenti delle cellule al fine di aumentare la quantità di cellule, cellule staminali proprietà e proprietà meccaniche dei fogli delle cellule. Finora, alcuni tipi di strato delle cellule sono stati costruiti e studiati nel trattamento di infarto miocardico5, cartilagine ferita6, e la pelle ferita7.
La bioattività delle cellule staminali prima di trapianto ha mostrato un'influenza emergente sulla rigenerazione del tessuto danneggiato e cellula diverse strategie di costruzione di foglio hanno effetti diversi sulle cellule staminali. Da un lato, strati delle cellule confluenti consistevano soltanto di cellule staminali ad alta densità e matrici extracellulari naturale potrebbero essere acquistati da impilamento monostrato cellulare fogli8 o utilizzando tessuto magnetico Ingegneria tecniche9. D'altra parte, i ricercatori hanno sviluppato diverse impalcature per fornire un'adeguata resistenza meccanica e supporto delle cellule crescita10,11,12, che ha permesso una cellula staminale bassa densità per garantire la nutrizione di semina fornitura. Tuttavia, nonostante questi approcci, la fornitura di basso efficiente nutrizione all'interno della struttura di strato di celle multistrato rimane delle principali preoccupazioni durante la costruzione in vitro . Di conseguenza, un sistema di costruzione del foglio delle cellule efficiente e fattibile è urgentemente necessario.
Questo protocollo descrive i passaggi per preparare un foglio di cellula staminale (MSC) multilayeredmesenchymal. In questo sistema di costruzione, la resistenza meccanica del foglio di cella è fornita da un DPP. Basato su questa impalcatura, struttura cellulare 3D può essere rapidamente costruita con RAD16-io idrogel peptidici e un sistema di perfusione dinamica viene utilizzata per il foglio di celle multistrato, al fine di stabilizzare la struttura del foglio di cella 3D e fornire sufficiente nutrizione della coltura approvvigionamento per le cellule. Utilizzando questo sistema, un foglio BMSC multistrato è stato preparato correttamente e ha esibito un effetto terapeutico ottimale il ratto infarto miocardico modello13.

<table><tbody><tr><td>Fosfolipasi A2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6534</td><td></td></tr><tr><td>Sodio desossicolato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tampone fosfato</td><td>Gibco BRL</td><td>89033</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina streptomicina / amfotericina</td><td>Gibco BRL</td><td>15640055</td><td></td></tr><tr><td>Buffer bicarbonato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3041</td><td></td></tr><tr><td>Concentratore da tavolo</td><td>Changzhou Aohua Instrument Co.</td><td></td><td></td>KT20183</tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-014-CVR</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino sudamericano&nbsp;</td><td>Gibco BRL</td><td>10270-106 / P30-3302</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina / 2,21 mM EDTA</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Armadio di biosicurezza</td><td>Esco, Singapore</td><td>AC2-2S1</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore a temperatura costante...</td><td>Esco,Singapore</td><td>CLS-170B-8</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>Tubo EP</td><td>Axygen</td><td>31617934</td><td></td></tr><tr><td>Macchina centrifuga</td><td>TOMOS</td><td>1-16R&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pura Matrix&nbsp;</td><td>BD</td><td>354250</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di coltura a perfusione dinamica</td><td>Minucells e Minutissue</td><td>D-93077</td><td></td></tr><tr><td>Pompa peristaltica</td><td>Ismatec</td><td>IPC N8</td><td></td></tr><tr><td>Tubo pompa</td><td>Ismatec</td><td>Nr.1306</td><td></td></tr><tr><td>MINUSHEET 1300&nbsp;</td><td>Componenti del supporto tissutale</td> <td>di Ratisbona</td><td></td>&nbsp;</tr><tr>Sistema di perfusione dinamica <td>MINUSHEET</td><td>Regensburg</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MINUSHEET 0006</td><td>Apparecchiature per lo scambio di gas di</td> <td>Ratisbona</td><td></td>&nbsp;</tr><tr><td>MINUSHEET 0002</td> Bottiglia di vetro <td>Regensburg</td><td></td><td>da 500 mL</td></tr><tr><td>Contenitore per colture di perfusione MINUSHEET 1301</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

costruzione di un foglio di multistrato delle cellule staminali mesenchimali con un sistema di cultura dinamica 3d

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Terapia della cellula formativa Mostra un promettente futuro nella rigenerazione di tessuti e organo danneggiato, e la tecnica di foglio di cella è stata sviluppata per migliorare la conservazione delle cellule basse e scarsa sopravvivenza all'interno della zona di destinazione. Tuttavia, durante il processo di costruzione di in vitro , è urgente una soluzione per il mantenimento delle cellule staminali bioattività e aumentando la quantità di cellule all'interno del foglio di cella. Qui, questo protocollo presenta un metodo per la costruzione di un foglio di celle multistrato con cellule staminali favorevole bioattività e un'operatività ottima. Pericardio porcino decellularizzato (DPP) è preparato dalla fosfolipasi un metodo di decellularizzazione2 (PLA2) come l'impalcatura di strato delle cellule e cellule staminali mesenchimali di ratto del midollo osseo (BMSC) sono isolate e ampliate come cellule del seminato. La struttura del foglio temporaneo celle multistrato è costruita usando RAD16-ho peptide idrogel. Infine, strato di cellule è coltivato con un sistema di perfusione dinamica per stabilizzare la struttura tridimensionale (3D) e strato di cellule poteva essere ottenuto seguendo una 48 ore di coltura in vitro. Questo protocollo fornisce un metodo efficiente e fattibile per la costruzione di un foglio di multistrato sulle cellule staminali, e strato di cellule potrebbe essere sviluppato come un prodotto di terapia della cellula formativa favorevole in futuro.

Lo schema della costruzione foglio multistrato sulle cellule staminali è illustrato nella Figura 1. Preparando il patibolo di foglio di cella dal metodo di decellularizzazione di PLA2 è il primo passo. Basato sul patibolo, una struttura temporanea delle cellule 3D è costruita mescolando le cellule staminali con l'idrogel di peptide RAD16-1. Al fine di ottenere un foglio di celle multistrato con cellule staminali favorevole bioattività e ottima resi...

Questo articolo fornisce un metodo efficiente e fattibile per la costruzione di fogli multistrato sulle cellule staminali con proprietà favorevoli della cellula formativa.

Costruzione di un foglio di multistrato delle cellule staminali mesenchimali con un sistema di cultura dinamica 3D

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

La terapia con cellule staminali è stata ampiamente segnalata come un trattamento promettente per molte malattie. E le tecniche delle schede cellulari sono state sviluppate per migliorare la ritenzione della cellula e la sopravvivenza anche all'interno degli obiettivi. Durante la costruzione dei fogli cellulari, l'insufficiente apporto nutrizionale rimane un problema chiave per la perdita della funzione delle cellule staminali ed è una proprietà insoddisfacente delle cellule staminali che finalmente in effettirebbe gli effetti terapeutici in vivo.Il nostro scopo di preparare il prodotto disponibile in lamiera di cellule staminali multistrato, il nostro team ha sviluppato l'impalcatura a pali, pericardio e lamiera cellulare cellularizzata. Sulla base dell'impalcatura, l'avviamento delle cellule multistrato sarebbe rapidamente costruito con idrogeno nonapeptide e viene utilizzato un sistema di perfusione dinamica per garantire l'alimentazione della cellula staminale in vitro. Eseni un'impalcatura DBP essiccata e mettila al centro della base nera.Mettere un anello di tensione bianco sull'impalcatura DBP e apporrlo nel portapassutale. Assicurarsi che l'impalcatura DBP sia totalmente fissata nel portapassutale. Aggiungere 100 mezzi di coltura di microlitri sull'impalcatura DBP.Mettere l'impalcatura nell'incubatore di 37 gradi Celsius e lasciare in ammollo per 15 minuti. Togliere le cellule dall'incubatrice, rimuovere i mezzi di coltura dal piatto di coltura, lavare delicatamente le cellule con due millilitri di PBS caldo. Rimuovere tutto il PBS dal piatto di coltura e assicurarsi che non rimanga liquido.Aggiungere due millilitri alla soluzione di tripside all'1,25% al piatto e incubare le cellule per tre minuti. Interrompere l'effetto tripina aggiungendo due mezzi di coltura millilitri. Lavare delicatamente le cellule dal piatto.Trasferire le sospensioni cellulari in un nuovo tubo centrifugo da 15 millilitri. Centrifugate le cellule a 220 volte la gravità per cinque minuti, e ottenete sedimenti cellulari. Rimuovere il supernatante e spazzare via il sedimento cellulare.Sospendere di nuovo le cellule con una soluzione di saccarosio al 10% da tre millilitri. Aspira la sospensione cellulare di 10 microlitri e il numero di cella del contenuto legge un emocitometro, estrae tre milioni di cellule e trasferisce nel nuovo tubo centrifugo da 1,5 millilitri. Centrifugare le cellule a 220 volte la radice quadrata per cinque minuti, rimuovere completamente i supernatanti e ottenere il sedimento cellulare.Preparare 20 microlitri soluzione di saccarosio al 10%. Sospendere delicatamente le cellule e ottenere una sospensione uniforme. Aggiungere 20 microliter peptide hydro gel nella parte superiore della sospensione mescolare delicatamente il peptide hydro gel, e le cellule sospensione con la T, esettare l'impalcatura DBP, lasciando il portapatico, quindi aspirare delicatamente la mediana dei calcoli con una T.Aspirare la miscela la miscela e aggiungere uniformemente all'impalcatura DBP.Aggiungere un millilitro calciedetato sul fondo del portavimenta. Aggiungere delicatamente quattro millilitri nel piatto di coltura e quindi emergere il foglio cellulare. Metti le cellule nell'incubatrice per due ore lasciache la coltura.Il sistema dinamico di perfusione comprende un contenitore di coltura perfusione che scambia gas e una bottiglia di vetro. Gli assemblamenti sono sistemi di perfusione dinamici come mostrato nella figura. Aggiungere due mezzine di coltura idro millilitri nella bottiglia di vetro.Inserire il foglio cellulare nella camera del contenitore di coltura, aggiungere tre mediane di coltura millilitri nel contenitore, inserire i sistemi di perfusione dinamica negli incubatori e iniziare a pompare. Aprire il contenitore delle impostazioni cultura nel reclinato bipositivo. Estraete il foglio cellulare dal contenitore della coltura e mettetelo nel piatto della coltura.Utilizzare una forza per immobilizzare il porta tessuto e utilizzare altre due forcep per separare l'anello di tensione bianco dalla base nera. Infine, ottenere il foglio cellulare multistrato. L'impalcatura DBP è trasparente.Le rivendite SEM mostrano che i college catturati e i componenti sono completamente riservati. I fogli cellulari possono essere ottenuti e tenuti da forcep per una breve conservazione. Questi fogli cellulari potrebbero essere trasferiti in un tubo cilindriforme da 1,5 millilitri.Come modello ad esempio a partire dalle dimostrazione cellulari di BMFC altamente positivo per il marcatore delle cellule staminali CD 9O e CD 29. Dopo la costruzione della cella, il BMFC'S che esce dal foglio cellulare rimane ad alti livelli di espansione del CD 90 e del CD 29. La costruzione della struttura cellulare a più tipi è il passaggio critico del protocollo.Il tempo di pan richiede quattro gel idro quando il valore ph cambia da SA a neutro, quindi, è importante lavare la cella con soluzione di saccarosio per rimuovere gli ioni superficiali. Inoltre, il rapporto volume della sospensione cellulare e del panthihydrogel non è un buon amico per la costruzione della struttura temporanea multistrato. Dopo la formazione della struttura delle cellule staminali 3D, vedrai che il sistema di perfusione dinamica è importante per stabilizzare la struttura multistrato e mantenere le viabilità delle cellule staminali.L'infiltrazione dinamica della mediana di coltura potrebbe facilitare le cellule staminali a proliferare ed estrapolare il contesto cellulare all'interno della struttura multistrato anche i termometri a coltura dinamica dovrebbero essere regolati in base ai diversi tipi di cellule staminali.

construction-multilayered-mesenchymal-stem-cell-sheet-with-3d-dynamic

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

In questo protocollo, dimostriamo la realizzazione di una serie di messaggi microattuatore verticalmente sfollati su cui si basa la tecnologia, e come questa tecnologia di base può essere modificato per condurre high-throughput di coltura cellulare meccanicamente dinamica sia la cultura bidimensionale e tridimensionale paradigmi.

Piattaforme microfabbricazione per coltura cellulare meccanicamente dinamica

Questo video mostra lo sviluppo e la differenziazione delle cellule staminali neurali umane all'interno di un'impalcatura tridimensionale. Un rivestimento di laminina sull'impalcatura favorisce l'adesione cellulare, mentre un mezzo neurale privo di fattore di crescita induce la differenziazione cellulare in cellule progenitrici neurali, che estendono i loro processi all'interno di un'architettura porosa in più direzioni, formando una coltura...

Differenziazione delle cellule staminali neuronali umane in colture 3D utilizzando un'impalcatura porosa

Per la creazione di strutture altamente organizzate di tessuti complessi, è necessario assemblare più materiali e tipi di cellule in un composito integrato.  Questo design combinatorio incorpora fogli cellulari stratificati specifici per organo con due materiali distinti di derivazione biologica contenenti una forte base di matrice fibrosa e cellule endoteliali per migliorare la formazione di nuovi vasi.

Ingegneria dei tessuti: Costruzione di un multicellulare 3D Ponteggio per la consegna di Layered fogli Cellulari

Descriviamo la fabbricazione di fogli di idrogel micromodellati utilizzando un processo semplice, che può essere assemblato e manipolato in una forma indipendente. Utilizzando questi fogli modulari di idrogel, è possibile generare un semplice sistema di coltura cellulare 3D su macroscala con un microambiente cellulare controllato.

Costruzione di fogli modulare idrogel per micropatterned macro-scala 3D Cellular Architettura

L'ingegneria e l'analisi di tessuti portanti con popolazioni cellulari eterogenee sono ancora una sfida. Qui, descriviamo un metodo per la creazione di dischi di idrogel di alginato a doppio strato come piattaforma per la co-coltura di diverse popolazioni cellulari all'interno di un unico costrutto.

Layered alginato costrutti: Una piattaforma per la cooperazione culturale delle popolazioni cellulari eterogenee

Condrogenesi da cellule staminali richiede la messa a punto delle condizioni di coltura. Qui vi presentiamo un approccio magnetico per condensare le cellule, un passo essenziale per iniziare condrogenesi. Inoltre, mostriamo che la maturazione dinamico in un bioreattore applica stimolazione meccanica ai costrutti cellulari e aumenta la produzione di matrice extracellulare cartilaginea.

3D Stem magnetica cellulare Aggregazione e bioreattore maturazione per la cartilagine Regeneration

Qui, presentiamo un protocollo per ottenere sistemi 3D-cultura in auto-assemblanti peptide impalcature per promuovere la differenziazione dei chondrocytes articolari umani dedifferentiated in cartilagine-come il tessuto.

Coltura di cellule di mammifero in scaffold tridimensionale Peptide

Descriviamo un metodo per costruire dispositivi per la cultura 3D e la sperimentazione con cellule e organoidi multicellulari. Questo dispositivo consente l'analisi delle risposte cellulari ai segnali solubili in microambienti 3D con gradienti chemioattrattante definiti. Gli organoidi sono meglio di cellule singole al rilevamento di ingressi rumorosi deboli.

Analisi 3D delle risposte multi-cellulari ai gradienti chemoattractant

Qui, dimostriamo un modello di organoide in tre fasi (espansione bidimensionale [2D], stimolazione 2D, maturazione tridimensionale [3D]) che offre uno strumento promettente per la ricerca fondamentale sui tendini e un potenziale metodo senza scaffold per l'ingegneria tissutale tendinea.

Dimostrazione della coltura di fogli cellulari autoassemblati e generazione manuale di un organoide 3D simile a tendine/legamento mediante l'utilizzo di fibroblasti dermici umani

Qui, dimostriamo come le cellule epiteliali coltivate con fibroblasti nel sistema a due strati basato su membrana nanofibrosa possano aderire e crescere stabilmente sulla membrana.

Definizione di un modulo di cocoltura tridimensionale di cellule epiteliali utilizzando membrane nanofibrose

Impara a costruire fogli cellulari multistrato di cellule staminali mesenchimali con un sistema di perfusione dinamica 3D. Questo metodo migliora l'apporto nutrizionale in vitro e preserva le proprietà staminali per terapie rigenerative efficaci.

Costruzione di un foglio di multistrato delle cellule staminali mesenchimali con un sistema di cultura dinamica 3D

Esplora altri video